检索结果-南通市图书馆

t-dna介导的基因诱捕技术及其在植物功能基因组学研究中的应用

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

植物学通报 2008年第1期25卷 112-120页

作者：杨珍珍李萍王崇英兰州大学生命科学学院细胞生物学研究所兰州730000

t-dna介导的基因诱捕技术是近年来发展起来的鉴定和分离基因的方法。在拟南芥和水稻基因组测序已经完成的今天,该技术将在两者基因功能的研究中扮演举足轻重的角色。本文就t-dna介导的基因诱捕系统、基因克隆和突变体库构建的研究进展... 详细信息

t-dna介导的基因诱捕技术是近年来发展起来的鉴定和分离基因的方法。在拟南芥和水稻基因组测序已经完成的今天,该技术将在两者基因功能的研究中扮演举足轻重的角色。本文就t-dna介导的基因诱捕系统、基因克隆和突变体库构建的研究进展及其在植物功能基因组学上的应用等内容进行了综述,并讨论了该技术应用中的一些问题。

关键词：功能分析基因鉴定基因诱捕突变体库 t-dna

农杆菌介导的黄瓜遗传转化体系优化及t-dna插入突变体的创制与鉴定

维普期刊数据库

同方期刊数据库评论

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

农杆菌介导的黄瓜遗传转化体系优化及T-DNA插入突变体的创制与鉴定

作者：冯路路南京农业大学

学位级别：硕士

黄瓜(Cucumis sativus L.)是葫芦科甜瓜属的一种重要的园艺和经济作物,具有悠久的栽培历史。在生产中由于生物胁迫和非生物胁迫的存在,对栽培黄瓜的产量、品质都造成很大程度的影响,因此为保障黄瓜产量和品质需要不断进行选育黄瓜新品... 详细信息

黄瓜(Cucumis sativus L.)是葫芦科甜瓜属的一种重要的园艺和经济作物,具有悠久的栽培历史。在生产中由于生物胁迫和非生物胁迫的存在,对栽培黄瓜的产量、品质都造成很大程度的影响,因此为保障黄瓜产量和品质需要不断进行选育黄瓜新品种。然而传统黄瓜育种方式由于其育种年限长、抗性基因较少、效率较低等因素,很难快速得到满足人们需求的优良品种。转基因技术是现代分子育种的重要手段,其在解析基因功能、基因工程育种以及基因组编辑等方面都发挥着重要作用。农杆菌介导的遗传转化法是黄瓜转基因技术中应用最为普遍和广泛的,但目前该方法的转化效率仍待进一步优化。本研究从农杆菌自身活力、共培养温度、农杆菌侵染液浓度和共培养时间等方面对农杆菌介导的黄瓜遗传转化体系进行优化,通过数据统计确定了最优转化条件。随着黄瓜研究在分子水平上的深入发展,越来越多具有重要功能的基因被定位并克隆出来,基因功能的研究也愈发重要。突变体与其相应的突变基因之间密切相关,可以直接有效的用于基因功能研究。而黄瓜因其遗传基础狭窄、自然变异频率很低,自发突变体的获得概率极低。因此人为创制突变体进行重要功能基因研究逐渐成为趋势。突变体创制方法包括物理诱变、化学诱变以及插入突变等多种方法,插入突变中的t-dna插入突变具有可以研究无表型的基因、易得到插入突变位点、突变位点较少等多个优点,对于突变体的创制及基因功能研究较为适合。本研究利用GFP报告基因对黄瓜遗传转化体系进行优化,并进行黄瓜t-dna插入突变体的创制工作。研究结果如下:1.农杆菌介导的黄瓜遗传转化体系优化在本实验室已经建立的农杆菌介导的黄瓜子叶节遗传转化体系的基础上,通过测定农杆菌C58的生长曲线,确定选取培养12～18 h的菌液制备侵染液。从共培养温度、共培养时间和农杆菌侵染液浓度等方面,对黄瓜遗传转化体系进行优化。结果发现,当共培养温度为23℃时,外植体再生率达到最高的31.70%,阳性诱导率达到最高的2.26%;将侵染液浓度和共培养时间联合处理,当侵染液OD值为0.1和共培养时间为7 d时,外植体再生率达到最高的40.13%,而不同处理的外植体阳性诱导率并没有显著差异。综上,本研究得到了选取培养12-18 h的菌液制备侵染液,共培养温度为23℃的优化的遗传转化体系。2.黄瓜t-dna插入突变体的创制及快速鉴定利用优化的黄瓜遗传转化体系,以pGreen0029植物表达载体为t-dna插入载体进行黄瓜t-dna插入突变体的创制。利用GFP荧光鉴定、PCR和tAIL-PCR方法对t0代植株进行鉴定。利用GFP荧光观察在外植体分化阶段就开始进行阳性植株筛选,从2978个转化外植体中筛选出3株表达GFP信号的阳性芽;PCR鉴定结果表明t0代转化植株的基因组中整合了载体序列;利用tAIL-PCR方法进行t-dna侧翼序列扩增,初步确定了突变体t-dna-PG-1的t-dna插入位点;根据t-dna插入位点设计特异性引物进行PCR检测,对tAIL-PCR结果得到证实。综上,本研究得到了成功转入t-dna载体的黄瓜突变体,并通过tAIL-PCR技术确定了黄瓜突变体t-dna-PG-1的突变位点。

关键词：黄瓜遗传转化体系优化 t-dna tAIL-PCR

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

水稻激活标签系t-dna侧翼序列分析

水稻激活标签系T-DNA侧翼序列分析

作者：吕亚慈河北农业大学

学位级别：硕士

水稻(Oryza sativa L．)是最重要的粮食作物之一，水稻基因组与其他禾本科植物基因组具有良好的共线性，是单子叶植物基因组研究的模式植物。2002年12月国际水稻基因组测序计划已圆满完成，鉴定水稻基因的功能己成为水稻功能基因组学研... 详细信息

水稻(Oryza sativa L．)是最重要的粮食作物之一，水稻基因组与其他禾本科植物基因组具有良好的共线性，是单子叶植物基因组研究的模式植物。2002年12月国际水稻基因组测序计划已圆满完成，鉴定水稻基因的功能己成为水稻功能基因组学研究的重点内容。通过对突变体的研究确定基因功能是一种最常用而又有效的方法。t-dna或转座子产生插入突变是建立突变体库的一种重要手段。本研究在已经构建了大规模的水稻基因激活标签突变体库的基础上，优化了PCR-Walking侧翼序列的分离方法，并对该激活标签群体和因组织培养而被激活转座的水稻内源转座子tosl7的侧翼序列进行分析。通过对激活标签系的Rt-PCR分析，表明激活标签载体PER38在水稻功能基因组研究中具有重要作用。得到主要结果如下：1．对水稻侧翼序列分离的PCR-Walking方法进行了改进，酶切和连接被合并在一个步骤中进行，节省了操作时间，并且不影响PCR的效率。改变了接头(ADAl)的一些核苷酸，减少接头和水稻基因组序列的同源性，同时降低引物间的二聚体产生的概率。将第二次PCR反应体系20μL调整到40μL，既保证了扩增效率又利于dna回收和序列测定，使扩增效率最高可达87.39％，为大通量的侧翼序列扩增分离奠定了良好的基础。2．通过对标签插入模式的研究，分析插入标签在水稻12条染色体上的分布，结果表明激活标签载体PER38和水稻内源转座子tosl7均倾向于插入较大的染色体。对标签插入热点和冷点分析，基因区是t-dna和tosl7插入热点，重复区是t-dna和tosl7插入的冷点。在功能基因的分布中，t-dna和tosl7插入参与细胞代谢类型的基因比例最高，分别占了44.66％和34.20％，其次是抗病防卫基因，插入转录因子的比例最小为4.04％和3.90％。这些数据得出为水稻基因组信息数据库提供更加丰富的信息资源。水稻t-dna插入突变体的表型分析为水稻基因功能的研究提供了重要线索，突变体的侧翼序列分析将有助分离重要农艺性状的相关基因。3．通过激活标签系的Rt-PCR的分析，与野生型比较，在检测的10个基因中有6个基因明显被激活表达，其t-dna的插入位点在距离基因上游或下游1.0～4.0Kb内，表明该载体的35S增强子确实起到激活基因表达的作用。PER38载体系统具有激活标签系统的一系列优点，它在功能基因组学研究中具有重要价值。

关键词：水稻 t-dna tosl7 激活标签

土壤杆菌t-dna在植物细胞分化和发育研究中的应用

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

生物技术通报 1994年第5期10卷 6-8页

作者：邵宏波初立业四平师范学院生物工程研究所

七十年代末期以来,由于分子生物学理论与方法的日趋完善,已使细胞生物学在各个领域中取得了惊人进展,细胞生物学已经进入了所谓的“分子细胞生物学”发展阶段。在众多分子生物学方法中,植物基因转移技术格外引人注目,并对推动分子细胞... 详细信息

七十年代末期以来,由于分子生物学理论与方法的日趋完善,已使细胞生物学在各个领域中取得了惊人进展,细胞生物学已经进入了所谓的“分子细胞生物学”发展阶段。在众多分子生物学方法中,植物基因转移技术格外引人注目,并对推动分子细胞生物学的发展,尤其是有关基因表达调控、基因标记与分离、细胞分化与发育等重要领域起到了重要的作用。本文着重就土壤杆菌t-dna区的基因在植物细胞分化及发育研究领域中的应用作一概述。

关键词：分子细胞生物学 t-dna 植物基因根癌土壤杆菌细胞分化分子生物学方法基因转移技术基因表达调控标记基因启动子

水稻t-dna插入突变体相关农艺性状的比较研究及遗传分析

维普期刊数据库

同方期刊数据库评论

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

水稻T-DNA插入突变体相关农艺性状的比较研究及遗传分析

作者：胡景涛四川农业大学

学位级别：硕士

水稻是世界上主要的粮食作物,由于其在禾谷类作物中基因组最小,且具有易于体外操作与分化等优点,因此被确定为禾谷类作物功能基因组学研究的模式植物。随着水稻基因组测序的完成,后基因组（功能基因组和蛋白质组研究）时代的到来,研究... 详细信息

水稻是世界上主要的粮食作物,由于其在禾谷类作物中基因组最小,且具有易于体外操作与分化等优点,因此被确定为禾谷类作物功能基因组学研究的模式植物。随着水稻基因组测序的完成,后基因组（功能基因组和蛋白质组研究）时代的到来,研究人员利用不同的方法创建了大量的水稻突变体,尤其是近年来创建了大量的水稻t-dna插入突变体。这类突变体由于含有特定的t-dna序列,以这些特定的t-dna序列作为探测基因的标签,为分离特定功能的基因提供了方便。本研究通过对粳稻品种中花11的t-dna插入突变体库进行了筛选、鉴定和比较研究。主要结果如下: 1本研究对中花11 t-dna插入突变体库进行了田间性状调查和筛选,共获得了1071个表型变异的稳定株系,突变表型包括抽穗期、株高、叶色、叶形、株型、花发育以及粒形等突变体。对其中的450个株系进行了PCR分子检测,发现其中173个株系含有t-dna插入,占所检测单株的38.2%。 2根据性状调查结果,初步将突变体分为单一性状突变体和综合性状突变体。单一性状突变体主要表现为株高、抽穗期等4种单一性状的明显改变;综合性状突变体在株高、穗长或生育期等形状上表现出明显的综合变化。对部分t-dna突变体两季调查数据的对比发现:0700、0683、0719和0720四份材料所调查性状在温江和海南表现一致,0684和0723的株高和穗长性状在温江和海南表现出较大差异。 3对早衰材料P1413的研究表明,与中花11相比,突变体的根在苗期表现为数量少,且褐色根偏多。对P1413叶片基因组dna的电泳分析表明其dna的确发生了不同程度的降解,叶片细胞的电镜观察也表明P1413的细胞内含物发生了降解,从而证明P1413发生了早衰。性状调查数据表明,P1413的千粒重、穗长和株高等性状与中花11之间存在显著差异。 4从t-dna突变体库中获得一份以中花11为遗传背景的白色中脉突变体。该突变体剑叶以下叶片的中脉表现为白色,白色中脉附近的叶色微黄,暂时将其定名为Oswm2（Oryza sativa white midrib 2）。性状调查数据表明:与中花11相比,除单株有效穗有所增加外,Oswm2的穗长缩短,每穗总粒数减少,株高、着粒密度、千粒重和结实率都不同程度的降低。t检验表明,除单株有效穗外,突变体Oswm2的株高等其它主要农艺性状和对照中花11的相应性状之间都存在极显著差异。遗传分析表明该突变性状受一对隐性单基因控制,以Oswm2和粳稻02428杂交的F2分离群体作为定位群体,将OsWM2基因定位在水稻第7染色体的SSR标记RM21478和RM418之间,遗传距离分别为8.7和15.9cM。

关键词：水稻 t-dna 插入突变体早衰基因定位

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

t-dna插入麝香百合的研究

安徽农业科学 2008年第18期36卷 7581-7582页

作者：李刚刘菊华谭光兰徐碧玉金志强中国热带农业科学院生物技术研究所海南海口571101

[目的]获得麝香百合转基因植株。[方法]采用2步外植体法和农杆菌介导的t-dna插入技术转化麝香百合。[结果]菌液浓度OD600值为0．6～0．8时浸染效果好，同时附加250mg／L的AS可以提高转化效率，50mg／L G418为抗性筛选最适浓度。对经过... 详细信息

[目的]获得麝香百合转基因植株。[方法]采用2步外植体法和农杆菌介导的t-dna插入技术转化麝香百合。[结果]菌液浓度OD600值为0．6～0．8时浸染效果好，同时附加250mg／L的AS可以提高转化效率，50mg／L G418为抗性筛选最适浓度。对经过抗性筛选的百合转化植株进行PCR分子检测，部分转基因植株呈阳性，初步证明t-dna已插入到百合基因组中。[结论]该研究为利用t-dna插入技术筛选优良的百合新品种奠定了基础。

关键词：麝香百合农杆菌介导法 t-dna 插入突变

稻曲病菌t-dna插入突变体B1812、B1241侧翼基因克隆及Uvt-726互作因子的筛选

维普期刊数据库

同方期刊数据库评论

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

稻曲病菌T-DNA插入突变体B1812、B1241侧翼基因克隆及Uvt-726互作...

作者：薄惠文南京农业大学

学位级别：硕士

稻曲病是发生在水稻穗部的一种真菌病害,其病原菌稻曲病菌(Ustilaginoidea virens)可侵染水稻小花,形成的稻曲球严重危及水稻的产量和稻米的品质,进而危害人类和家畜的健康。基于对稻曲病菌的形态、分离技术、孢子萌发、侵染机制等方面... 详细信息

稻曲病是发生在水稻穗部的一种真菌病害,其病原菌稻曲病菌(Ustilaginoidea virens)可侵染水稻小花,形成的稻曲球严重危及水稻的产量和稻米的品质,进而危害人类和家畜的健康。基于对稻曲病菌的形态、分离技术、孢子萌发、侵染机制等方面的研究,目前对于水稻稻曲病的防治已经取得了一些进展,然而由于稻曲病菌的致病机制仍不明确,尚不能从根本本上防治该病害。研究稻曲病菌的致病机制,有助于深入认识和有效防控稻曲病的发生,同时对于水稻抗稻曲病品种的选育具有一定的指导意义。利用农杆菌介导的转化技术(AtMt,Agrobacterium-mediated transformation technology)对病原菌进行遗传改造,再通过表型筛选进行基因功能的研究已经成为一种简便有效的方法。本实验室前期通过AtMt构建了稻曲病菌P1的突变体库,本研究以从中筛选得到致病力减弱菌株B1812和B1241为研究材料,观察它们的生物学特性及致病情况,通过基因克隆的手段获得了 t-dna插入位点侧翼基因,并初步研究了基因的功能,为研究稻曲病菌的致病机制提供了一定的理论基础。1.稻曲病菌P1的t-dna插入突变菌株B1812,其致病力、液体摇培产分生孢子能力与野生菌株P1相比明显下降,且孢子明显小于P1。而在固体培养基PSA和tB3菌落形态和生长速率与P1相比无显著差异,在MM上的生长速率下降。突变菌株B1812在不含潮霉素的PSA平板上转接5代之后,仍能扩增到HPH基因,说明t-dna已经稳定地插入到B1812的基因组中。Southern杂交表明t-dna在该突变菌株的基因组中为单拷贝。序列比对显示,侧翼基因UvHac1与UV-8b菌株中的UV8b075同源。UvHac1全长共2196bp,编码蛋白为转录激活因子Hac1,其中ORF为1690bp,含有一个70 bp的内含子,编码539个氨基酸。5’非编码区长为360 bp,3’非编码区长为146 bp。分析插入位点侧翼序列发现,突变菌株B1812的基因组在t-dna插入位点处缺失了 42 bp。t-dna插入在UvHac1的5’UtR区,距起始密码子46 bp。qRt-PCR分析显示该基因表达量显著下降。经NCBI同源性比对,UvHac1编码蛋白Hac1含有一个高度保守的结构域bZIP。2.致病力减弱突变菌株B1241在固体培养基MM、PSA和tB3上的菌落形态、生长速率,以及液体摇培产生的分生孢子形态等与P1相比无显著差异,但分生孢子能力呈极显著下降。t-dna已经稳定地插入到B1241的基因组中且为单拷贝。经序列比对发现,突变体中t-dna插入位点处少了 28 bp的稻曲病菌基因组序列,有37bp的序列在t-dna及稻曲病菌基因组中都没有比对到。侧翼基因UvGH18与UV-8b菌株的UV8b-7878同源,开放阅读框长2317 bp,包含81 bp和106 bp的两个内含子,编码709个氨基酸。UvGH18基因全长2650bp,5·非编码区长度为14bp,3·非编码区长度为319 bp。t-dna插入在UvGH18的启动子区域,位于起始密码子之前516 bp处。qRt-PCR得知,突变体中UvGH18的表达量下降。UvGH18编码的糖基水解酶18家族蛋白(GH18)含有一个保守结构域D××D×D×E。酵母双杂交筛选稻曲病菌P1的cdna文库,得到4个可能与GH18互作的蛋白,分别为泛素类、小泛素相关修饰蛋白连接酶、海藻糖-6-磷酸合成酶/磷酸酶和细胞形态蛋白Sog2。3.Uvt-726是致病力减弱的t-dna插入突变菌株B726通过基因克隆得到的假定基因。为进一步探究致病相关基因Uvt-726的功能,本研究通过酵母双杂交技术筛选其互作蛋白。将目的基因Uvt-726连接至质粒pGBKt7构建诱饵质粒,并对诱饵蛋白进行了毒性及自激活检测。诱饵质粒和文库质粒分别转化进酵母菌株Y2H和Y187中进行杂交。诱饵蛋白与BD蛋白在二倍体酵母中融合表达,与稻曲病菌P1的cdna文库酵母中的捕获蛋白结合,从而激活下游报告基因的表达。通过DDO/X/A和QDO/X/A进行筛选,测序后与稻曲病菌全基因组进行比对,筛选得到4个Uvt-726的互作蛋白,包括AP-3复合物β亚基、RNA聚合酶II亚基A磷酸酶、寡糖转移酶Stt3亚基和ADP/AtP载体蛋白。

关键词：稻曲病菌致病力 t-dna 基因克隆酵母双杂交互作蛋白

t-dna转化介导水稻种子休眠特性和基因组结构的变化

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

T-DNA转化介导水稻种子休眠特性和基因组结构的变化

作者：朱苗湖南师范大学

学位级别：硕士

基于前期研究发现miR164c和miR168a参与水稻种子活力的调控,随后构建了水稻Kasalath的MIM164c、OE164c和MIM168a、OE168a转基因株系,结果发现这些t-dna突变体及同一t-dna突变体的不同株系间,其休眠特性和基因组结构也存在差异:1.种子的... 详细信息

基于前期研究发现miR164c和miR168a参与水稻种子活力的调控,随后构建了水稻Kasalath的MIM164c、OE164c和MIM168a、OE168a转基因株系,结果发现这些t-dna突变体及同一t-dna突变体的不同株系间,其休眠特性和基因组结构也存在差异:1.种子的萌发率检测结果表明,脱水处理能降低种子休眠程度;40℃去休眠处理5 d后种子萌发率进一步提高,但仍有少数种子存在休眠;自然贮藏5个月后,除株系L6-5-2的种子萌发率只有65%外,其他株系的种子萌发率都达到90%以上,但四类突变体及同一突变体的不同株系间种子的休眠特性皆存在差异。2.无论是新鲜种子还是去休眠种子,α-淀粉酶活性和可溶性蛋白含量与其休眠特性呈负相关。3.本研究发现,新鲜种子和去休眠处理的种子中,GA含量都高于ABA含量;且去休眠处理可增加种子中GA含量;GA和ABA含量与休眠特性无明显线性相关,但ABA/GA比值与种子休眠特性呈正相关。4.荧光定量PCR分析结果表明,在MIM164c和OE164c的新鲜种子中,miR164c在休眠程度高的种子中表达量低,但在去休眠处理的种子中表达量无规律;在MIM168a和OE168a的新鲜种子中,miR168a在休眠程度高的种子中表达量也低,在去休眠处理的种子中表达量皆上升。因此推测,miR168a表达与种子休眠程度负相关。5.目的片段的PCR验证分析表明,不同突变体株系外源t-dna在Kasalath(野生型)染色体上的插入位点各不相同。水稻基因组上插入位点的生物信息学分析表明,L6-5-2(MIM164c)的插入位点在基因Os09g0413700的启动子区域内,该基因与α/β水解酶折叠和表达相关;L18-20-3-1(MIM168a)的插入位点在Os03g0697600的启动子区域内,该基因为潜在的编码蛋白质的基因;LF-2-1(OE168a)的插入位点在Os08g0334900的CDS区域内,该基因与岩藻糖基转移酶和半乳糖苷2-α-L-岩藻糖基转移酶活性相关,参与细胞壁木葡聚糖生物合成过程;其他突变体株系的外源t-dna皆插入在受体Kasalath的基因间隔区。6.全基因组重测序结果表明,各突变体株系基因组的SNPs突变中碱基转换数量皆多于颠换数量;在c SNP的非同义突变中,突变数量变化最多的都是A(丙氨酸),突变数量变化最少的都是W(色氨酸)。在InDel突变中,各突变体材料的移码缺失突变数皆大于移码插入突变数。各材料特有的SNPs、InDels在12条染色体上呈不均匀分布,且多分布在1,3,4,6和11号染色体上。7.通过UniProt数据库查询到各突变体株系的特有突变基因的分子功能多与AtP结合、蛋白激酶活性和铁离子结合等有关,在同类型突变体的不同株系中,其特有基因的生物学功能有差异。不同突变体株系基因组的差异基因的KEGG主要富集在淀粉和蔗糖的代谢、二萜生物合成等通路;同类型不同株系的差异基因的KEGG富集通路也有差异。综上所述,水稻Kasalath的MIM164c、OE164c、MIM168a和OE168a转基因株系种子及同一类型突变体的不同株系种子的休眠特性皆存在差异;与miR164c相比,miR168a参与调控种子休眠特性的可能性更大;基因组重测序分析显示,不同t-dna转导获得的各突变体株系和同一t-dna转导获得的不同株系的基因组皆存在大量的SNPs和InDels等基因组结构的显著差异。以上结果为揭示水稻种子休眠特性的分子机制提供了新的依据和思路。

关键词：休眠 miR164c miR168a t-dna 全基因组重测序

哈茨木霉菌th-33t-dna插入突变体库的构建及表型突变株的分析

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

哈茨木霉菌Th-33T-DNA插入突变体库的构建及表型突变株的分析

作者：范亮波中国农业科学院

学位级别：硕士

哈茨木霉菌是重要的生防真菌,研究其生防相关功能基因对生防机制的认识及高效、稳定的木霉菌制剂的开发具有重要的意义。根癌农杆菌介导的t-dna标签法是研究基因功能的有效方法。本论文利用根癌农杆菌介导转化技术（AtMt）构建了哈茨木... 详细信息

哈茨木霉菌是重要的生防真菌,研究其生防相关功能基因对生防机制的认识及高效、稳定的木霉菌制剂的开发具有重要的意义。根癌农杆菌介导的t-dna标签法是研究基因功能的有效方法。本论文利用根癌农杆菌介导转化技术（AtMt）构建了哈茨木霉菌th-33的t-dna插入标签突变体库,并对t-dna插入突变株进行分析,取得了如下结果: 1.建立了哈茨木霉菌th-33 t-dna插入突变体库确立了稳定、高效的根癌农杆菌EHA105转化哈茨木霉菌th-33的遗传转化体系,（1）诱导条件:诱导培养前根癌农杆菌EHA105的OD600为0.20~0.30,乙酰丁香酮浓度200 mmol?L-1、pH值5.3,诱导时间6h;（2）共培养条件:共培养时农杆菌EHA105的OD600为0.60~0.80,哈茨木霉菌th-33分生孢子浓度为105个/mL ,乙酰丁香酮浓度200 mmol?L-1、pH值5.3,24℃共培养48h（3）选择培养条件:温度28℃,培养时间60h。在以上转化条件下,根癌农杆菌EHA105对哈茨木霉菌th-33的转化效率可达到80~200个转化子/106个分生孢子。利用该转化系统获得了2998株哈茨木霉菌th-33的潮霉素B抗性转化子。将这些转化子在无潮霉素B的培养基中连续培养三代后,再转接至含有潮霉素B的培养基中,有2956株抗性转化子仍可正常生长,因此可断定该转化系统的假阳性率较低,依此法所建的库中98%以上的抗性菌落为遗传稳定的抗性转化子。 2.从哈茨木霉菌th-33 t-dna插入突变体库中筛选产孢突变株对哈茨木霉菌th-33 t-dna插入突变体库中的1999株转化子进行培养和筛选,获得2株产分生孢子显著减少的突变株,编号分别为1413和446,它们在菌落形态、产分生孢子数量、分生孢子器形态等方面与野生型哈茨木霉菌th-33相比均发生了显著的变化,其中1413号突变株的产孢能力不足野生菌株的1/105,并且几乎不形成正常分生孢子器。 3.从哈茨木霉菌th-33 t-dna插入突变体库中筛选株拮抗突变株采用对峙培养的方法,分别对哈茨木霉菌th-33 t-dna插入突变体库中的1999株转化子的拮抗性能进行了测定,筛选出2株对黄瓜立枯丝核菌拮抗能力减弱的突变株和29株拮抗能力增强的突变株。与野生型哈茨木霉相比,拮抗能力增强突变株长满平板并使病原菌菌丝枯萎死亡的时间缩短了10～15h,拮抗能力减弱突变株长满整个平板的时间增长了25h,并且不能使病原菌枯萎死亡。 4.突变株分子生物学检测对筛选获得的突变株进行t-dna插入的PCR检测和southern杂交分析,结果表明,t-dna均已整合进木霉菌基因组中,其中1413号菌株为单拷贝插入产孢突变株,在所检测的突变株中单拷贝插入率为62.5%。 5.产孢相关基因的克隆与分析利用tAIL-PCR的方法克隆1413号突变株t-dna的两个侧翼序列,获得长3725bp的产孢相关序列,此序列经Genbank比对分析与染色体组装蛋白基因具有同源性,推测此序列与1413号菌株的产孢突变性状有关。

关键词：哈茨木霉突变体根癌农杆菌介导的转化（AtMt） t-dna