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t4噬菌体诱导肿瘤相关巨噬细胞向M1型再极化

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中国肿瘤生物治疗杂志 2014年第3期21卷 251-256页

作者：李嵚于涛何琳惠林萍赵晨阳中国医科大学附属第四医院中心实验室辽宁沈阳110032

目的:观察t4噬菌体对M2型巨噬细胞向M1型再极化的诱导作用,并检测再极化的M1型巨噬细胞诱导小鼠Lewis肺癌细胞凋亡和抑制其侵袭的作用效果。方法:小鼠巨噬细胞RAW264.7经白细胞介素-4(IL-4)诱导为替代性活化巨噬细胞(M2型),以t4噬菌体... 详细信息

目的:观察t4噬菌体对M2型巨噬细胞向M1型再极化的诱导作用,并检测再极化的M1型巨噬细胞诱导小鼠Lewis肺癌细胞凋亡和抑制其侵袭的作用效果。方法:小鼠巨噬细胞RAW264.7经白细胞介素-4(IL-4)诱导为替代性活化巨噬细胞(M2型),以t4噬菌体对M2型巨噬细胞再极化诱导;Real-time PCR检测IL-4诱导极化及t4噬菌体再极化后巨噬细胞中IL-12、tNF-α、Arg-1、tGF-β、IL-10和iNOS基因mRNA的变化,Western blotting检测巨噬细胞内iNOS和Arg-1蛋白表达变化,ELISA法检测巨噬细胞培养上清中IL-10和IL-12的含量;流式细胞术和transwell法分别检测t4噬菌体再极化巨噬细胞诱导小鼠Lewis肺癌细胞凋亡和抑制其侵袭的作用效果。结果:RAW264.7细胞经IL-4处理后被诱导成为M2型巨噬细胞,其iNOS和IL-12 mRNA表达分别下降为对照组的1/2.5和1/6.2,而Arg-1和IL-10 mRNA表达分别增加了161.2和120.3倍。M2型巨噬细胞经野生型和突变型t4噬菌体处理后,IL-12、tNF-α、iNOS在mRNA和蛋白水平均明显逆转上调,IL-10、tGF-β、Arg-1则明显逆转下调,呈现M1型特征;其中突变型t4噬菌体的诱导作用显著强于野生型。野生型和突变型t4噬菌体诱导M1再极化的巨噬细胞致小鼠Lewis肺癌细胞的凋亡率较M2型巨噬细胞显著增高[(35.3±2.44)%、(39.1±2.08)%vs(4.68±0.56)%;均P43.8±7.51)、(23.2±4.33)个vs(177.5±12.33)个;均Pt4噬菌体能够诱导M2型巨噬细胞向M1型再极化,并增强巨噬细胞诱导肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤细胞侵袭的能力。

关键词： t4噬菌体巨噬细胞极化肺癌 Lewis细胞凋亡侵袭

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t4噬菌体蛋白的分子改造及其应用前景

动物医学进展 2012年第4期33卷 97-102页

作者：逯凯颜晨任慧英青岛农业大学动物科技学院山东青岛266109

t4噬菌体是一种病毒,其基因、结构和生物学特性已清晰,利用各种分子操作技术可以对其进行进一步改造。利用位点特异性诱变,研究t4噬菌体某些基本蛋白的功能;普遍用来进行噬菌体改造的噬菌体展示技术已经成功在t4衣壳平台上展示目的抗原... 详细信息

t4噬菌体是一种病毒,其基因、结构和生物学特性已清晰,利用各种分子操作技术可以对其进行进一步改造。利用位点特异性诱变,研究t4噬菌体某些基本蛋白的功能;普遍用来进行噬菌体改造的噬菌体展示技术已经成功在t4衣壳平台上展示目的抗原;位点特异性诱变及噬菌体展示技术都可以用于改造噬菌体使其与哺乳动物细胞发生相互作用,也能获得除细菌宿主之外的可被噬菌体感染的细胞;还可在不断发展的噬菌体治疗研究中得到应用。这些噬菌体的改造方法都将会促进疫苗技术、噬菌体疗法和其他生物及医学科学分支的发展。论文对t4噬菌体的蛋白结构、噬菌体展示技术及相关的噬菌体治疗等内容进行了综述。

关键词： t4噬菌体结构蛋白位点特异性突变噬菌体展示噬菌体治疗

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t4噬菌体的组装、感染及细胞裂解

中国农学通报 2011年第30期27卷 182-186页

作者：颜晨逯凯任慧英青岛农业大学动物科技学院山东青岛266109

为深入开发利用t4噬菌体展示系统及t4噬菌体的临床细菌病治疗,应用现代各种分子生物学手段,在蛋白分子和组成结构上对t4噬菌体颗粒的各个重要组成部分进行分析,例如头部、尾部和尾板,描述了其蛋白构成和各种影响因子,并着重介绍了在噬... 详细信息

为深入开发利用t4噬菌体展示系统及t4噬菌体的临床细菌病治疗,应用现代各种分子生物学手段,在蛋白分子和组成结构上对t4噬菌体颗粒的各个重要组成部分进行分析,例如头部、尾部和尾板,描述了其蛋白构成和各种影响因子,并着重介绍了在噬菌体装配中最为重要的DNA的包装。同时针对噬菌体t4的感染与超感染免疫性和感染所导致的细胞裂解和裂解抑制等方面,介绍了这些现象发生的分子机制和影响因素。以期对t4噬菌体的分子装配和侵染机制有更为深刻的了解。

关键词： t4噬菌体组装感染细胞裂解

展示KDR胞外区VEGF结合域的t4噬菌体对肺癌细胞增殖侵袭的抑制作用

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中国生物工程杂志 2013年第10期33卷 14-20页

作者：李嵚何琳惠林萍赵晨阳于涛中国医科大学附属四院中心实验室沈阳110032

目的:构建展示KDR的t4噬菌体并在细胞水平上检测其抑制肿瘤细胞增殖侵袭的作用及机制。方法:利用SOE-PCR的方法将KDR膜外区D2和D3与t4噬菌体小衣壳蛋白SOC基因融合并克隆到pEt28b表达载体中,经IPtG诱导表达并纯化后,利用体外展示技术将... 详细信息

目的:构建展示KDR的t4噬菌体并在细胞水平上检测其抑制肿瘤细胞增殖侵袭的作用及机制。方法:利用SOE-PCR的方法将KDR膜外区D2和D3与t4噬菌体小衣壳蛋白SOC基因融合并克隆到pEt28b表达载体中,经IPtG诱导表达并纯化后,利用体外展示技术将重组KDR-SOC蛋白展示在t4噬菌体表面,得到t4-KDR噬菌体。Mtt法检测t4-KDR噬菌体对肺癌A549细胞的增殖抑制作用,并采用transwell法检测其对VEGF促侵袭作用的影响。Rt-PCR法检测t4-KDR对MMP-2和MMP-9 mRNA水平的影响,并通过Western blot方法检测其对VEGF诱导ERK1/2磷酸化及其下游CyclinD1,p27,Bcl-2和Bax表达水平的影响。结果:KDR-SOC在大肠杆菌中稳定表达,展示KDR的t4-KDR噬菌体具有结合VEGF-165的能力,并显著抑制肿瘤细胞增殖和侵袭活性,降低MMP-2和MMP-9基因mRNA水平。Western blot结果表明t4-KDR噬菌体抑制VEGF诱导ERK1/2的磷酸化,降低CyclinD1及Bcl-2表达的同时,提高p27和Bax的表达。结论:展示KDR的t4噬菌体具有抑制肺癌细胞增殖和侵袭作用,其对MEK/ERK信号通路及其下游调控因子的影响是其作用的重要分子机制。

关键词： t4噬菌体增殖侵袭血管内皮生长因子受体-2 肺癌

鸡缩胆囊素(CCK)在t4噬菌体表面的展示及免疫原性研究

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畜牧兽医学报 2006年第7期37卷 705-710页

作者：舒鼎铭覃健萍曹永长毕英佐华南农业大学动物科学学院基因工程实验室广州510642

采用t4噬菌体表面展示系统,将CCK-33肽四多串联体及八多串联体展示在t4噬菌体表面,并研究其免疫原性。将CCK四串联体和八串联体与SOC基因缺失的、依赖溶菌酶的噬菌体Φt4-Z1重组,获得重组噬菌体Φt-4CCK和Φt-8CCK。SDS-PAGE和Western B... 详细信息

采用t4噬菌体表面展示系统,将CCK-33肽四多串联体及八多串联体展示在t4噬菌体表面,并研究其免疫原性。将CCK四串联体和八串联体与SOC基因缺失的、依赖溶菌酶的噬菌体Φt4-Z1重组,获得重组噬菌体Φt-4CCK和Φt-8CCK。SDS-PAGE和Western Blot检测结果表明,CCK多串联体蛋白已经成功展示在t4噬菌体表面,其融合蛋白分子量约30 ku和41 ku,能够与CCK标准阳性血清发生特异性反应。以重组噬菌体为免疫原制备油佐剂疫苗主动免疫胡须肉鸡后,抗体浓度显著升高,肉鸡的体重、采食量都有所提高,而料肉比有所下降。结果说明,鸡CCK蛋白展示在t4噬菌体表面具有良好的免疫原性。

关键词：缩胆囊素 t4噬菌体免疫原性

口蹄疫病毒全衣壳前体(P1)重组t4噬菌体的构建和鉴定

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中国兽医学报 2007年第5期27卷 671-673,678页

作者：田纯见毕英佐曹永长华南农业大学动物科学学院广东广州510642

以含完整的口蹄疫病毒全衣壳前体基因(P1)的质粒pP1-t为模板进行PCR扩增获得P1基因片段(约2 200bp),构建整合质粒pR-P1经引物对Pr.78/P1-A2进行PCR扩增筛选插入方向正确的重组质粒,EcoRⅠ酶切和t7启动子测序正确。以pR-P1质粒转化***2,... 详细信息

以含完整的口蹄疫病毒全衣壳前体基因(P1)的质粒pP1-t为模板进行PCR扩增获得P1基因片段(约2 200bp),构建整合质粒pR-P1经引物对Pr.78/P1-A2进行PCR扩增筛选插入方向正确的重组质粒,EcoRⅠ酶切和t7启动子测序正确。以pR-P1质粒转化***2,感染噬菌体φt4-Z1进行同源重组,经溶菌酶依赖性筛选获得整合成功的噬菌体φt4-P1。SDS-PAGE检测重组噬菌体出现约98 000预计大小的条带;Western bloting检测表明,重组噬菌体φt4-P1与口蹄疫阳性血清可发生免疫反应。

关键词：口蹄疫病毒全衣壳前体基因 t4噬菌体

新城疫病毒HN蛋白球状头部在t4噬菌体衣壳表面的展示

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中国兽医学报 2005年第4期25卷 346-349页

作者：刘铀毕英佐曹永长马静云肖俊芳华南农业大学动物科学学院广东广州510640

用Rt-PCR扩增新城疫病毒(NDV)hn基因,得到大小约1700bp的片段,将其克隆至pGEM-teasy载体并测定其核苷酸序列。根据测序结果,另设计1对引物带有EcoR限制位点,用PCR扩增基因主要功能区即编码HN蛋白球状头部的hngd片段,将其分别克隆至pSOC... 详细信息

用Rt-PCR扩增新城疫病毒(NDV)hn基因,得到大小约1700bp的片段,将其克隆至pGEM-teasy载体并测定其核苷酸序列。根据测序结果,另设计1对引物带有EcoR限制位点,用PCR扩增基因主要功能区即编码HN蛋白球状头部的hngd片段,将其分别克隆至pSOC和pR质粒soc基因3′端,重组质粒pSOC-HNGD转化***-21(DE3)感受态细胞,以终浓度1mmol/L的IPtG诱导表达,在SDS-PAGE凝胶上检测到相对分子质量大小约67000的目的蛋白条带。随后将重组质粒pR-HNGD转化t4宿主菌E2感受态细胞,阳性克隆用溶菌酶缺陷的t4-Z1感染,用不加溶菌酶的SC平板筛选阳性克隆。经PCR鉴定,hngd片段已整合在t4-Z1的基因组中。纯化后的重组噬菌体t4-Z1-HNGD用SDS-PAGE和Western-blot可检测到67000的特异条带。结果表明,HNGD蛋白成功展示在t4噬菌体衣壳表面,且与NDV抗血清具有良好的反应性。

关键词：新城疫病毒 t4噬菌体 HN蛋白展示

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口蹄疫病毒3C蛋白酶的t4噬菌体表面展示

中国兽医科学 2006年第7期36卷 519-522页

作者：田纯见毕英佐曹永长谢青梅华南农业大学动物科学学院广东广州510642

对FMDV 3C基因克隆质粒p3C-t进行PCR扩增,获得了口蹄疫病毒3C蛋白酶基因片段,将此片段与t4噬菌体整合质粒pR的EcoRⅠ酶切片段连接,转化***,DH5α工程菌,经EcoRⅠ酶切、质粒PCR扩增、插入方向筛选及测序鉴定,成功获得了t4噬菌体重组整合... 详细信息

对FMDV 3C基因克隆质粒p3C-t进行PCR扩增,获得了口蹄疫病毒3C蛋白酶基因片段,将此片段与t4噬菌体整合质粒pR的EcoRⅠ酶切片段连接,转化***,DH5α工程菌,经EcoRⅠ酶切、质粒PCR扩增、插入方向筛选及测序鉴定,成功获得了t4噬菌体重组整合质粒pR- 3C。将其转化*** E2后,与SOC基因缺失的噬菌体φt4-Z1同源重组,经溶菌酶依赖性筛选,获得了快速溶菌型噬菌体φt4-3C。经噬菌体PCR扩增、SDS-PAGE分析和Western-bot分析,重组噬菌体可展示约26 ku的重组蛋白;其大小与预期相符,具有免疫原性。

关键词：口蹄疫病毒 3C蛋白酶 t4噬菌体表面展示

禽流感病毒NP蛋白与t4噬菌体SOC蛋白的融合表达

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微生物学通报 2007年第5期34卷 889-892页

作者：王新卫毕英佐马静云詹爱军曹永长华南农业大学动物科学学院

利用PCR技术扩增禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)NP基因。将NP基因克隆至t4噬菌体表达质粒pSOC的SOC基因(t4噬菌体表面非结构蛋白基因)下游,构建成t4噬菌体SOC位点表达NP的表达载体pSOC-NP。将其转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPtG... 详细信息

利用PCR技术扩增禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)NP基因。将NP基因克隆至t4噬菌体表达质粒pSOC的SOC基因(t4噬菌体表面非结构蛋白基因)下游,构建成t4噬菌体SOC位点表达NP的表达载体pSOC-NP。将其转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPtG诱导后表达的目的蛋白SOC-NP进行SDS-PAGE与Western-blot方法检测。结果表明,表达的SOC-NP蛋白相对分子质量约58kD,表达量占菌体总蛋白量的20.34%,并具有与AIV特异性抗体反应的活性。

关键词：禽流感病毒核蛋白 t4噬菌体融合表达