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基于“伏邪理论”探讨CAC发病中tams/MUC1介导的结肠炎性微环境形成机制

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中医药学报 2024年第4期52卷 1-6页

作者：何雪马淑然孙一珂胡孙林刘旭刘雷蕾北京中医药大学北京100029 天津市人民医院天津300122

炎性微环境在结肠“炎-癌”转化的过程中发挥着关键作用,其介导的结肠“炎-癌”转化过程与中医“伏邪理论”具有相似性。本文基于“伏邪理论”探讨了肿瘤相关巨噬细胞(tams)与黏蛋白1(MUC1)之间的交互关系介导的结肠炎性微环境形成机制... 详细信息

炎性微环境在结肠“炎-癌”转化的过程中发挥着关键作用,其介导的结肠“炎-癌”转化过程与中医“伏邪理论”具有相似性。本文基于“伏邪理论”探讨了肿瘤相关巨噬细胞(tams)与黏蛋白1(MUC1)之间的交互关系介导的结肠炎性微环境形成机制,认为异常表达的MUC1可作为“伏痰”的研究指标,进一步提出在临床早期治疗结肠炎相关结直肠癌(CAC)时,应以扶正透邪为基本原则,灵活运用健脾化痰、调气化痰、清温消痰、活血解毒化痰等治法,以有效干预结肠炎的恶性转化。

关键词：伏邪理论炎性微环境痰 CAC tams MUC1

基于肿瘤相关巨噬细胞的膀胱癌治疗难点及展望的研究进展

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重庆医学 2024年

作者：钱俊安罗丽雯许齐明邓凯王春晖昆明医科大学附属延安医院泌尿外科昆明医科大学附属红河医院急诊科

膀胱癌在恶性肿瘤患者死亡统计谱中占第12位，其发病率高，患病人群有年轻化的趋势，且易发生转移和复发。近年来，在中晚期膀胱癌患者不能接受顺铂化疗或化疗耐药的病人中逐渐推行免疫治疗，特别是以PD1/PDL1的免疫检查点抑制剂为主导... 详细信息

膀胱癌在恶性肿瘤患者死亡统计谱中占第12位，其发病率高，患病人群有年轻化的趋势，且易发生转移和复发。近年来，在中晚期膀胱癌患者不能接受顺铂化疗或化疗耐药的病人中逐渐推行免疫治疗，特别是以PD1/PDL1的免疫检查点抑制剂为主导，虽然以PD1/PDL1为主的免疫检查点抑制剂在免疫治疗上取得了不错的疗效。但由于免疫逃逸事件的增加，免疫治疗的获益大约只有30%的病人。因此，迫切需要开发针对膀胱癌免疫逃逸病人的治疗方案。最近，TME是研究人员关注的热点，尤其是TME中的具有免疫抑制作用的免疫抑制细胞受到重视。TME中五种拥有免疫抑制功能的细胞（tams、Tregs、MDSCs、TANs、CAFs）在肿瘤免疫逃逸中发挥着重要作用，该文详细阐述了tams的组成及功能，以及膀胱癌TME中tams促瘤的机制及靶向膀胱癌TME中tams治疗的展望。

关键词：膀胱癌 TME tams 嘌呤代谢治疗难点综述

Remodeling tumor immunosuppressive microenvironment via a novel bioactive nanovaccines potentiates the efficacy of cancer immunotherapy

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Bioactive Materials 2022年第10期7卷 107-119页

作者： Xiaoxue Xie Yi Feng Hanxi Zhang Qingqing Su Ting Song Geng Yang Ningxi Li Xiaodan Wei Tingting Li Xiang Qin Shun Li Chunhui Wu Xiaojuan Zhang Guixue Wang Yiyao Liu Hong Yang Department of Biophysics School of Life Science and TechnologyUniversity of Electronic Science and Technology of ChinaChengdu610054SichuanPR China TCM Regulating Metabolic Diseases Key Laboratory of Sichuan Province Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese MedicineNo.39 Shi-er-qiao RoadChengdu610072SichuanPR China Key Laboratory of Biorheological Science and Technology Ministry of EducationState and Local Joint Engineering Laboratory for Vascular ImplantsBioengineering College of Chongqing UniversityChongqing400030PR China

The clinical outcomes of cancer nanovaccine have been largely impeded owing to the low antigen-specific T cell response rate and acquired resistance caused by the immunosuppressive tumor microenvironment(TME).Here,we reported a tumor acidity-responsive nanovaccine to remodel the immunosuppressive TME and expand the recruitment of tumor infiltrating lymphocytes(TILs)using hybrid micelles(HM),which encapsulated colony stimulating factor 1 receptor(CSF1-R)inhibitor BLZ-945 and indoleamine 2,3-dioxygenase(IDO)inhibitor NLG-919 in its core and displayed a model antigen ovalbumin(OVA)on its surface(denoted as BN@HM-OVA).The bioactive nanovaccine is coated with a polyethylene glycol(PEG)shell for extending nanoparticle circulation.The shell can be shed in response to the weakly acidic tumor microenvironment.The decrease in size and the increase in positive charge may cause the deep tumor penetration of drugs.We demonstrated that the bioactive nanovaccine dramatically enhance antigen presentation by dendritic cells(DCs)and drugs transportation into M1-like tumor-associated macrophages(tams)and tumor cells via size reduction and increasing positive charge caused by the weakly acidic TME.Such bioactive nanovaccine could remodel the immunosuppressive TME into an effector T cells favorable environment,leading to tumor growth inhibition in prophylactic and therapeutic E.G7-OVA tumor models.Furthermore,combining the bioactive nanovaccine with simultaneous anti-PD-1 antibody treatment leads to a long-term tumor inhibition,based on the optimal timing and sequence of PD-1 blockade against T cell receptor.This research provides a new strategy for the development of efficient cancer immunotherapy.

关键词： Bioactive nanovaccine Cancer immunotherapy IDO inhibitor tams TME

肿瘤缺氧微环境中tams来源的外泌体LncRNA SNHG16促进乳腺癌转移的机制研究

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肿瘤缺氧微环境中TAMs来源的外泌体LncRNA SNHG16促进乳腺癌转移...

作者：杜丹丹山东大学

学位级别：硕士

研究背景与目的2020年乳腺癌超过肺癌成为世界上第一大恶性肿瘤,其也是女性当中发病率最高的恶性肿瘤,严重威胁女性健康。其中三阴性乳腺癌由于缺乏ER受体、PR受体、HER-2受体,缺乏靶向性、针对性、特异性的治疗方法。且三阴性乳腺癌相... 详细信息

研究背景与目的2020年乳腺癌超过肺癌成为世界上第一大恶性肿瘤,其也是女性当中发病率最高的恶性肿瘤,严重威胁女性健康。其中三阴性乳腺癌由于缺乏ER受体、PR受体、HER-2受体,缺乏靶向性、针对性、特异性的治疗方法。且三阴性乳腺癌相比其他亚型,病情进展快、恶性程度高、易出现淋巴结转移以及远处转移,严重危害乳腺癌患者的生存与预后。肿瘤相关巨噬细胞(tams)是肿瘤微环境中数量最丰富的免疫细胞,也是目前极具关注度的治疗靶标。大量的研究证明tams显著影响乳腺癌的复发转移,通过分泌多种促进肿瘤侵袭转移的细胞因子、诱导多种基质金属蛋白酶激活、与血管紧张素结合促进血管生成,广泛促进肿瘤转移。缺氧是大多数实体瘤TME的基本特征,也是促进肿瘤转移的强大推动力,且肿瘤细胞在缺氧环境下分泌多种趋化因子招募tams到缺氧区域,从而促进肿瘤转移。外泌体是近年来研究者关注的热点,是生物源性的细胞间通讯的媒介者,且广泛参与肿瘤的恶性程度进展。肿瘤细胞通常释放更多的外泌体来沟通肿瘤微环境中的近距离与远距离通信。外泌体参与了几乎所有的肿瘤特征,包括持续增殖、血管生成、免疫系统逃避、基因组不稳定、抗凋亡、失调的能量代谢、侵袭和转移。且缺氧微环境可诱导外泌体的分泌以及其内容物的装载。缺氧微环境下tams所分泌的外泌体是否促进三阴性乳腺癌侵袭转移的作用尚未见报道。本课题立足于三阴性乳腺癌高转移率的治疗,针对促进转移的TME特点,即tams促肿瘤转移作用以及缺氧微环境特征,聚焦备受关注的生物源性的外泌体进行探究,希望探寻有效抑制三阴性乳腺癌转移的靶点,为三阴性乳腺癌预防及治疗提供新的理论依据及策略。研究方法1.THP-1细胞向tams分化及鉴定采用人骨髓来源单核细胞THP-1细胞,经PMA及人三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞上清条件培养基诱导分化成tams,作为体外实验研究对象。流式细胞术检测MDA-MB-231细胞条件培养基诱导分化的tams的巨噬细胞标志物CD68以及M2型标志物CD206的表达情况。2.缺氧模型建立与鉴定利用缺氧孵箱(1%O2,5%CO2,37℃)作为缺氧模型,免疫荧光法观察常氧以及缺氧环境tams中HIF-1α的表达与分布,确定缺氧模型的建立。3.tams分泌的外泌体的提取与鉴定tams诱导分化后加入含无外泌体血清的培养基在常氧以及缺氧环境中培养48h,取上清,利用超高速离心法提取、试剂盒纯化获得外泌体。利用透射电镜(TEM)、Zeta电位及纳米粒度分析仪(DLS)、Western blot分别观察提取物形态、粒径、蛋白标记物CD9和CD63来鉴定提取物是否为外泌体。4.检测缺氧tams来源的外泌体对MDA-MB-231细胞的存活、迁移、侵袭和血管拟态形成的作用将外泌体应用DiR染色,将其与MDA-MB-231细胞共孵育4h后,荧光显微镜下观察外泌体被肿瘤细胞摄取的情况。将常氧和缺氧tams的外泌体经BCA蛋白定量法定量后,与MDA-MB-231细胞共孵育24h,MTT法检测肿瘤细胞的存活能力。将相同细胞数目的tams分别在常氧、缺氧环境培养后提取的外泌体与MDA-MB-231细胞共孵育24h,采用划痕实验、Transwell小室迁移实验、Transwell小室侵袭实验、血管拟态形成实验检测缺氧tams的外泌体对MDA-MB-231细胞迁移、侵袭和血管拟态形成的作用。5.检测缺氧tams来源的外泌体中LncRNA SNHG16对MDA-MB-231细胞迁移、侵袭和血管拟态形成的影响UALCAN平台结合TCGA数据库分析浸润性乳腺癌LncRNASNHG16的表达水平,不同乳腺癌类型的表达水平以及与生存预后的相关性。qPCR检测常氧和缺氧tams、其分泌的外泌体及与外泌体共孵育的肿瘤细胞中LncRNA SNHG16的表达水平。qPCR检测采用siRNA-SNHG16敲低tams以及MDA-MB-231细胞中SNHG16的表达水平。将缺氧环境下干扰SNHG16表达后的tams分泌的外泌体与MDA-MB-231细胞(SNHG16正常表达)共孵育或者与干扰SNHG16的MDA-MB-231细胞共孵育24小时,分别通过Transwell小室迁移实验、Transwell小室侵袭实验、血管拟态形成实验来检测下调tams或/和肿瘤细胞中SNHG16的表达对MDA-MB-231细胞迁移、侵袭以及血管拟态生成能力的影响。6.检测LncRNASNHG16促进MDA-MB-231细胞的迁移、侵袭和血管拟态形成的下游分子机制LncRNA 亚细胞定位信息平台(LncATLAS 平台 https://lncatlas.***.eu/)分析SNHG16在人体15种细胞系中的定位信息。胞浆胞核分离qPCR实验检测SNHG16在MDA-MB-231细胞中的细胞定位。综合TCGA数据库生物信息学文献寻找在乳腺癌中低表达、Starbase数据库中与SNHG16有结合

关键词： tams 缺氧外泌体 SNHG16 miR-205-5p 三阴性乳腺癌

真核细胞翻译起始因子4E（elF4E）和M2型肿瘤相关巨噬细胞（tams）在甲状腺乳头状癌中的表达及临床意义

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真核细胞翻译起始因子4E（elF4E）和M2型肿瘤相关巨噬细胞（TAMs...

作者：赵益娅中国医科大学

学位级别：硕士

目的:检测M2型tams和eIF4E在甲状腺乳头状癌组织和癌旁组织中的表达情况,探索甲状腺乳头状癌中M2型tams和eIF4E表达情况与患者不同临床病理特征之间的关系,探索M2型tams和eIF4E在甲状腺乳头状癌中表达情况之间的相关性以及eIF4E在甲状... 详细信息

目的:检测M2型tams和eIF4E在甲状腺乳头状癌组织和癌旁组织中的表达情况,探索甲状腺乳头状癌中M2型tams和eIF4E表达情况与患者不同临床病理特征之间的关系,探索M2型tams和eIF4E在甲状腺乳头状癌中表达情况之间的相关性以及eIF4E在甲状腺乳头状癌中的表达有何意义。方法:1.采用免疫组化方法分别对50例甲状腺乳头状癌患者的癌组织、癌旁组织切片进行染色,然后检测切片中tams和eIF4E的表达情况。2.分析tams和eIF4E在甲状腺乳头状癌和癌旁组织中的表达水平,并且探讨tams和eIF4E的表达水平与患者的性别、年龄、肿瘤直径大小、有无淋巴结转移、有无外侵、有无BRAFV600E突变等临床特征之间的关系。3.研究分析tams和eIF4E在甲状腺乳头状癌中的表达水平是否具有相关性。结果:1.免疫组化结果:甲状腺乳头状癌组织中tams和eIF4E的表达量高于癌旁组织,差异具有统计学意义（P＜0.05）。2.tams和eIF4E的表达水平与甲状腺乳腺癌患者的年龄、性别、肿瘤直径大小无关（P＞0.05）,与有无外侵、淋巴结转移、BRAFV600E突变相关（P＜0.05）。3.tams和eIF4E在甲状腺乳头状癌中的表达水平存在相关关系（r=0.166,P＜0.05）。结论:1.M2型tams和eIF4E在PTC中高度表达并且具有相关性。2.M2型tams和eIF4E在PTC中的表达与性别、年龄、肿瘤直径无关,与肿瘤外侵、淋巴结转移、BRAFV600E突变有关。3.eIF4E也有作为PTC患者进行手术之前检查评判良恶性的一种分子标记物的可能性,也有可能有利于对PTC患者实施更加个体化的治疗方案和术后管理,具体机制有待于进一步深入研究。

关键词：甲状腺乳头状癌 tams eIF4E CD206 肿瘤微环境

非小细胞肺癌新辅助免疫治疗疗效与tams表达及dNLR的相关性研究

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非小细胞肺癌新辅助免疫治疗疗效与TAMs表达及dNLR的相关性研究

作者：呼延卓雅西安医学院

学位级别：硕士

目的:1.评估可切除局部晚期非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer,NSCLC）患者新辅助免疫联合化疗与新辅助化疗疗效的差别;2.分析肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-associated macrophages,tams）、衍生中性粒细胞与淋巴细胞比值（derived ... 详细信息

目的:1.评估可切除局部晚期非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer,NSCLC）患者新辅助免疫联合化疗与新辅助化疗疗效的差别;2.分析肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-associated macrophages,tams）、衍生中性粒细胞与淋巴细胞比值（derived neutrophil to lymphocyte ratio,dNLR）与新辅助免疫联合化疗及新辅助化疗疗效的相关性。方法:收集陕西省肿瘤医院2018年1月1日-2022年6月31日163例接受新辅助治疗及手术治疗的NSCLC患者临床病理资料,评估新辅助免疫联合化疗与新辅助化疗的治疗疗效,分析主要病理缓解（major pathological response,MPR）与临床病理参数及dNLR间的相关性;进一步收集其中37例同时具有新辅助治疗前后的配对组织病理切片/蜡块患者的临床病理资料,通过免疫组化染色实验检测新辅助治疗前后tams相关分子（CD68、CD86、CD163）的表达,分析tams相关分子与MPR的相关性。应用SPSS 26.0软件进行数据分析,计数资料均用率（百分比）来表示,计量资料均采用Kolmogorov-Smirnov法检验正态性,符合正态分布的数据采用平均数±标准差（x±s）表示。采用卡方检验分析新辅助治疗疗效组间的差别;采用t检验分析dNLR在新辅助治疗前后的水平并比较组间的差别;采用配对的卡方检验（Mc Nemar检验）来比较CD68、CD86、CD163在新辅助治疗前后的表达情况;采用卡方检验分析dNLR与MPR及ORR的相关性;选用Spearman相关系数,分析tams相关分子（CD68、CD163、CD86）与MPR之间的相关性;采用卡方检验分析MPR、tams相关分子（CD68、CD86、CD163）、dNLR与临床病理参数之间的相关性。所有P值均为双侧,以P0.05）。新辅助化疗组中,发生T分期降期、N分期降期者较未发生T分期降期（53.5%vs 10%,P0.05）。3.新辅助免疫联合化疗组中,治疗前dNLR为2.58±0.844,治疗后dNLR为2.19±0.967,治疗后dNLR较治疗前下降（P=0.028）。在新辅助化疗组中,治疗前dNLR为2.56±1.193,治疗后dNLR为2.39±1.235,治疗前后组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。新辅助免疫联合化疗组与新辅助化疗组治疗后dNLR的组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。4.新辅助免疫联合化疗组中,No-MPR（未达到MPR）组的dNLR为2.52±1.014,MPR组的dNLR为1.96±0871,MPR组的dNLR较No-MPR组降低（P=0.031）;L-dNLR（低水平dNLR）组比H-dNLR（高水平dNLR）组更易达到MPR（75%vs40.7%,P=0.01）。新辅助化疗组中,No-MPR组的dNLR为2.45±1.307,MPR组dNLR为2.21±0.918,组间比较差异无统计学意义（P>0.05）;L-dNLR组与H-dNLR组的组间MPR比较差异无统计学意义（P>0.05）。5.新辅助免疫联合化疗组中,L-dNLR组较H-dNLR组的ORR更高（78.6%vs59.2%,P=0.037）;dNLR与其余临床病理特征之间无相关性（P>0.05）。新辅助化疗组中,L-dNLR组与H-dNLR组的组间ORR比较差异无统计学意义（P>0.05）;dNLR与其余临床病理特征之间无相关性（P>0.05）。6.新辅助免疫联合化疗组中,治疗后CD86的阳性表达率高于治疗前CD86阳性表达率（75%vs 16.7%,P=0.039）;CD163、CD68的表达在治疗前后的差异无统计学意义（P>0.05）。新辅助化疗组中,治疗后CD68的阳性表达率高于治疗前CD68阳性表达率（64%vs 28%,P=0.035）

关键词：非小细胞肺癌新辅助免疫联合化疗 MPR tams dNLR

高级别浆液性卵巢癌中同源重组缺陷与M2型肿瘤相关巨噬细胞浸润的关系及意义

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高级别浆液性卵巢癌中同源重组缺陷与M2型肿瘤相关巨噬细胞浸润的...

作者：杨丹遵义医科大学

学位级别：硕士

目的:本研究拟探讨高级别浆液性卵巢癌(High grade serous ovarian cancer HGSOC)中同源重组修复(homologous recombination repair,HRR)基因缺陷与M2型肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages,tams)相关性分析及与临床病理特征和预后的关系。方法:1、收集遵义医科大学附属医院2013年4月-2020年8月收治的80例具有完整临床病理资料的HGSOC根治病例,且均由两名副高以上职称病理科医师明确诊断。2、在HGSOC组织中应用苏木精-伊红(HE)染色,免疫组化染色(IHC),在HE染色切片上排除坏死区域,采用免疫组织化学染色(Envision两步法)分别检测肿瘤组织中癌巢及肿瘤间质中CD68+tams和CD163+tams的浸润情况。3、应用下一代测序技术(Next generation sequencing,NGS)检测其中36例HGSOC的HRR基因突变情况。4、对患者进行随访,观察CD68+tams、CD163+tams、CD163/CD68+tams比值在HGSOC中癌巢、癌间质的的浸润情况及与HRR的突变情况,探讨其相关性及与临床病理特征和预后的关系。结果:1、HGSOC中tams浸润水平与临床病理特征和预后的关系在80例HGSOC癌巢、癌间质中可见浸润水平变化不等的CD68+tams、CD163+tams,CD163+tams主要浸润在CD68+tams浸润区域,癌巢、癌间质分布无统计学差异(P>0.05)。在80例HGSOC癌巢、癌间质中CD68+tams浸润水平与临床病理特征关系:在癌间质中,CD68+tams浸润与年龄、腹膜有无转移有关(Ptams浸润随年龄的增加、腹膜的转移的增加而降低,与其他临床病理特征无关。在癌巢中CD68+tams浸润与患者的临床病理特征均无关(P>0.05)。在80例HGSOC癌巢、癌间质中CD163+tams浸润水平与临床病理特征关系:在癌巢中CD163+tams浸润与年龄、肿瘤直径、腹膜有无转移、化疗有无耐药有关(Ptams浸润随年龄、腹膜转移、化疗耐药情况的增高而增加,但随肿瘤直径的增大而降低,与其他临床病理特征均无关(P>0.05)。在癌间质中CD163+tams浸润与年龄有关(Ptams浸润随年龄的增高而降低,而与其他临床病理特征均无关(P>0.05)。在80例HGSOC癌巢、癌间质中CD163/CD68+比值与临床病理特征关系:在癌巢中CD163/CD68+比值与淋巴结有无转移、腹膜有无转移、化疗有无耐药有关(P0.05)。在癌间质中CD163/CD68+比值与年龄有关(P0.05)。HGSOC患者不同分组的生存分析:在80例HGSOC癌巢、癌间质中以tams测量值的中位数为界,将CD68+tams、CD163+tams、CD163/CD68+tams比值分为高、低密度组,探讨其生存预后。生存分析显示:在癌巢中,较低密度的CD163+tams浸润和CD163/CD68+tams比值较低的患者比较高密度的患者显示更长的OS和PFS(Ptams不同分组,以及在癌间质中CD68+tams、CD163+tams、CD163/CD68+tams不同分组均未显示出更长OS和PFS(P>0.05)。COX多因素生存分析显示:淋巴结有无转移,腹膜有无转移,化疗有无耐药是影响HGSOC患者OS预后的独立因素,另外年龄大小,化疗有无耐药,癌巢中CD163/CD68+比值高低是影响HGSOC患者PFS预后的独立因素。2、HRR基因突变与tams浸润的相关性在收集的80例HGSOC组织蜡块中选取36例行NGS测序,共发现有HRR基因突变患者15例(BRCA1、BRCA2、ATM、PALB2、BLM、CHEK1、CDK12、BARD1、FANCD2),突变率为41.7%。HRR基因突变与患者临床病理特征无关(P>0.05),HRR基因突变与HGSOC患者的OS及PFS没有统计学意义(P>0.05)。在癌巢中,HRR突变组CD163/CD68+tams比值明显低于非HRR突变组CD163/CD68+tams比值(Ptams浸润与非HRR突变组CD163/CD68+tams浸润无统计学意义(P>0.05)。同样在癌巢、癌间

关键词： HGSOC TME tams HRR基因突变

基于PI3K/AKT信号通路调控tams转化探讨当归补血汤抑制卵巢癌的作用及机制

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基于PI3K/AKT信号通路调控TAMS转化探讨当归补血汤抑制卵巢癌的作...

作者：王雪振山东中医药大学

学位级别：硕士

研究目的:采用网络药理学方法分析当归补血汤治疗卵巢癌的作用靶点及信号通路,以肿瘤相关巨噬细胞(tumour-associated macrophages,tams)极化为切入点,研究当归补血汤对卵巢癌小鼠PI3K/Akt信号通路的调控作用,为中医药防治卵巢癌提供有... 详细信息

研究目的:采用网络药理学方法分析当归补血汤治疗卵巢癌的作用靶点及信号通路,以肿瘤相关巨噬细胞(tumour-associated macrophages,tams)极化为切入点,研究当归补血汤对卵巢癌小鼠PI3K/Akt信号通路的调控作用,为中医药防治卵巢癌提供有效方药和实验依据。研究方法:本研究采用网络药理学技术和分子对接技术分析当归补血汤治疗卵巢癌的信号通路与关键成分、核心靶点,为开展后续实验研究提供理论依据。将卵巢癌ID8细胞系悬液以每只0.2m L(5×10/0.2m L)注射至C57BL/6小鼠右腋下制备卵巢癌模型。造模成功后将小鼠随机分为模型组(Model)、阳性药物对照组(DDP)、当归补血汤低剂量组(DBD-L)、当归补血汤中剂量(DBD-M)组、当归补血汤高剂量组(DBD-H),每组8只小鼠,另选择8只正常小鼠作为空白对照组(Normal)。对Model组、DBD-L组、DBD-M组、DBD-H组、Normal组进行为期15天的灌胃,对DDP组进行腹腔注射(1次/5天)。观察小鼠的精神状态、毛发质量、食用饲料量、饮水量。第16天取肿瘤组织、血液以进行后续实验。观察小鼠肿瘤体积大小,称量肿瘤重量计算抑瘤率;HE染色观察卵巢癌模型小鼠肿瘤细胞形态;TUNEL法检测卵巢癌模型小鼠肿瘤细胞凋亡;免疫组化检测卵巢癌模型小鼠肿瘤组织中tams-M1特征性蛋白CD86、tams-M2特征性蛋白CD163表达;ELISA检测卵巢癌模型小鼠血清中M1分泌炎性因子TNF-α、M2分泌炎性因子IL10表达;Western blot检测卵巢癌模型小鼠肿瘤组织中p-PI3K、p-Akt1、p-Akt2蛋白表达。实验结果:1.网络药理学结果显示当归补血汤中包含25个活性成分,作用于707个靶点,与2066个卵巢癌靶点映射得到280个交集靶点,其抗卵巢癌的主要信号通路是PI3K/Akt,关键成分是异鼠李素(isorhamnetin)、华良姜素(Jaranol)、槲皮素(Quercetin)、异黄烷酮(isoflavanone),核心靶点为Akt1、EGFR、VEGFA、TNF、IL6;分子对接结果显示关键成分异鼠李素、槲皮素与核心靶点Akt1结合能最强,作用氢键数目最多,表明异鼠李素、槲皮素是当归补血汤治疗卵巢癌的重要成分,Akt1是当归补血汤治疗卵巢癌的重要靶点。2.通过观察卵巢癌模型小鼠发现,DDP组比模型组小鼠精神状态稍差,容易蜷缩成一窝并相互靠拢,活动度较弱,较易抓起;DBD-H组、DBD-M组、DBD-L组的小鼠精神状态良好,活动度较强,抓起时反应强度大。在食用饲料量方面:DDP组小鼠比模型组小鼠食用饲料量少,DBD-H组、DBD-M组、DBD-L组小鼠的食用饲料量多。在饮水消耗量方面:DDP组小鼠比模型组小鼠饮水消耗量少,DBD-H组、DBD-M组、DBD-L组小鼠饮水消耗量多。在毛发质量方面:DDP组小鼠比模型组小鼠毛发质量较差,抓起时掉毛严重,光泽度欠佳;DBD-H组、DBD-M组、DBD-L组三组小鼠毛发质量茂密,抓起时有轻微掉毛现象,但光泽度较好。3.体重结果显示,Normal组小鼠体重呈上升趋势,DBD-H组与DBD-M组小鼠体重呈下降趋势,但与Model组、DDP组、DBD-L组小鼠相比下降趋势缓。4.抑瘤率结果显示,(1)与Model组相比,DDP组与DBD-M组小鼠瘤重降低;与DDP组相比,DBD-H组、DBD-M组、DBD-L组小鼠瘤重上升(2)DBD-H组、DBD-M组、DBD-L组、DDP组小鼠的抑瘤率分别为15.75%、45.17%、31.73%、94%。5.HE染色结果显示,各组小鼠肿瘤组织,排列较为紧密,细胞增大,形态各异,细胞核增大,核浆比例异常,核分裂像增多,异型性明显;其中,DDP组与DBD-H组癌组织中可见局部坏死,肿瘤细胞出现核固缩、空泡化等凋亡化改变。6.TUNEL结果显示,与Model组相比,DDP组与DBD-H组小鼠卵巢癌细胞凋亡率明显升高;与DDP组相比,DBD-L组卵巢癌细胞凋亡率明显降低。7.WB结果显示,(1)与Model组相比,DDP组、DBD-H组、DBD-M组、DBD-L组p-PI3K表达下调;与DDP组相比,DBD-H组、DBD-M组、DBD-L组p-PI3K表达下调(2)与Model组相比,DBD-M组与DBD-H组p-Akt1表达下调;与DDP组相比,DBD-H组p-Akt1表达显著性下调(3)与Model组相比,DDP、DBD-L DBD-M与DBD-H组p-Akt2表达均上调,与DDP组相比,DBD-M组、DBD-H组p-Akt2表达上调。8.ELISA结果显示,(1)与Normal组相比,DBD-H、DBD-L组TNF-α表达上调;与Model组相比,DBD-H、DBD-M组、DDP组TNF-α表达水平上调;与DDP组相比,DBD-H组、DBD-L组T

关键词：当归补血汤卵巢癌 PI3K/Akt信号通路 tams M1 M2

Fibronectin调控肿瘤相关巨噬细胞糖酵解抑制抗肿瘤免疫反应的机...

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作者：李爱恬郑州大学

学位级别：硕士

背景和目的肺癌是中国乃至全世界死亡率最高的恶性肿瘤,其中绝大多数属于非小细胞肺癌(none small cell lung cancer,NSCLC)。目前对其治疗主要为包括手术、化疗、放疗、靶向药物治疗、免疫治疗等的综合治疗,但患者5年生存率仍较低。肿... 详细信息

背景和目的肺癌是中国乃至全世界死亡率最高的恶性肿瘤,其中绝大多数属于非小细胞肺癌(none small cell lung cancer,NSCLC)。目前对其治疗主要为包括手术、化疗、放疗、靶向药物治疗、免疫治疗等的综合治疗,但患者5年生存率仍较低。肿瘤的发生发展与免疫微环境密切相关,NSCLC也不例外。近年来,免疫检查点治疗在NSCLC中取得不错的疗效,这正是由于改善了肿瘤微环境中的免疫细胞功能。肿瘤微环境由癌细胞、免疫细胞、成纤维细胞、内皮细胞及细胞外基质等组成。其中,肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages,tams)是肿瘤微环境中一种重要的免疫调节细胞,在调控肿瘤免疫抑制微环境及肿瘤发生进展方面起着关键作用。tams具有极大的可塑性,可以极化为促炎、抗肿瘤的M1型巨噬细胞,也可极化为抗炎、促肿瘤的M2型巨噬细胞。通常认为tams大多表现为M2型巨噬细胞表型及功能,但可通过干预使其向M1型极化并恢复抗肿瘤能力,抑制肿瘤生长。因此,本课题旨在通过筛选NSCLC中M1型与M2型巨噬细胞差异表达基因,明确tams免疫抑制作用的关键调控分子。利用构建敲低细胞系和阻断型抑制剂等技术手段,在分子水平、细胞水平和动物肿瘤模型中,探究该关键差异分子调控tams免疫抑制作用的重要机制,并观察靶向相关通路后的抗肿瘤疗效,为临床NSCLC患者治疗提供新的措施及手段。方法1.利用GEO数据库中关于M1型及M2型巨噬细胞的RNA-Seq数据,分析寻找差异基因。2.利用实时荧光定量PCR(quantitativereal-time PCR,qPCR)验证差异基因在M1型和M2型巨噬细胞的表达情况。3.利用单细胞测序分析FN1基因(编码蛋白为Fibronectin)在NSCLC各类细胞群中的表达情况,及各类细胞所表达标志性分子。4.利用流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测NSCLC癌及癌旁组织中Fibronectin阳性细胞群中巨噬细胞比例,并检测CD163+和CD163-巨噬细胞中Fibronectin表达情况。5.利用流式细胞荧光分选技术(fluorescence-activated cell sorting,FACS)分选出NSCLC癌组织中的CD163+及CD163-巨噬细胞,并通过RNA-Seq及qPCR检测FN1基因的表达情况;并利用免疫荧光(immunofluorescence,IF)检测癌组织中的CD163高表达及低表达细胞周围Fibronectin表达情况。6.对体外人外周血单核细胞诱导的M1型和M2型巨噬细胞,利用qPCR检测FN1基因及巨噬细胞功能指标的表达情况,并利用免疫印迹(western blot,WB)及成像流式细胞术(imaging flow cytometry,IFC)检测 Fibronectin 的表达情况。7.人外周血单核细胞诱导为M2型巨噬细胞,添加Fibronectin inhibitor(FI)处理后,利用FCM检测巨噬细胞表型及功能。8.利用shRNA干扰慢病毒载体构建THP-1 sh NC及sh FN1(sh 9-2及sh 10-1)细胞系,通过WB及qPCR检测敲低效率;将其用M2型巨噬细胞诱导方法诱导后,利用qPCR及FCM检测巨噬细胞表型及功能。9.对诱导后的THP-1 shNC及sh FN1细胞进行RNA-Seq,对差异基因进行GO及KEGG分析。10.对诱导后的THP-1 sh NC及sh FN1细胞,利用IF检测F-actin的表达情况;利用qPCR及WB检测PFKP的表达情况。11.对添加FI处理的人外周血单核细胞诱导的M2型巨噬细胞,利用IF检测F-actin的表达情况;利用qPCR及WB检测PFKP的表达情况;利用酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测上清中乳酸的含量。12.对诱导后的THP-1 shNC及sh FN1细胞,添加F-actin抑制剂(Blebbistatin)处理后,利用IF检测F-actin的表达情况;利用WB检测PFKP的表达情况。13.对添加Blebbistatin处理的人外周血单核细胞诱导的M2型巨噬细胞,利用WB检测PFKP的表达情况;利用qPCR检测PFKP及炎性细胞因子的表达情况;利用ELISA检测上清中乳酸的含量。14.对添加FI处理的人外周血单核细胞诱导的M2型巨噬细胞,再加用溶血磷脂酸(lysophosphatidicacid,LPA)处理,利用WB检测PFKP的表达情况。15.对诱导后的THP-1 sh NC及sh FN1细胞,添加MG-132处理后,利用WB检测PFKP的表达情况。16.对添加FI处理的人外周血单核细胞诱导的M2型巨噬细胞,再分别加用MG-132、氯喹(chloroquine,CQ)、雷帕霉素(rapamys

关键词： Fibronectin tams 糖酵解自噬肿瘤免疫微环境 NSCLC