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水稻t-dna插入突变体库的构建及突变类型的分析

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Acta Genetica Sinica 2004年第12期31卷 1388-1394页

作者：闫双勇智庆文刘欣洁张红伟谭振波李仕贵北京市农林科学院农业生物技术研究中心四川农业大学水稻研究所温江611033 四川农业大学水稻研究所

利用农杆菌介导的转化系统转化中花 11成熟胚愈伤组织 ,获得 14 89个独立转化的t dna插入再生株系。PCR和Southern杂交的结果表明 ,6 9 8%转化株系被整合了t dna ,通过tail PCR也从转化植株中扩增出t dna侧翼序列。同时对 10 6 6个t1转... 详细信息

利用农杆菌介导的转化系统转化中花 11成熟胚愈伤组织 ,获得 14 89个独立转化的t dna插入再生株系。PCR和Southern杂交的结果表明 ,6 9 8%转化株系被整合了t dna ,通过tail PCR也从转化植株中扩增出t dna侧翼序列。同时对 10 6 6个t1转化株系的抽穗期、株高、单株穗数的调查结果表明 ,不同株系中分离出了突变植株。

关键词： t-dna插入突变整合抽穗期株高单株穗数

批量筛选水稻t-dna插入突变体库获得生殖发育相关突变体

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华中农业大学学报 2012年第2期31卷 133-138页

作者：裴荣陆展华姚家玲华中农业大学生命科学技术学院武汉430070 华中农业大学园艺林学学院武汉430070

针对花器官形态和种子发育突变表型对大型水稻t-dna插入突变体库进行筛选,获得了大量突变体信息及材料,在9 760个突变体家系中筛选得到177个花器官形态和数量异常的突变家系,突变频率为1.81%;对9 760个家系中的3 432个家系筛选得到179... 详细信息

针对花器官形态和种子发育突变表型对大型水稻t-dna插入突变体库进行筛选,获得了大量突变体信息及材料,在9 760个突变体家系中筛选得到177个花器官形态和数量异常的突变家系,突变频率为1.81%;对9 760个家系中的3 432个家系筛选得到179个种子发育缺陷的突变家系,突变频率为5.22%。对所获得的270个突变家系进行了t-dna插入的阳性检测,阳性率为64.8%。利用公共数据库RMD(Rice MutantDatabase,RMD)给定的侧翼序列,鉴定了其中1个结实率较低的突变体家系,表明其突变表型和t-dna插入共分离,为深入研究该基因的功能提供了重要的遗传材料。

关键词：水稻 t-dna插入突变突变表型生殖发育共分离

拟南芥t-dna插入突变体AtSUC3的PCR鉴定

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植物生理学通讯 2006年第1期42卷 91-94页

作者：李敏杨双阮燕晔樊金娟张立军沈阳农业大学生物科学技术学院沈阳110161

应用两种植物t-dna插入突变体PCR鉴定方法,即“三引物法”和“双引物法”对拟南芥t-dna插入突变体AtSUC3(目的基因两条染色体均发生t-dna插入的纯合突变体)进行鉴定和比较的结果表明,“三引物法”由于易产生非特异性扩增而无法得到PCR... 详细信息

应用两种植物t-dna插入突变体PCR鉴定方法,即“三引物法”和“双引物法”对拟南芥t-dna插入突变体AtSUC3(目的基因两条染色体均发生t-dna插入的纯合突变体)进行鉴定和比较的结果表明,“三引物法”由于易产生非特异性扩增而无法得到PCR鉴定结果,从而导致鉴定失败;“双引物法”则可避免此种现象,得到可靠、有效的鉴定结果。

关键词：拟南芥 atsuc3 t-dna插入突变蔗糖转运蛋白 PCR

一个t-dna插入突变体的分子鉴定及表达分析

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华北农学报 2013年第4期28卷 37-40页

作者：仪治本梁小红中北大学化工与环境学院生命科学系山西太原030051

突变体在水稻功能基因组研究中具有重要的作用。对水稻OsFCA位点的插入突变体进行了分子鉴定,证实此突变体为纯合突变体,并且发现突变体与野生型植株相比,抽穗期明显延迟。通过Rt-PCR结果分析表明,t-dna插入的突变体植株中OsFCA基因完... 详细信息

突变体在水稻功能基因组研究中具有重要的作用。对水稻OsFCA位点的插入突变体进行了分子鉴定,证实此突变体为纯合突变体,并且发现突变体与野生型植株相比,抽穗期明显延迟。通过Rt-PCR结果分析表明,t-dna插入的突变体植株中OsFCA基因完全不表达。另外,在短日照条件下,对水稻成花相关的2个重要基因Hd1和Hd3a的Rt-PCR分析表明,在野生型植株中,2个基因的表达量都明显高于突变体植株,尤其是在夜间的表达量相差较为明显。说明OsFCA在短日照条件下通过正向调控Hd1和Hd3a的表达促进水稻的开花。

关键词：水稻 t-dna插入突变抽穗期 OsFCA

棉花黄萎病菌t-dna插入突变体功能基因及生物学性状分析

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重庆师范大学学报（自然科学版） 2017年第3期34卷 107-113页

作者：蔡节罗秀媚陈姗姗谢成建杨星勇重庆师范大学植物抗病实验室重庆市植物逆境生物学重点实验室重庆401331

【目的】分析棉花黄萎病致病菌相关基因的功能揭示其中致病机制。【方法】通过AtMt法构建了大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)650个t-dna插入突变体。利用hitAIL-PCR技术获得17株t-dna插入体侧翼基因序列,通过blast比对分析表明,其中16... 详细信息

【目的】分析棉花黄萎病致病菌相关基因的功能揭示其中致病机制。【方法】通过AtMt法构建了大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)650个t-dna插入突变体。利用hitAIL-PCR技术获得17株t-dna插入体侧翼基因序列,通过blast比对分析表明,其中16个基因序列编码酶或蛋白。【结果】突变体的生物学性状与野生型菌株Vd991相比,出现黄色菌丝型2株,中间菌丝型6株;部分突变体在生长速率(7株)、产孢量(14株)和粗毒素产量(4株)上都发生了具有统计学意义的变化(p突变体的致病力较野生型有所降低,在p<0.05水平具有统计学意义。【结论】该研究为大丽轮枝菌致病基因的筛选和鉴定提供了理论基础。

关键词：棉花黄萎病大丽轮枝菌 t-dna插入突变生物学性状基因功能

棉花黄萎病菌t-dna插入突变体库的构建及致病缺陷突变体筛选

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河南农业科学 2014年第1期43卷 69-73,83页

作者：谷素静汪敏桑茜赵静李洪连河南农业大学植物保护学院河南郑州450002

大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)侵染引起的棉花黄萎病是棉花生产上的重要病害之一,而其致病的分子机制尚不清楚,为此,以强致病力落叶型黄萎病菌FGH2为材料,利用农杆菌介导转化技术构建棉花黄萎病菌t-dna插入突变体库并进行致病缺陷... 详细信息

大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)侵染引起的棉花黄萎病是棉花生产上的重要病害之一,而其致病的分子机制尚不清楚,为此,以强致病力落叶型黄萎病菌FGH2为材料,利用农杆菌介导转化技术构建棉花黄萎病菌t-dna插入突变体库并进行致病缺陷突变体的筛选。当农杆菌与黄萎病菌分生孢子浓度比为250∶1、承载介质为NC膜、乙酰丁香酮浓度400μmol/L、共培养时间48h时,转化效率高达每106个分生孢子产生612.5个转化子。通过采用优化后的转化体系,构建了含1 200个t-dna插入转化子的棉花黄萎病菌突变体库。利用苗期分生孢子蘸根法测定300个转化子在棉花幼苗上的致病力,获得3个致病力显著降低的突变体181、546、1009,其中546的微菌核形成能力丧失,1009的微菌核形成能力明显下降。黄萎病菌t-dna插入突变体库的构建,为棉花黄萎病菌致病及微菌核形成机制的研究奠定了基础。

关键词：棉花黄萎病大丽轮枝菌农杆菌介导的遗传转化 t-dna插入突变致病性

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灰葡萄孢t-dna插入突变体的筛选及分析

灰葡萄孢T-DNA插入突变体的筛选及分析

作者：张娇河北农业大学

学位级别：硕士

通过对农杆菌介导转化灰葡萄孢(Botrytis cinerea)获得的转化子进行筛选,得到一株不形成菌核,孢子产量明显减少,对番茄叶片和果实致病性明显增强的菌株BCt41。通过对该菌株进行PCR、Southern杂交鉴定,证明该菌株为遗传稳定的单拷贝t-DN... 详细信息

通过对农杆菌介导转化灰葡萄孢(Botrytis cinerea)获得的转化子进行筛选,得到一株不形成菌核,孢子产量明显减少,对番茄叶片和果实致病性明显增强的菌株BCt41。通过对该菌株进行PCR、Southern杂交鉴定,证明该菌株为遗传稳定的单拷贝t-dna插入突变体。通过tAIL-PCR技术获得了t-dna插入位点左翼264 bp的dna序列,与灰葡萄孢数据库比对表明:t-dna插入位点位于基因BC1G2176.1的外显子2中。该基因编码区长1206 bp,含一个54 bp内含子,编码383个氨基酸,基因功能未知。本研究结果为进一步研究该基因在灰葡萄孢分生孢子发育、菌核形成及致病过程中的作用奠定了基础。

关键词：灰葡萄孢 tAIL-PCR t-dna插入突变致病性

大丽轮枝菌Vd991 t-dna插入突变体库的构建及致病相关基因的筛选

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大丽轮枝菌Vd991 T-DNA插入突变体库的构建及致病相关基因的筛选

作者：汪佳妮中国农业科学院

学位级别：硕士

大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)是棉花黄萎病的病原菌。近年来,黄萎病在我国南北方棉区发展蔓延迅速,危害也在逐年加重,已成为当前制约我国棉花生产的突出问题。常规育种方法和其它防治方法如物理化学方法等在黄萎病的防治中... 详细信息

大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)是棉花黄萎病的病原菌。近年来,黄萎病在我国南北方棉区发展蔓延迅速,危害也在逐年加重,已成为当前制约我国棉花生产的突出问题。常规育种方法和其它防治方法如物理化学方法等在黄萎病的防治中收效甚微。目前对大丽轮枝菌的致病机理知之甚少,且缺乏可资利用的高抗抗源材料,因此,对于棉花黄萎病的研究应不仅仅包括挖掘高抗抗源材料和选育抗病品种,还应找出大丽轮枝菌关键的致病相关基因。本研究通过t-dna插入突变与功能基因鉴定等方法,构建大丽轮枝菌Vd991 t-dna随机插入突变体库,筛选与鉴定Vd991的致病相关基因,旨在为研究大丽轮枝菌致病分子机理和棉花黄萎病的防治提供理论依据和手段。构建了含有构巢曲霉trpC启动子和潮霉素基因的真菌表达载体pCtHyg,利用农杆菌介导的真菌遗传转化体系将pCtHyg上的t-dna转入Vd991的基因组中,得到15131个Vd991 t-dna随机插入突变体。对其中30株突变体在不同碳源培养基上的生长能力、产孢能力和在不同类型棉种中致病力的差异等表型特征进行鉴定,并对t-dna插入位点侧翼序列进行分析,结果表明:1. t-dna插入突变会导致突变体在不同碳源培养基上的生长能力发生改变。从突变体在PDA、查比克、纤维素-查比克(纤维素为唯一碳源)和果胶-查比克(果胶为唯一碳源)培养基上生长的结果可以看出:与野生型Vd991相比,突变体92G09在查比克培养基上生长速率下降;76E01和92G09在以纤维素和果胶为唯一碳源的培养基上的生长速率下降。2. t-dna插入突变会导致突变体的产孢能力发生改变。与野生型Vd991相比,突变体76B11、76E01、78A12、78C02、78C07-2和92B12在查比克液体培养基中的产孢能力明显下降。3. t-dna插入突变会导致突变体的致病力发生改变。与野生型Vd991相比,部分被测突变体的致病力明显下降;(1)突变体424、68E02、76E01、77D01、77F07、78C05、78C07-1、78C07-2、91D08、91H07和92A03对感病棉种冀11的致病力明显下降,低于野生型Vd991致病力的1/3;(2)突变体424、68E02、76E01、77C09、77D01、78C02、78C07-2、91F03、92A03、92B12、92D02和92E07对耐病棉种豫21的致病力明显下降,低于野生型Vd991致病力的1/3;(3)突变体76A12、76E01、77B06、77F07、77H02、78A12、78C07-2、85H04、91F03、91H07和92A12对抗病棉种鲁28的致病力明显下降,低于野生型Vd991致病力的1/3;(4)突变体424、68E02、76E01、77D01、78C07-2和91D08对不同参试棉花品种的致病力均由强变弱,78C03对不同参试棉花品种的致病力均由强变中。4. hitAIL-PCR法可用于大丽轮枝菌t-dna插入位点侧翼序列的分离,并通过该法扩增得到13个突变体t-dna插入位点处的侧翼序列,将它们与Vd991基因组的序列进行比对,得到11株突变体的t-dna插入位点。

关键词：大丽轮枝菌农杆菌介导的真菌遗传转化 t-dna插入突变表型鉴定致病力

大规模水稻t-dna插入突变体库的建立及初步分析

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大规模水稻T-DNA插入突变体库的建立及初步分析

作者：黄红梅西北农林科技大学

学位级别：硕士

水稻（Oryza sativa）具有基因组较小（4.3x108b）、与其他禾谷类作物具有很大的同源性，易于体外操作和遗传转化等特点，已被公认为禾谷类作物基因组研究的模式植物。水稻基因组测序计划已经完成，现在正是水稻功能基因组学研究的时代... 详细信息

水稻（Oryza sativa）具有基因组较小（4.3x108b）、与其他禾谷类作物具有很大的同源性，易于体外操作和遗传转化等特点，已被公认为禾谷类作物基因组研究的模式植物。水稻基因组测序计划已经完成，现在正是水稻功能基因组学研究的时代。本项研究是国家863计划项目“水稻突变体库的建立”的一部分，旨在通过农杆菌介导的遗传转化，获得 t-dna插入突变群体并开展对突变体的鉴定和分析，为水稻功能基因组研究提供技术平台和材料平台。主要研究结果如下：选用双元载体pFX-E24.2-15R，以粳稻品种“日本晴”为试材，利用农杆菌介导法，获得了水稻t-dna插入标签群体。试验表明，灭菌30min的水稻成熟种子，在含300 mg/L水解酪蛋白 + 4mg/L 2,4-D + 2.8g/L脯氨酸的MS培养基中诱导的胚性愈伤组织质量最好。将诱导的愈伤组织在300 mg/L水解酪蛋白 + 2mg/L 2,4-D + 2.8g/L脯氨酸的MS培养基中黑暗下继代培养6～7d后，最适合于转化，转化效率达95%，获得了10，000株转化体。最适的感染菌液浓度为OD600 0.14～0.19,共培养温度为19～20℃，培养时间为3～4天。结果表明将抗性愈伤组织在含有1mg/L NAA+3mg/L 6-BA（6-Benzyladenine）+5mg/L ABA的NB培养基中，黑暗条件下预培养7d，然后在含有2 mg/L 6-BA（6-Benzyladenine）+ 0.5mg/L NAA的NB培养基上连续光照(5000lux)培养，可以提高分化率。15d后进行继代培养以进一步提高愈伤组织的分化。同时在光下分化培养中，除去了潮霉素。转化体的PCR和Southern杂交检测显示，阳性率为95%。转化体的潮霉素抗性实验表明，t-dna插入单拷贝数为40%。对转化植株的Southern杂交分析表明，t-dna单拷贝插入为43%，双拷贝插入为30%，三个或三个以上拷贝插入为27%，平均插入拷贝数为1.7。对10, 000株转化植株t1代进行表型调查，建立了重要的表型数据库.在转化植株t1代发现了矮杆、不分蘖、弱势生长、模拟感病等重要农艺性状的表型变异。对部分标签系分别用PCR-Walking方法进行了t-dna侧翼序列扩增，建立了一套高效的侧翼序列扩增技术体系。.

关键词：水稻成熟种子胚性愈伤组织农杆菌转化 t-dna插入突变侧翼序列