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应用tail-PCR扩增蓝猪耳t-dna侧翼序列

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应用与环境生物学报 2009年第6期15卷 871-874页

作者：侯雷平王小菁李洪清李梅兰华南师范大学生命科学院广东省植物发育生物工程重点实验室广州510631 山西农业大学园艺学院太谷030801

蓝猪耳是一种重要的具有观赏和科研价值的花卉植物.采用tAIL-PCR成功扩增了转基因蓝猪耳t-dna插入位点的侧翼序列,扩增片断长度为200～2000bp,大多数片段在400bp和800bp左右,其中36%的序列含有植物的同源序列.通过与GenBank数据库比对,... 详细信息

蓝猪耳是一种重要的具有观赏和科研价值的花卉植物.采用tAIL-PCR成功扩增了转基因蓝猪耳t-dna插入位点的侧翼序列,扩增片断长度为200～2000bp,大多数片段在400bp和800bp左右,其中36%的序列含有植物的同源序列.通过与GenBank数据库比对,确定了部分t-dna插入位点周边序列编码的可能蛋白,并提交序列7条;另外还对t-dna转化植物时整合的位点进行了分析,发现断裂位点集中在距右边界15～18bp和右边界外234bp处,分别占总扩增片段的47.62%和38.10%.这为利用t-dna标签进行蓝猪耳基因克隆和功能分析提供了实验技术上的保证.

关键词：蓝猪耳 tAIL-PCR t-dna 整合位点侧翼序列

t-dna transfer and integration as a tool for insertional mutagenesis in the taxol-producing fungus

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High technology Letters 2008年第1期14卷 92-97页

作者：迟彦 Ping Wenxiang Li Shanshan Zhu Jing Ma Xi Gao Fengshan Zhou Dongpo Key Laboratory of Microbe Heilongjiang University Harbin 150080 P.R. China Key Laboratory of Bio-organic Chemistry Dalian University Dalian 116622 P. R. China

Agrobacterium tumefaciens-mediated dna transformation method was applied to transformNodulisporium sylviforme fusant HDF-68,a taxol-producing fungus.We constructed a binary vectorpBI121-43 carrying a hygromycin-resistant gene cassette between the right and left borders of t-dna.Optimal co-cultivation of N.sylviforme with A.turnefaciens containing pBI121-43 led to 110～130 hy-gromycin-resistant transformants per million conidia.Putative transformants were found to be mitoticallystable.the molecular analysis of transformants demonstrated the random integration of single copy of thet-dna into the host genome.this transformation system serves as a basic tool for insertional mutagenesisin N.sylviforme fusant HDF-68,and the development of such system lays a solid foundation for con-structing high-yied gene engineering strain and clarifying taxol biosynthesis pathway in this fungus.

关键词：紫杉酚 t-dna 突变现象真菌

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农杆菌t-dna传递相关基因研究进展

分子植物育种 2017年第5期15卷 1752-1761页

作者：王根平张婷师志刚程汝宏国家谷子改良中心河北省农林科学院谷子研究所河北省杂粮研究实验室石家庄050035

农杆菌已广泛应用于单、双子叶植物的遗传转化。t-dna的传递是农杆菌介导转化的分子基础。t-dna的传递是一个复杂的过程,与ti质粒毒性区基因(Vir)、农杆菌染色体上毒性相关基因(chv)有关,另外植物体内部分基因也参与t-dna的传递。t-dna... 详细信息

农杆菌已广泛应用于单、双子叶植物的遗传转化。t-dna的传递是农杆菌介导转化的分子基础。t-dna的传递是一个复杂的过程,与ti质粒毒性区基因(Vir)、农杆菌染色体上毒性相关基因(chv)有关,另外植物体内部分基因也参与t-dna的传递。t-dna传递时在VirD1-VirD2蛋白的作用下形成t链,进一步形成t复合物,经农杆菌四型分泌系统(type IV secretion system,t4SS)穿过细菌和植物细胞膜,运输到植物细胞胞质。进入植物细胞的t复合物在植物相关蛋白的作用下经核运输和t链的整合,最终整合到植物基因组。本研究从农杆菌对植物细胞的识别和附着、农杆菌对植物信号的感知和Vir基因的活化、t链的形成、t-复合物的运输、t链进入植物细胞后的核运输和t链的整合机制及相关基因作了详细综述,探讨了农杆菌转化机制研究中的问题,对今后农杆菌转化机制研究做了展望。

关键词：遗传转化农杆菌 t-dna Vir基因

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影响t-dna转移的寄主植物细胞因子

植物生理学通讯 2004年第4期40卷 521-526页

作者：赵文锋杨清陈敏南京农业大学生命科学学院作物遗传与种质创新国家重点实验室南京210095

在农杆菌介导的植物遗传转化过程中,寄主细胞因子参与农杆菌细胞与寄主细胞的识别与附着、毒性基因的表达以及t-dna的跨膜运输和整合等过程。文章就这几方面的研究进展进行了综述。

关键词：植物遗传转化农杆菌寄主细胞因子 t-dna 跨膜运输

水稻剑叶突变体的表型及t-dna旁邻基因分析

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植物科学学报 2017年第5期35卷 708-715页

作者：刘航卢寰罗利朱木兰上海大学生命科学学院上海200444 中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所上海200032

从已构建的水稻(Oryza sativa L.)t-dna插入突变体中鉴定获得一株穗部额外发育出叶片的突变体,并根据该叶片的形态学位置将其命名为剑叶突变体(J4)。研究表明这种额外发育的叶片呈现明显的缺陷,主要表现为叶片短小、表皮细胞变小、叶片... 详细信息

从已构建的水稻(Oryza sativa L.)t-dna插入突变体中鉴定获得一株穗部额外发育出叶片的突变体,并根据该叶片的形态学位置将其命名为剑叶突变体(J4)。研究表明这种额外发育的叶片呈现明显的缺陷,主要表现为叶片短小、表皮细胞变小、叶片中维管束数目减少等。进一步通过tAIL-PCR和inverse-PCR的方法克隆该突变体中t-dna插入位置的旁邻序列,从而准确地将t-dna定位到2号染色体上。基因表达分析显示,t-dna插入位置附近的AK100376基因在J4突变体以及表型类似突变体neck leaf 1中的表达均被明显下调,可初步将其确定为与剑叶突变体表型相关的候选基因。

关键词：水稻剑叶 tAIL-PCR t-dna 旁邻序列

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黄瓜t-dna插入突变体库的构建

南京农业大学学报 2016年第1期39卷 40-47页

作者：李蕾李季孟永娇张璐娄群峰钱春桃陈劲枫南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室/园艺学院江苏南京210095

[目的]为了进一步研究黄瓜基因的功能,本文构建了黄瓜t-dna插入突变体库。[方法]以黄瓜栽培品种‘长春密刺’子叶节为转化外植体,通过农杆菌介导的遗传转化方法,将t-dna插入突变载体pROK2后转化黄瓜;通过筛选压力梯度试验,确定遗传转化... 详细信息

[目的]为了进一步研究黄瓜基因的功能,本文构建了黄瓜t-dna插入突变体库。[方法]以黄瓜栽培品种‘长春密刺’子叶节为转化外植体,通过农杆菌介导的遗传转化方法,将t-dna插入突变载体pROK2后转化黄瓜;通过筛选压力梯度试验,确定遗传转化体系最适合的卡那霉素(Kan)筛选浓度;使用PCR检测和斑点杂交方法鉴定t0和t1代转化植株;以‘长春密刺’植株为对照,统计t1代植株表型。[结果]确定100 mg·L-1为最适合的Kan抗性芽筛选浓度。t0代植株PCR检测结果初步证明,pROK2成功整合到14S1和14S2两个t0代株系基因组中。14S1自交后获得55个t1代单株,对其进行PCR检测,发现其中12个单株均扩增出了35S和NPt-Ⅱ片段。以Dig标记的35S和NPt-Ⅱ为探针,对这12个单株及随机从剩余t1代中选取的11个单株进行斑点杂交检测,得到了2个含有35S和NPt-Ⅱ杂交信号的单株:14S1-27和14S1-34。性状调查统计显示:t1代植株在生长各阶段相对于野生型无明显突变表型。[结论]pROK2重组质粒成功整合到了14S1株系的基因组中。对14S1自交后代的PCR检测和斑点杂交检测结果进一步证明了14S1为转化植株,确定14S1为插入突变体。结合t-dna插入位点鉴定技术可进一步开展相关基因分离及功能研究工作。

关键词：黄瓜 t-dna 插入突变转基因 pROK2载体

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产黄青霉简单高效遗传转化法——电激转化法

中国抗生素杂志 2014年第9期39卷 651-653页

作者：李树强仪修南贾亚娟张春晓河北科技大学生物科学与工程学院石家庄050018 山东大学生命科学学院济南250100

目的研究产黄青霉(P.chrysogenum)电激转化方法,建立产黄青霉快速、高效的遗传转化方法。方法应用美国Bio-Rad电转仪,将外源dna转化入产黄青霉菌丝中,研究了菌丝培养时间、电场强度、dna类型等对遗传转化的影响。结果菌丝培养24h,处于... 详细信息

目的研究产黄青霉(P.chrysogenum)电激转化方法,建立产黄青霉快速、高效的遗传转化方法。方法应用美国Bio-Rad电转仪,将外源dna转化入产黄青霉菌丝中,研究了菌丝培养时间、电场强度、dna类型等对遗传转化的影响。结果菌丝培养24h,处于旺盛生长阶段,电场强度为6000V/cm,电阻200Ω,电容20μF,环状质粒dna较线状能获得转化效率稍高,1μg dna获得的克隆数可达500个。结论应用电激转化方法对产黄青霉进行遗传转化属首次报道,特别是可直接将目的片段与t-dna相融合,转化入产黄青霉中,该方法操作简单,快速高效。

关键词：产黄青霉电激转化菌丝 t-dna

大丽轮枝菌致病缺陷型t-dna插入突变体的筛选与鉴定

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棉花学报 2018年第1期30卷 29-37页

作者：崔伟业周雷单柳颖张君戴小枫郭维中国农业科学院农产品加工研究所北京100193

【目的】从大丽轮枝菌t-dna突变体库中筛选鉴定致病缺陷型突变体并分析致病相关基因。【方法】将落叶型大丽轮枝菌菌株Vd991的294个t-dna插入突变体在寄主棉花上进行致病力测定。利用Southern杂交和hitAIL-PCR(High-efficiency thermal ... 详细信息

【目的】从大丽轮枝菌t-dna突变体库中筛选鉴定致病缺陷型突变体并分析致病相关基因。【方法】将落叶型大丽轮枝菌菌株Vd991的294个t-dna插入突变体在寄主棉花上进行致病力测定。利用Southern杂交和hitAIL-PCR(High-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR)技术分别对筛选获得的9个致病力显著降低的突变体进行拷贝数和侧翼序列分析。【结果】与接种野生型Vd991的棉花相比,接种突变体的棉花的病情指数极显著降低。Southern杂交表明其中1个突变体中t-dna为双拷贝插入,其余8个突变体均为单拷贝插入。生物学特性分析发现t-dna的插入导致这些突变体在生长速率和产孢量等方面与野生型Vd991相比均有不同程度的降低。Blast比对分析明确了这些突变体中t-dna的插入位置和在基因组上的分布,并从野生型菌株Vd991中成功克隆得到了这些可能影响大丽轮枝菌致病力的相关基因。【结论】筛选和鉴定t-dna插入突变是在全基因组范围内快速获得致病相关基因信息的1种有效方法,极大的促进了大丽轮枝菌的致病分子机制等研究,为进一步培育抗病棉花品种奠定了基础。

关键词：大丽轮枝菌致病力 t-dna hitAIL-PCR 侧翼序列分析

稻曲病菌致病力丧失突变菌株B-1015的t-dna标记基因的克隆

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中国农业科学 2014年第13期47卷 2552-2562页

作者：黄磊胡建坤俞咪娜于俊杰王亚会郑梦婷郑睿刘永锋南京农业大学生命科学学院江苏省农业科学院植物保护研究所

【目的】研究稻曲病菌(Ustilaginoidea virens)致病力丧失突变菌株B-1015,克隆和分析t-dna插入位点的侧翼序列,为稻曲病菌的致病机制研究提供参考。【方法】分析稻曲病菌t-dna插入突变体B-1015菌株的生长速率、产孢量、孢子萌发率以及... 详细信息

【目的】研究稻曲病菌(Ustilaginoidea virens)致病力丧失突变菌株B-1015,克隆和分析t-dna插入位点的侧翼序列,为稻曲病菌的致病机制研究提供参考。【方法】分析稻曲病菌t-dna插入突变体B-1015菌株的生长速率、产孢量、孢子萌发率以及致病力等生物学表型。用PCR检测t-dna在B-1015基因组中插入的稳定性,用Southern杂交检测t-dna插入的拷贝数,用hitail-PCR扩增t-dna侧翼序列,用RACE PCR克隆t-dna标记基因,半定量Rt-PCR分析所克隆基因的表达情况。【结果】与野生菌株P1相比,突变菌株B-1015的生长速率和产孢量都有较明显的降低,孢子萌发率无明显差异,致病力丧失。分子检测结果表明t-dna在B-1015基因组中为稳定的单拷贝插入。hitail-PCR得到的t-dna两端侧翼序列在野生型菌株基因组上不相连,RACE PCR在两边的侧翼序列上分别克隆得到Uvt-1015R和Uvt-1015L。预测分析表明Uvt-1015R包含一个长度为948 bp的开放阅读框(open reading frame finder,ORF),可编码295个氨基酸,5′端非编码区(5′-untranslated regions,5′-UtR)长度为341 bp,3′端非编码区(3′-untranslated regions,3′-UtR)长度为271 bp。Uvt-1015L包含一个长度为351 bp的ORF,可编码116个氨基酸,5′-UtR为31 bp,3′-UtR长度为174 bp。在已知功能的蛋白中检索,没有发现与Uvt-1015R和Uvt-1015L基因同源的蛋白。序列分析发现t-dna插入在两个基因序列中间,Rt-PCR结果显示,在突变菌株B-1015中,Uvt-1015R表达量下降,Uvt-1015L不表达。【结论】稻曲病菌突变菌株B-1015致病力等重要生物学表型发生改变,可能是由于t-dna的插入导致了B-1015基因组重排和Uvt-1015R、Uvt-1015L基因结构的破坏。

关键词：稻曲病菌致病力 t-dna 基因克隆