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苹果茎沟病毒单克隆抗体的制备与应用

苹果茎沟病毒单克隆抗体的制备与应用

作者：吴晓雁华中农业大学

学位级别：硕士

苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus, ASGV)为梨和苹果的重要病毒病之一,对果树产量和果品质量产生严重影响,进而造成经济损失。为了构建一套快速、灵敏的ASGV检测方法,本研究制备了抗ASGV的单克隆抗体,并应用于田间样品的ASGV检测... 详细信息

苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus, ASGV)为梨和苹果的重要病毒病之一,对果树产量和果品质量产生严重影响,进而造成经济损失。为了构建一套快速、灵敏的ASGV检测方法,本研究制备了抗ASGV的单克隆抗体,并应用于田间样品的ASGV检测,为快该病毒的速检测提供了有效制剂。取得的研究结果如下：1.本研究以仅带有ASGV的砂梨“黄花”离体植株为毒源材料,通过汁液摩擦方法接种到西方烟(Nicotiana occidentalis)和昆诺藜(Chenopodium quinoa),约7d后在昆诺藜上表现为系统的褪绿斑驳和褪绿斑点,在西方烟上表现为系统的褪绿斑和坏死。以接种发病的昆诺藜为毒源,昆诺藜为繁殖寄主,进行大量转接,繁殖病毒。2.通过差速离心和蔗糖密度梯度离心的方法从100g昆诺藜叶片中获得1mL浓度约为4.29mg/mL的病毒提纯液,并通过SDS-PAGE、Western blot和RT-PCR方法验证病毒提纯液中含有ASGV。3.用ASGV病毒提纯液通过皮下注射免疫BALB/C小鼠,取得的脾细胞与SP2/0鼠骨髓瘤细胞融合,用原核表达的ASGV CP蛋白筛选阳性克隆,得到2株稳定传代且分泌抗ASGV单克隆抗体的杂交瘤细胞。通过ID-elisa检测,两株腹水抗体的效价均为1：25600;Western blot分析表明,两株单克隆抗体特异性较强,仅与ASGV的CP有特异反应;用于检测原核表达的ASGV CP时,杂交瘤细胞株2C3和1F10细胞株制备腹水抗体的检测灵敏度分别为28ng/mL和2.8ng/mL4.利用制备的单克隆抗体,采用tas-elisa法对49份梨和苹果样品进行ASGV检测,发现有29份样品呈阳性,阳性率达60%,与RT-PCR检测比较,其检测结果基本一致,仅有一份样品RT-PCR检测为阳性,而tas-elisa检测结果为阴性。

关键词：梨苹果茎沟病毒病毒提纯单克隆抗体原核表达 tas-elisa

柑橘衰退病毒和柑橘黄化脉明病毒单克隆抗体的制备及其应用

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柑橘衰退病毒和柑橘黄化脉明病毒单克隆抗体的制备及其应用

作者：刘震浙江大学

学位级别：硕士

每年柑橘病毒病害都会对世界柑橘生产造成严重的经济损失。由柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus, CTV)引起的柑橘衰退病和由柑橘黄化脉明病毒(Citrus yellow vein clearing virus, CYVCV)引起的柑橘黄化脉明病是目前危害柑橘的两种重... 详细信息

每年柑橘病毒病害都会对世界柑橘生产造成严重的经济损失。由柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus, CTV)引起的柑橘衰退病和由柑橘黄化脉明病毒(Citrus yellow vein clearing virus, CYVCV)引起的柑橘黄化脉明病是目前危害柑橘的两种重要病毒病害。为了掌握这两种病毒病在我国的发生流行规律,进而建立科学防控体系,急需建立对两种病毒的快速、有效的检测方法。而血清学检测方法操作简单、特异性好、灵敏度高,且适合大规模样品检测,因此被广泛应用于植物病毒的诊断、流行规律分析、抗病育种和科学防控等方面。为此,本论文分别制备了CTV和CYVCV的特异、灵敏的单克隆抗体,并以其为核心分别建立了检测这两种病毒的特异、灵敏的血清学方法,从而为这两种病毒病的诊断、流行病学分析和科学防控体系建立提供物质和技术支撑。(1)CTV单抗的制备及其检测应用：CTV重庆分离物的外壳蛋白基因(CP)用原核表达载体pET-28a在大肠杆菌进行表达,表达的重组蛋白通过Ni2+-NTA胶纯化后作为抗原免疫BALB/c小鼠,经细胞融合、筛选和克隆获得4株分泌抗CTV单抗的杂交瘤细胞株系(14B10、14H11、20D5和20G12)。间接elisa方法测得4株单抗腹水的效价在10-6-10-7之间,Western blot分析显示,4株单抗均能与CTV的CP发生特异性的免疫反应。以单抗为核心建立检测CTV的dot-elisa、Tissue blot-elisa、tas-elisa三种检测CTV的血清学方法,其中dot-elisa和tas-elisa可以检测感染CTV病叶粗提液的灵敏度分别达到1：2560和1：10240倍稀释(w/v, g/ml)。此外,利用制备的单抗研制出了检测CTV的胶体金免疫试纸条,其检测病叶的灵敏度达到1：1280倍稀释,从而实现CTV检测的田头化、快速化、傻瓜化。tas-elisa检测灵敏度最高,可以很好地应用于脱毒树苗的检测。田间调查显示,CTV在我国重庆市、江西省和浙江省柑橘产区发生普遍,且血清学方法的检测结果与RT-PCR检测结果的符合率达到99.5%以上。CTV单抗的制备及其灵敏、特异的血清学检测方法的建立对我国CTV的检测和防控具有重大作用。(2) CYVCV单抗的制备及其检测应用：为了诊断、流行病学分析和控制CYVCV病害,本论文以原核表达的CYVCV外壳蛋白作为抗原免疫小鼠和兔子,分别制备了4株抗CYVCV的特异、灵敏的单抗和兔多抗。4株单抗腹水的间接elisa效价在10-6-10-7之间,单抗均能特异性地与CYVCV CP蛋白和CYVCV感染的柑橘叶片粗提液反应。以单抗为核心建立检测CYVCV的dot-elisa、Tissue blot-elisa、DAS-elisa、tas-elisa四种血清学方法,其中dot-elisa、DAS-elisa和tas-elisa检测CYVCV病叶的灵敏度分别达到1：2560、1：10240和1：20480倍稀释(w/v, g/ml)。用建立的血清学方法分析了来自我国重庆市、云南省果园125份疑似病毒病样品,检测结果发现,其中46个样品感染CYVCV,发病率达到36.8%,然而在浙江和江西省158个样品中未检测到该病毒,且血清学方法的检测结果与RT-PCR检测结果的符合率达到99.6%以上。这四种血清学方法对我国CYVCV的诊断和检测、流行病学调查、脱毒苗的生产和防控具有重要意义。

关键词：柑橘衰退病毒柑橘黄化脉明病毒单克隆抗体 dot-elisa Tissue blot-elisa DAS-LISA tas-elisa

柑橘碎叶病毒和香蕉束顶病毒单克隆抗体的制备及其检测应用

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柑橘碎叶病毒和香蕉束顶病毒单克隆抗体的制备及其检测应用

作者：宋西娇浙江大学

学位级别：硕士

制备重要植物病毒的特异性抗体、建立相应的血清学检测方法对植物病毒的检测及其口岸检验检疫和科学防治具有重要意义。柑橘碎叶病毒(Citrus Tatter Leaf Virus, CTLV)为我国继柑橘衰退病和裂皮病之后的一种重要的柑橘病毒病之一,而香... 详细信息

制备重要植物病毒的特异性抗体、建立相应的血清学检测方法对植物病毒的检测及其口岸检验检疫和科学防治具有重要意义。柑橘碎叶病毒(Citrus Tatter Leaf Virus, CTLV)为我国继柑橘衰退病和裂皮病之后的一种重要的柑橘病毒病之一,而香蕉束顶病毒(Banana Bunchy Top Virus, BBTV)引起的香蕉束顶病是香蕉上的重要病害,其威胁着包括亚洲、非洲、南太平洋地区约占世界四分之一香蕉的生产。本论文分别制备了抗CTLV和BBTV的特异性单克隆抗体(monoclonal antibodies, MAbs),并建立了相应的的血清学检测方法。(1)抗CTLV单克隆抗体制备及其检测应用：用PCR方法从感染CTLV的柑橘基因组中克隆了该病毒的外壳蛋白(Coat protein, CP)基因,将其插入到原核表达载体PET-28a中构建成重组原核表达载体。重组表达载体PET-28a-CP转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,Ni+-NTA亲和柱纯化获得分子量约为30kDa的融合蛋白。以纯化的重组蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,获得3株能稳定传代并分泌抗CTLV的单克隆抗体杂交瘤细胞。分泌的单抗特异性检测表明3株单抗能特异性识另JCTLV。利用3株单抗建立了检测CTLV的dot-elisa方法,该方法检测病叶的灵敏度可达1:640(w/v, g/mL)。(2)抗BBTV单抗制备及其检测应用：将经BBTV病毒粒子免疫的BALB/c小鼠的脾细胞与SP2/0鼠骨髓瘤细胞融合,经细胞筛选与克隆,获得1株能稳定传代并分泌抗BBTV单克隆抗体的杂交瘤细胞22E3,并制备其单抗腹水。该单抗可以特异性地与BBTV反应,利用单抗为核心建立了检钡BBTV的抗原包被间接elisa方法(antigen-coated plate enzyme-linked immunosorbent assay, ACP-elisa)和免疫斑点法(dot-elisa).建立的dot-elisa方法检测感染的香蕉植株组织的灵敏度达1:320(w/v, g/mL)

关键词：柑橘碎叶病毒香蕉束顶病毒原核表达抗体单克隆抗体 tas-elisa dot--elisa

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烟草种传烟草花叶病毒（TMV）的初步研究

烟草种传烟草花叶病毒（TMV）的初步研究

作者：杨松浙江大学

学位级别：硕士

烟草花叶病是世界上危害烟草最常见的病害之一,发病田块可减产30-50%,导致重大的经济损失。漂浮育苗中,若种子带毒,则易于烟草花叶病毒病的流行,为此对烟草病株种子带毒情况和带毒种子消毒方法进行了研究。本研究采用tas-elisa方... 详细信息

烟草花叶病是世界上危害烟草最常见的病害之一,发病田块可减产30-50%,导致重大的经济损失。漂浮育苗中,若种子带毒,则易于烟草花叶病毒病的流行,为此对烟草病株种子带毒情况和带毒种子消毒方法进行了研究。本研究采用tas-elisa方法对烟草种传TMV作一些初步研究。根据已采收的不同品种的烟草种子,采用tas-elisa进行检测,检测出2561、2562、2563、2567、2569共五个品种的烟草种子带有TMV。用tas-elisa对各种子的灵敏度检测表明,tas-elisa对带毒种子检测率相当高,检测3粒种子时有100%的检测率。带毒烟草种子的生长发芽实验表明,烟草种子带毒对烟草种子发芽率有一定影响,而对各发芽种子的种皮、芽与全苗进行检测得出,烟草花叶病毒在烟草种子上的侵染部位是种皮。选用K326、云烟85和云烟87的无病毒苗,在其团棵期、旺长期和现蕾期分别接种烟草花叶病毒,从检测结果可知,不同时期接种TMV,其种子带毒率存在差异,其中以旺长期接种种子带毒率最高。再对K326三个不同接种时期的花萼、花冠、子房、雄蕊和雌蕊取样检测,表明病毒含量最高的是花冠,而旺长期接种的花器不同部位的带毒量比另二个接种时期的对应部位都要高。同时,对K326的带毒种子采用不同消毒剂处理,分别采用10%的NaPO、0.1%的KMnO、0.1%的CuSO、1:400倍的抗毒丰、1:600倍的毒消、5%的洗衣粉、清水共7种消毒剂处理,结果表明,10%的NaPO在防治种传TMV上效果最明显。

关键词：烟草花叶病毒种传 tas-elisa

烟草不同时期接种烟草花叶病毒后的种子带毒率比较

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浙江农业科学 2005年第5期46卷 409-410页

作者：杨松刘勇周雪平浙江大学生物技术研究所浙江杭州310029 云南省烟草科学研究所云南玉溪653100

烟草种子带毒一直对烟草生产危害较大。烟草品种K326、云烟85和云烟87在不同时期分别接种烟草花叶病毒(TMV)后收集烟株种子,采用三抗体夹心法(taselisa)检测TMV带毒情况,结果表明,接种TMV后病株上采收的种子的平均带毒率超过50%,但不同... 详细信息

烟草种子带毒一直对烟草生产危害较大。烟草品种K326、云烟85和云烟87在不同时期分别接种烟草花叶病毒(TMV)后收集烟株种子,采用三抗体夹心法(taselisa)检测TMV带毒情况,结果表明,接种TMV后病株上采收的种子的平均带毒率超过50%,但不同时期接种和不同品种间烟草种子带毒率存在明显差异。

关键词：烟草种子烟草花叶病毒 tas-elisa

不同抗性青稞品种接种BYDV-GAV后病毒含量的变化研究

维普期刊数据库

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西藏农业科技 2020年第4期42卷 30-33页

作者：旺姆杨春葆徐齐君扎桑羊海珍省部共建青稞和牦牛种质资源与遗传改良国家重点实验室/西藏自治区农牧科学院农业研究所西藏拉萨850032

本研究以抗黄矮病青稞品系C280和感病品种康青3号为供试材料,人工接种BYDV-GAV病毒,采用tas-elisa方法,监测供试材料叶片和根系中的病毒含量的动态变化。研究结果表明,抗、感病材料叶片和根系中的BYDV-GAV含量均呈现出先上升后下降的变... 详细信息

本研究以抗黄矮病青稞品系C280和感病品种康青3号为供试材料,人工接种BYDV-GAV病毒,采用tas-elisa方法,监测供试材料叶片和根系中的病毒含量的动态变化。研究结果表明,抗、感病材料叶片和根系中的BYDV-GAV含量均呈现出先上升后下降的变化趋势;病毒首先在新叶中被检测到,之后移动到根系中。接种10-30 d,抗病品系C280根系中的病毒含量明显低于感病品种康青3号;在测定时间内,抗、感病品种叶片中的病毒含量无明显差异。以上结果为进一步探索青稞黄矮病侵染机制和抗病机制提供依据。

关键词：大麦黄矮病毒青稞 tas-elisa 病毒含量品种抗性

浙江雪菜花叶病病原鉴定及雪菜品种的抗病性测定

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浙江雪菜花叶病病原鉴定及雪菜品种的抗病性测定

2005年华东植物病理学术研讨会

作者：施曼玲周雪平浙江大学生物技术研究所

从浙江宁波雪菜上获得97株呈花叶症状的病毒样品,三抗体夹心(tas) elisa检测表明97株雪菜花叶样本均检测到芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus, TuMV),所有的样本都没有检测到黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV) 和烟草花叶病毒(To... 详细信息

从浙江宁波雪菜上获得97株呈花叶症状的病毒样品,三抗体夹心(tas) elisa检测表明97株雪菜花叶样本均检测到芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus, TuMV),所有的样本都没有检测到黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV) 和烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV);利用免疫捕捉反转录 PCR (IC-RT-PCR)对部分TuMV样本中的CP和HC-Pro基因进行了扩增,所有样品都得到约0．8 kb和1．4 kb的两条特异条带,因此浙江宁波雪菜花叶病的主要病原是 TuMV。对53个雪菜栽培品种在温室和大田进行了人工接种,共鉴定出抗病品种7 个,耐病品种22个,感病品种24个,朱发现高抗品种。总的来说,细叶型品种比花叶型和板叶型品种抗病。利用tas-elisa方法对接种的53个雪菜品种中的 TuMV浓度进行测定,在接种后10d、15d、20d和30d,TuMV检出率分别为45．28％、 90．57％、100％和100％,大多数雪菜tas-elisa OD405值随接种后天数的增加而呈上升趋势,说明TuMV可以在雪菜抗性品种内繁殖,抗性品种的抗性主要表现为耐病。

关键词：芜菁花叶病毒雪菜 tas-elisa HC-Pro基因 CP基因抗性

来源： cnki会议评论

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新型实用植物病毒检测试剂盒

中国科技成果 2004年第15期5卷 56-56页

“基于tas-elisa的植物病毒检测(试剂)盒制备及其应用”是云南农业科学院生物技术研究所承担完成的国家科技部科技农业成果转化资金项目。该课题组从云南各地采集了主要粮经作物病毒样品1200份，应用间接酶联免疫吸附测定(Indirect enzy... 详细信息

“基于tas-elisa的植物病毒检测(试剂)盒制备及其应用”是云南农业科学院生物技术研究所承担完成的国家科技部科技农业成果转化资金项目。该课题组从云南各地采集了主要粮经作物病毒样品1200份，应用间接酶联免疫吸附测定(Indirect enzyme-linked immunosorbent assay，I-elisa)

关键词： tas-elisa 植物病毒检测试剂盒生物技术科技农业成果粮经作物间接酶联免疫吸附测定