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t24/adm原位膀胱癌多药耐药模型的建立

T24/ADM原位膀胱癌多药耐药模型的建立

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作者：高彦军山西医科大学

学位级别：硕士

第一部分人膀胱癌t24/adm耐药细胞的建立目的：建立人膀胱癌t24/adm细胞耐药模型并初步检测其耐药性。方法：以人膀胱癌t24细胞为亲本细胞,采用阿霉素(adm)低浓度梯度诱导细胞耐药。倒置显微镜下观察细胞形态变化及生长情况,Mtt法检测... 详细信息

第一部分人膀胱癌t24/adm耐药细胞的建立目的：建立人膀胱癌t24/adm细胞耐药模型并初步检测其耐药性。方法：以人膀胱癌t24细胞为亲本细胞,采用阿霉素(adm)低浓度梯度诱导细胞耐药。倒置显微镜下观察细胞形态变化及生长情况,Mtt法检测细胞对药物的耐受性,Rt-PCR检测mdr-1的mRNA表达。结果：阿霉素低浓度梯度诱导3个月后建立了耐药细胞系。t24/adm耐药细胞在形态上比亲本细胞略有增大,对adm的耐受性增高,同浓度adm作用下t24/adm比t24细胞存活多,组间差异具显著性,Pt24/adm细胞Rt-PCR检测mdr-1的mRNA表达显著增高,t24表达不明显,差异具有显著性,Pt24/adm细胞系具有多药耐药性,其耐药机制主要与mdr-1基因表达有关。第二部分胰酶法和盐酸法对原位膀胱癌模型建立的影响目的：比较胰酶法和盐酸法两种不同的膀胱粘膜损伤方法对细胞移植法原位膀胱癌模型建立的影响及优缺点。方法：4-6周龄裸鼠两组,每组10只。麻醉后经尿道置入膀胱静脉留置针,导尿后一组注入100u110%胰酶保留30min,另一组注入100ul 0.1 mol·L-1 Hcl 15s, PBS冲洗后将浓度为1×107L-1的人膀胱癌t24细胞悬液注入两组鼠膀胱保留1-2h。另设一组5只导尿冲洗后直接注入细胞保留1-2h。定期观察裸鼠一般情况。28d后断颈处死,解剖观察膀胱成瘤及转移情况,并取膀胱及可疑肾脏行病理学检查。结果：胰酶破坏组到2w有2只间断出现淡红色血尿,下腹肿块不明显。到28d后处死,肉眼2只成瘤,约占膀胱50%以上。病理检查证实成瘤2只,多局限于粘膜,未突破肌层。盐酸破坏组约12d开始出现血尿,其中4只可及下腹肿块,2只于2d死亡。到28d处死,共8只大体成瘤,2只见右肾肿大。病理检查示8只成瘤,细胞结构紊乱,未突破浆膜层,两只肾转移。未行粘膜破坏组无明显变化,也无瘤形成。结论：胰酶破坏膀胱粘膜对动物损伤轻,但成瘤率低;盐酸破坏粘膜对动物损伤稍大,但成瘤率满意,在细胞移植法建立原位膀胱癌模型可明显提高成瘤率。第三部分t24／adm原位膀胱癌多药耐药模型的建立及初步检测目的：建立模拟人的原位膀胱癌多药耐药模型并行耐药性初步检测。方法：采用细胞移植法将t24／adm耐药株及t24细胞敏感株移植到两组裸鼠膀胱后定期观察其下腹及一般情况。28d后处死裸鼠称成瘤膀胱重量,测体积,行组织病理学和细胞学检测,Rt-PCR测mdrl的表达,并将瘤组织制成细胞悬液用Mtt法测其耐药性。结果：两组裸鼠膀胱的成瘤率分别为80%(8/10)和90%(9/10),耐药组成瘤约晚敏感组2-3d,空白组无肿瘤形成。两组重量和体积分别为：(0.8±0.3)g,(1.0±0.5)g;(875±158)mm3,(903±192)nm3,组间比较差异无显著性(P>0.05)。组织病理学检测：t24/adm组有4只出现右肾增大,t24细胞组有两只裸鼠出现右肾肿大,约1.0×1.8cm,色暗灰到暗红。两组膀胱肿瘤组织切片见细胞结构排列较乱,胞体形态不规则,向肌层不同深度浸润,未突破将膜层,两组间差异不明显。Rt-PCR测mdrl表达两组间差异有显著性(Ptt检测耐药组裸鼠肿瘤细胞较敏感组对adm有明显的耐药性(Pt24／adm原位膀胱癌耐药模型,并仍具有多药耐药特性,为进一步对膀胱癌多药耐药的逆转研究奠定了基础。

关键词：人膀胱癌细胞阿霉素 t24/adm mdr-1基因原位膀胱癌裸鼠粘膜破坏细胞移植多药耐药模型裸鼠原位膀胱癌 t24/adm

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α-干扰素联合环孢霉素A对t24/adm细胞耐药逆转的研究

α-干扰素联合环孢霉素A对T24/ADM细胞耐药逆转的研究

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作者：郭祥山西医科大学

学位级别：硕士

目的：检测t24/adm细胞的多药耐药性。确定环孢霉素A对t24/adm细胞的非毒性剂量逆转范围。探讨单独逆转组（α-干扰素或环孢霉素A）和联合逆转组（α-干扰素和环孢霉素A）对t24/adm细胞的逆转作用。方法：复苏培养t24、t24/adm细胞，... 详细信息

目的：检测t24/adm细胞的多药耐药性。确定环孢霉素A对t24/adm细胞的非毒性剂量逆转范围。探讨单独逆转组（α-干扰素或环孢霉素A）和联合逆转组（α-干扰素和环孢霉素A）对t24/adm细胞的逆转作用。方法：复苏培养t24、t24/adm细胞，Mtt法检测其耐药性，流式细胞术检测t24、t24/adm细胞P-gp的表达率。Mtt法检测不同浓度环孢霉素A对t24/adm细胞的毒性作用。分别以不同浓度梯度环孢霉素A（0.1、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0μg/ml）加入到t24/adm测定其细胞抑制作用并确定其非毒性浓度。Mtt法测定单独逆转组（环孢霉素A或干扰素-α）和联合逆转组（环孢霉素A和干扰素-α）对t24/adm细胞的抑制率，流式细胞术检测t24/adm细胞P-gp的表达率。结果：1.检测t24/adm耐药性。实验组阿霉素对t24细胞的IC5=1.84μg/ml，对t24/adm细胞IC50=7.25μg/ml，RI=3.94，析因方差分析各浓度间差异具有统计学意义（P＜0.05）。 2.环孢霉素A浓度为4.0μg/ml时，对t24/adm细胞生长抑制率为（4.27±0.71）%,环孢霉素A浓度≤4.0μg/ml对t24/adm细胞无明显细胞毒作用（细胞生长率≥95%时的浓度作为非细胞毒性剂量），因此把环孢霉素A浓度≤4.0μg/ml作为逆转非细胞毒性剂量范围。 3.测定单独逆转组、联合逆转组对t24/adm细胞的逆转作用。当CsA浓度为1.0μg/ml时,其对t24/adm细胞的抑制率（18.8±0.027）%（P＜0.01）。当tNF-α浓度为4.0×106u/l,其对t24/adm细胞的抑制率（37.8±0.025）%（P＜0.01）。当浓度为2.0×106U/L的INF-α联合浓度为0.1μg/ml的CsA时其对t24/adm细胞的抑制率（38.4±0.025）%（P＜0.01），就与浓度为2.0μg/ml的CsA单独逆转效果相当。CsA联合tNF-α时比单独使用一种有更好的效果，且呈明显剂量效应关系,二者联合应用，呈协同效应。 4.α-干扰素和环孢霉素A对t24/adm细胞P-gp表达率的影响。CsA实验组与对照组相比，对t24/adm细胞P-gp表达率差异无统计学意义（P＞0.05），CsA不影响t24/adm细胞P-gp的表达。tNF-α实验组与对照组相比，对t24/adm细胞P-gp表达率差异无统计学意义（P＞0.05），tNF-α也不影响t24/adm细胞P-gp的表达。当CsA+tNF-α联合实验组与对照组相比，对t24/adm细胞P-gp表达率差异也无统计学意义（P＞0.05），两者联合也不影响t24/adm细胞P-gp的表达率。结论：***与tNF-α均可不同程度逆转t24/adm细胞的耐药性。 ***与tNF-α联合使用逆转效果好于单独使用，两者呈协同作用。 ***和tNF-α无论是单独还是联合均不影响t24/adm细胞P-gp的表达。

关键词： t24/adm 多药耐药 CsA α-干扰素

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环孢霉素A联合苦参碱逆转t24/adm细胞耐药性的研究

环孢霉素A联合苦参碱逆转T24/ADM细胞耐药性的研究

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作者：闫明山西医科大学

学位级别：硕士

膀胱肿瘤是泌尿生殖系统最常见的肿瘤,占男性肿瘤的6%,病因尚不完全清楚,但与环境、吸烟、及遗传因素有关,其中表浅性肿瘤占绝大部分。目前膀胱肿瘤的治疗手段仍以手术、化疗、放疗及免疫辅助治疗为主,术后给予膀胱内灌药是预防肿瘤复... 详细信息

膀胱肿瘤是泌尿生殖系统最常见的肿瘤,占男性肿瘤的6%,病因尚不完全清楚,但与环境、吸烟、及遗传因素有关,其中表浅性肿瘤占绝大部分。目前膀胱肿瘤的治疗手段仍以手术、化疗、放疗及免疫辅助治疗为主,术后给予膀胱内灌药是预防肿瘤复发的重要手段,然而进行化疗后,仍有45%-70%的复发率。术后较高复发率产生的原因,除膀胱肿瘤细胞自身所特有的生物学特性外,其主要原因是膀胱肿瘤细胞多药耐药（Multi-drug resistance,MDR）的产生。许多研究已证实环孢霉素A （Cyclosporine A,CsA）能逆转肿瘤细胞的多药耐药性,但CsA是一种强的免疫抑制剂,可使本来免疫力低下的肿瘤病人抵抗力进一步降低,导致重度感染,且其严重的肾脏损害影响了临床的应用,现在多采用与其他逆转剂联合,降低药物浓度以减少其副作用,而中药具有成本低、组织毒性小、安全范围大、广谱性强、作用靶点多的优势,已成为肿瘤逆转剂研究的热点,近年,已有研究证实苦参碱（Matrine,MAt）具有肿瘤逆转作用,因此,本研究采用CsA和中药MAt联合逆转膀胱肿瘤的耐药性。第一部分膀胱肿瘤t24/adm耐药细胞的耐药性检测目的:复苏膀胱肿瘤t24/adm细胞并检测其耐药性方法:将本导师组冻存的膀胱肿瘤t24细胞与膀胱肿瘤t24/adm细胞进行复苏,复苏成功后加入阿霉素（adm）培养,倒置显微镜下观察细胞形态变化及生长情况,Mtt法检测细胞对药物的耐受性,流式细胞术检测P-gp的表达情况。结果:t24/adm耐药细胞在形态上比t24细胞略大,核浆比例失调。加入adm后,同浓度adm作用下t24/adm比t24细胞存活多,组间差异具显著性,P＜0.01。t24/adm细胞P-gp表达显著增高,t24表达不明显,差异具有显著性,P＜0.01。结论:本导师组建立膀胱肿瘤t24/adm耐药细胞保持着其耐药性。第二部分环孢霉素A（CsA）联合苦参碱（MAt）对膀胱肿瘤t24/adm细胞耐药性的逆转及P-糖蛋白表达的影响目的:探讨CsA与MAt单独及联合应用对膀胱肿瘤t24/adm细胞耐药性的逆转作用及P-gp表达的影响。方法:Mtt法检测CsA与MAt单独及联合应用对t24/adm细胞耐药性的逆转效应,流式细胞术检测耐药细胞P-gp的表达。结果:非细胞毒性剂量的CsA和MAt均能显著降低adm对t24/adm的IC50（p＜0.01）,且当二者联合应用时,逆转效果明显好于二者单独应用（p＜0.01）,逆转倍数大于二者之和。 t24/adm+CsA组与t24/adm组相比,t24/adm细胞的P-gp表达率差异无统计学意义（P＞0.05）,t24/adm+MAt组与t24/adm组相比,t24/adm细胞P-gp表达率明显降低（P＜0.01）,当非细胞毒性剂量的两药联合应用后,对t24/adm细胞P-gp的表达有显著的抑制作用（P＜0.01）。结论:CsA与MAt均可逆转t24/adm细胞的耐药性,且当两者联合应用时,呈协同效应。

关键词：膀胱肿瘤 t24/adm 耐药 P-gp 环孢霉素A 苦参碱逆转

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