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激活的t细胞核因子家族在肝癌与癌旁组织中的差异表达

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中华实验外科杂志 2012年第2期29卷 237-239页

作者：张进刘志苏刘权焰龚铖刘阳孙江阳武汉大学中南医院普外科武汉430071

目的观察30例患者肝癌与邻近癌旁组织中激活的t细胞核因子（NFAt）家族基因mRNA表达的差异，探讨NFAt基因在肝癌发生发展中的作用。方法常规抽提30例患者肝癌组织与癌旁组织中的RNA，去除基因组DNA后反转录成cDNA，应用实时荧光定量聚... 详细信息

目的观察30例患者肝癌与邻近癌旁组织中激活的t细胞核因子（NFAt）家族基因mRNA表达的差异，探讨NFAt基因在肝癌发生发展中的作用。方法常规抽提30例患者肝癌组织与癌旁组织中的RNA，去除基因组DNA后反转录成cDNA，应用实时荧光定量聚合酶链反应（qPCR）检测标本中NFAt家族基因mRNA表达。结果NFAtlmRNAratio癌组织为0．003034±0．002162，癌旁组织为0．010140±0．009742；NFAt2mRNAratio癌组织为0．000336±0．000272，癌旁组织0．002173±0．003380；NFAt3mRNAratio癌组织为0．002907±0．002436，癌旁组织为0．006427±0．004502；NFAt4mRNAratio癌组织为0．004198±0．004787，癌旁组织为0．012370±0．010890；NFAt5mRNAratio癌组织为0．079060±0．247600，癌旁组织为0．282100±0．686900；5种NFAt家族基因mRNA水平癌组织均较癌旁组织低（P〈0．01）。结论NFAt家族5种基因的mRNA水平痛组织较痛旁组织中均降低．可能与肝痛的发牛发展有关。

关键词：癌肝细胞 t细胞核因子实时荧光定量PCR

饲粮蛋白质水平对肥育猪肌肉嫩度及背最长肌钙调磷酸酶-活化t细胞核因子信号途径的影响

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动物营养学报 2011年第7期23卷 1153-1160页

作者：张勇陶亮崔岩朱宇旌邓科孙璀邵彩梅沈阳农业大学畜牧兽医学院沈阳110866 辽宁禾丰牧业股份有限公司沈阳110164

本试验旨在研究饲粮理想蛋白质水平对背最长肌嫩度及钙调磷酸酶-活化t细胞核因子(CaN-NFAt)信号途径相关蛋白和钙蛋白酶抑制蛋白(CASt)mRNA表达量的影响。选择初始重约50kg的杜洛克×长白×大白三元杂交猪90头,随机分配到3个处理,每个处... 详细信息

本试验旨在研究饲粮理想蛋白质水平对背最长肌嫩度及钙调磷酸酶-活化t细胞核因子(CaN-NFAt)信号途径相关蛋白和钙蛋白酶抑制蛋白(CASt)mRNA表达量的影响。选择初始重约50kg的杜洛克×长白×大白三元杂交猪90头,随机分配到3个处理,每个处理3个重复,每个重复10头,公母各占1/2。3个处理分别采用12%、16%、20%理想蛋白质水平的饲粮,饲粮能量水平相同。正试期58d,结束后屠宰取样,测定肌肉剪切力并利用实时定量PCR法测定猪背最长肌CASt、CaN、钙调蛋白(CaM)和NFAt mRNA表达量。结果表明:1)饲粮高蛋白质水平显著提高背最长肌剪切力(Pt和CaN mRNA表达量(Pt mRNA表达量正相关(相关系数为0.713,Pt mRNA表达量正相关(相关系数分别为0.594、0.596,Pt、CaM与CaN mRNA表达量正相关(相关系数分别为0.536、0.546,Pt mRNA表达量正相关(相关系数为0.623,Pt和CaN mRNA表达量;背最长肌嫩度与CASt mRNA表达量正相关,与CaN-NFAt信号途径无相关性。

关键词：蛋白质水平钙蛋白酶抑制蛋白钙调磷酸酶活化 t细胞核因子钙调蛋白肌肉嫩度

活化的t细胞核因子对肝气郁结证模型大鼠th细胞分化的调节及柴胡疏肝散的干预作用

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中国中西医结合消化杂志 2003年第5期11卷 264-266,267页

作者：杨冬花李家邦郑爱华蒋荣鑫中南大学湘雅医院中西医结合研究所长沙410008

目的 :探讨活化的 t细胞核因子 (NF- Atc)对肝郁证模型大鼠 th细胞的调节及柴胡疏肝散的干预作用。方法 :应用 Rt- PCR法 ,检测肝郁模型大鼠以及运用柴胡疏肝散、四君子汤治疗后 t细胞 NF- Atc、白细胞介素 4 (IL - 4 )及γ干扰素 (IFN-... 详细信息

目的 :探讨活化的 t细胞核因子 (NF- Atc)对肝郁证模型大鼠 th细胞的调节及柴胡疏肝散的干预作用。方法 :应用 Rt- PCR法 ,检测肝郁模型大鼠以及运用柴胡疏肝散、四君子汤治疗后 t细胞 NF- Atc、白细胞介素 4 (IL - 4 )及γ干扰素 (IFN-γ) m RNA的表达水平。结果 :与正常组比较 ,肝郁模型大鼠 NF- Atc、IL - 4 m RNA表达明显降低 (P th细胞向 th2的分化途径受抑制。用柴胡疏肝散治疗后 ,NF- Atc、IL- 4 m RNA表达上调 ,IFN- γm RNA表达下调 ,与正常组比较 ,基本恢复了正常水平 (P>0 .0 5 ) ,th1、th2趋于平衡状态 ;而四君子汤治疗后与正常组比较 ,NF- Atc、IFN-γ及 IL - 4 m RNA的表达无明显变化 (P>0 .0 5 )。结论 :肝郁证模型大鼠 NF- Atc m RNA表达下降 ,th细胞向 th2的分化途径受抑制 ,导致 IL - 4 m RNA表达下降 ,IFN- γ m RNA表达升高 ;柴胡疏肝散可以上调 NF- Atc m RNA表达 ,双向调节 IFN- γ、IL- 4 m RNA的表达水平 ,使 th的分化趋于平衡。

关键词： t细胞核因子肝气郁结证大鼠 th细胞柴胡疏肝散细胞分化 Rt-PCR 四君子汤

PEMF调控Ca2+/Calcineurin/NFAtc1信号通路抑制RANKL诱导的破骨细胞分化

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PEMF调控Ca2+/Calcineurin/NFATc1信号通路抑制RANKL诱导的破骨细...

作者：张杰南方医科大学

学位级别：硕士

研究背景：近年来,中国社会的人口结构已经逐步发展为老龄化为主,随之而来的骨质疏松症(osteoporosis, OP)及其他骨代谢类疾病正在以十分惊人的速度发生着。骨质疏松症造成脊柱、髋部、腕部等关键部位并发骨质疏松性骨折,严重影响患者... 详细信息

研究背景：近年来,中国社会的人口结构已经逐步发展为老龄化为主,随之而来的骨质疏松症(osteoporosis, OP)及其他骨代谢类疾病正在以十分惊人的速度发生着。骨质疏松症造成脊柱、髋部、腕部等关键部位并发骨质疏松性骨折,严重影响患者生活质量,给社会带来极大负担。目前认为,骨质疏松症主要由于破骨细胞的过度激活导致骨形成与骨吸收之间的动态平衡被破坏,从而带来一系列如骨量减少、骨组织强度下降等生物学改变,最终并发骨质疏松性骨折。目前临床上对于此类疾病主要以药物预防为主,辅以调节饮食、运动训练等全身疗法,但该方法周期长、起效慢、副作用多,对骨质疏松性骨折防治效果不尽人意。对此,针对骨质疏松症发生的关键环节,抑制破骨细胞分化、减少成熟破骨细胞数量已成为当前该研究领域的焦点所在。现阶段研究结果证实,破骨前体细胞向破骨细胞分化成熟的程序经由各类信号通路相互调控。其中,RANK/RANKL信号通路是破骨细胞分化过程中具有中心作用的信号通路之一。RANK与RANKL识别结合后,引发连锁反应,最后激活C-fos、P-50、及活化t细胞核因子(Nuclear factor of activated t cells, NFAtc1)等下游蛋白或基因,破骨分化过程程序开启。最近发现的NFAtc1是一种细胞核转录因子,其作用主要负责对破骨细胞的分化成熟和功能发挥的作用起到开启作用,而其通过上游的Calcineurin状态的变化对细胞内钙离子浓度产生不同的反应。钙调神经磷酸酶(Calcineurin),顾名思义,因其依赖细胞内钙离子的浓度变化而变化：细胞Ca2+升高时,活化的Calcineurin能在细胞质中与NFAtc1结合并使其去磷酸化,激活Ca2+-Calcineurin-NFAtc1信号通路,将活化的NFAtc1转位进入细胞核后,作为一种反式作用因子与DNA结合,激活靶基因的转录,发挥反式激活功能,诱导破骨细胞特异性基因转录,启动破骨分化。因此,Ca2+-Calcineurin-NFAtc 1信号通路对于破骨细胞分化具有十分重要的作用。伴随科学技术的进步,除却传统的药物治疗等方法,新兴的物理康复手段早已屡见不鲜,电磁场(Electromagnetic field)便是其代表之一。电磁场的工作原理是交变电流或者直流电流经线圈后产生磁场,由此激发的电磁感应对细胞生物电活动产生效应。临床上常见类型包括恒磁场(Static electromagnetic field,SMF)、低频脉冲电磁场(Low-frequency pulsed electromagnetic field, PEMF)、高频脉冲电磁场(High-frequency pulsed electromagnetic field, HPEMF)等。恒磁场可提供恒定的磁场环境,但缺少电磁互感带来的生物电变化,对细胞生物电活动影响甚小;高频脉冲电磁场具有较大的生物组织破坏能力,常用在肿瘤、结石等特殊治疗中。相比于恒磁场和高频脉冲电磁场,低频脉冲电磁场具有温和的电磁效应,能影响细胞跨膜电位的产生,引起细胞生物学特性的改变。在动物模型及临床试验中均证实可减轻患者的疼痛,促进骨、软骨与肌腱组织的修复及再生,对生物组织伤害极小。2013年Pall ML等提出电磁场对于细胞的生物电磁作用主要表现在对细胞内钙离子浓度影响的观点;无独有偶,2014年LuXW等发现恒磁场对于细胞的影响在于促进膜表面钙通道的通透、细胞膜内面骨架-离子层的释放,进而促进细胞钙内流,产生钙离子振荡信号。此外,有学者证实在一定频率变时电磁场作用下破骨细胞的分化受到抑制,形成的破骨细胞数目明显减少,骨吸收能力明显下降。以上结果是令人欣喜的,但又再度引人思考,是否如同恒磁场一样,PEMF也具备调节细胞内钙离子浓度变化的能力亦或是抑制破骨细胞分化的能力,答案我们不得而知。因此,根据上述结果,我们提出以下假设：PEMF通过调控细胞内钙离子浓度变化影响Ca2+-Calcineurin-NFAtc1信号通路产生抑制破骨细胞分化的作用。现有文献报道,特定频率的电磁场可降低破骨分化过程中NFAtc1蛋白的表达,但对于具体作用靶点仍未探明,因此,如果假设正确,我们将为临床使用PEMF治疗骨质疏松打下更加坚实的理论基础,为治疗骨质疏松症提供新的方向。研究目的：本文首先进行体外研究,采用小鼠单核/巨噬细胞系RAW264.7细胞构建细胞模型,添加细胞核因子κB受体活化因子配体(Receptor activator for nuclear factor-kappa B ligand, RANKL)为刺激条件,诱导其向破骨细胞分化,因为体外实验具有直接可控的优点,尝试阐明下述问题：第一,PEMF可否对RANKL诱导的RAW264.7破骨分化的过程产生抑制作用;

关键词：低频脉冲电磁场破骨细胞分化钙振荡钙调神经磷酸酶 t细胞核因子

斜刺对挫伤模型兔骨骼肌CaN/NFAt1信号通路影响的实验研究

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斜刺对挫伤模型兔骨骼肌CaN/NFAT1信号通路影响的实验研究

作者：王少怀北京中医药大学

学位级别：硕士

研究目的：通过观察斜刺对急性骨骼肌钝挫伤模型兔一般整体情况及行为学、组织形态学、CaN蛋白和NFAt1蛋白表达的影响,探讨斜刺促进骨骼肌损伤后再生修复的机制。研究方法：家兔30只随机分为空白组(6只)、模型组(6只)、针刺组(6只)、CsA... 详细信息

研究目的：通过观察斜刺对急性骨骼肌钝挫伤模型兔一般整体情况及行为学、组织形态学、CaN蛋白和NFAt1蛋白表达的影响,探讨斜刺促进骨骼肌损伤后再生修复的机制。研究方法：家兔30只随机分为空白组(6只)、模型组(6只)、针刺组(6只)、CsA组6只、针刺合并CsA组(6只)。除空白组外,其余组采用重物自由落体撞击法造成急性骨骼肌钝挫伤模型。针刺组于造模24小时后采用毫针斜刺腓肠肌肌束的方法干预,CsA组于造模前3天开始注射CsA(环孢素A)9.25mg/kg,每天分2次进行腹腔注射,针刺合并CsA组进行针刺合并CsA干预,模型组不进行干预。分别于造模前、造模后24h(针刺干预即刻)、造模后72h(针刺后48h)对各组兔进行体重测量;于造模前、造模后24h(针刺干预即刻)、造模后48h(针刺后24h)、造模后72h(针刺后48h)对各组兔进行双腿腓肠肌周长测量,计算肿胀度;造模后72h(针刺后48h)进行取材,各组兔腓肠肌HE染色后光镜下观察肌纤维、肌细胞的变化情况,透射电镜观察腓肠肌超微结构变化;采用Western blot法检测CaN和NFAt1蛋白表达量。研究结果：1.斜刺可改善骨骼肌顿挫伤模型兔组织肿胀程度。各组兔体重均值于造模前、造模后24h(针刺干预即刻)、造模后72h(针刺后48h)各时间点无明显变化;肿胀度方面,与空白组相比,造模后各时间点其余组腓肠肌肿胀度均显著升高,与模型组相比,造模后CsA组、针刺组和针刺合并CsA组均减轻了腓肠肌肿胀度,针刺组减轻腓肠肌肿胀度效果最明显。2.从形态学角度观察,斜刺对骨骼肌钝挫伤后组织有明确的修复作用。光镜下观察模型组镜下肌细胞明显水肿,呈大小不规则,肌纤维间隙缩小、边界模糊不清,胞浆外漏,肌细胞间可见弥散型炎性细胞浸润;CsA组镜下肌细胞肿胀,但程度较模型组轻,炎细胞浸润程度也较模型组轻,出现少量空泡;针刺组肌纤维排列相对较连续,损伤局部炎性细胞浸润较模型组明显,呈聚集型分布,肌细胞整体排列较好;针刺合并CsA组肌纤维排列较乱,部分肌纤维溶解,并伴有炎性细胞浸润。透射电镜下观察各干预组均有不同程度促进损伤后超微结构的恢复,针刺组对组织损伤后超微结构的改善较其他干预组明显。3. Western blot检测CaN和NFAt1蛋白表达结果显示,与空白组相比其余组CaN蛋白均显著升高(pt1蛋白表达均显著升高(pt1蛋白表达显著升高(pt1蛋白表达差异无统计学意义(p>0.05)。结论：1.斜刺可有效促进挫伤模型兔骨骼肌结构损伤后的恢复。CsA、针刺合并CsA干预均对挫伤模型兔挫伤后72h骨骼肌结构恢复有一定的促进作用。针刺与CsA合并使用后,CsA可影响针刺对挫伤模型兔骨骼肌损伤后的修复,可能与CsA抑制炎症反应有关。2. CaN/NFAt1信号通路在挫伤模型兔骨骼肌损伤后再生修复过程中具有重要的作用,斜刺可激活CaN/NFAt1信号通路促进骨骼肌损伤的再生修复。此外,根据本实验的研究结果,斜刺对于挫伤模型兔骨骼肌损伤的再生修复作用可能是通过多条通路实现的。

关键词：钝挫伤钙调神经磷酸酶环孢素A t细胞核因子斜刺

从CaN-NFAt3通路研究参附配伍减毒的作用机制

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从CaN-NFAT3通路研究参附配伍减毒的作用机制

作者：李明安徽医科大学

学位级别：硕士

乌头类中药是我国临床常用中药,属于毛茛科植物。其中附子为植物的侧根。附子的主要功效为回阳救逆,补火助阳,散寒止痛。乌头碱作为附子中的主要成分,既是效应成分也是毒性成分。当乌头碱作为有效成分时具有强心、抗心律失常、抗休克、... 详细信息

乌头类中药是我国临床常用中药,属于毛茛科植物。其中附子为植物的侧根。附子的主要功效为回阳救逆,补火助阳,散寒止痛。乌头碱作为附子中的主要成分,既是效应成分也是毒性成分。当乌头碱作为有效成分时具有强心、抗心律失常、抗休克、抗血栓、抑制中枢等作用;而当乌头碱作为毒性成分时可致心率变慢、传导阻滞、室性心动过速等症状。人参属五加科植物,具有大补元气、复脉固脱、补脾益肺等功效。人参主要成分有人参皂苷A,人参皂苷Rg1,人参皂苷Re等。本实验室前期毒性实验研究中可知,附子中的主要成分乌头碱引起的心律失常可被人参拮抗,并且据文献报道,乌头碱与人参皂苷Re合用L型钙通道的抑制效果要比单独使用人参皂苷Re效果好。因此本文以附子主要成分乌头碱以及人参主要成分人参皂苷Re为研究对象开展进一步研究。文献已知,心肌细胞受到刺激后,细胞内钙离子升高,升高的钙离子可以与CAM结合,从而活化CaN与CAMKⅡ,活化后的CaN与CAMKⅡ分别可以使NFAt3与NF-kB转移入细胞核,发生心律失常。乌头碱尚可以促进钠离子内流,使细胞内钠离子浓度发生改变,通过Na/Ca交换体使得细胞内钙离子发生改变,当心肌细胞内钙离子发生改变,CaN-NFAt3信号通路被激活。心肌细胞内持续升高的钙离子激活CaN,紧接着CaN活化NFAt3基因,NFAt3被活化后去磷酸化转移到细胞核內,与GAtA4基因结合,诱导原癌基因c-fos等表达,继而胎儿基因ANP表达增加,导致心律失常最后发生心力衰竭。课题组前期工作表明乌头碱可以上调CAMKⅡ磷酸化水平,那么乌头碱是否可以引起诱导CaN激活,从而使NFAt3转移至核內,发生心律失常呢?因此本研究拟基于CaN-NFAt3信号通路开展参附配伍减毒机制探究。本文第一部分首先探讨了乌头碱是否通过心肌细胞兴奋-收缩偶联系统并且通过Na/Ca交换体来调控钙离子,最后导致心律失常。采用激光扫描共聚焦显微镜,Rt-PCR和Western blot等技术,用不同浓度(1μM,5μM,10μM)乌头碱刺激心肌细胞,研究乌头碱对心肌细胞内Ca-AtP酶、Ca-Mg-AtP酶和Na-K-AtP酶的活性,Na、Ca、K含量以及钙超载的影响;检测不同浓度乌头碱刺激心肌细胞后,钙离子瞬时变化;通过Na,Ca,K检测试剂盒和Ca-AtP酶、Ca-Mg-AtP酶和Na-K-AtP酶检测试剂盒检测以上各指标的改变;继而观测SERCA2与RyR2的mRNA及蛋白的改变。结果表明:乌头碱刺激细胞后,与空白组比较,不同浓度乌头碱均可抑制钙瞬变浓度,高浓度乌头碱可以明显增加钙瞬变频率,以及增加钙离子浓度;细胞内Na,Ca浓度上升,而K浓度降低,并且不同程度的降低了Ca-AtP酶、Ca-Mg-AtP酶和Na-K-AtP酶活性;对SERCA2的m RNA与蛋白表达显著下调,对RyR2的mRNA与蛋白表达显著上调。以上均当乌头碱浓度较高时,结果具有显著的差异性。研究提示,乌头碱在高剂量时可以明显造成心肌细胞内离子紊乱,各AtP酶活性降低,转运各离子能力减弱,使得Na、Ca浓度升高;同样明显地调节与钙离子通道相关的SERCA2a、RyR2的mRNA与蛋白质水平的表达,使得细胞内钙紊乱,出现钙瞬变现象。研究表明乌头碱可以通过Na/Ca交换体,也可以通过心肌收缩偶联机制改变心肌细胞内钙离子,从而诱导离子信号通路的发生,引起多种心血管疾病,最终导致心力衰竭的发生。本文第二部分从离体和在体两个方面探究了乌头碱以及乌头碱与人参皂苷Re配伍使用后对CaN-NFAt3信号通路的影响。首先,在细胞水平上,乌头碱对心肌细胞进行刺激后,利用实时荧光定量PCR与Western blot技术检测ANP的mRNA以及蛋白水平表达,CaN、c-NFAt3、n-NFAt3蛋白水平表达。结果显示,ANP的mRNA表达水平上调,ANP蛋白表达水平增加;CaN蛋白表达水平升高,c-NFAt3蛋白表达水平下降,n-NFAt3蛋白表达水平升高,与空白对照组相比,当乌头碱为高浓度时,以上结果均具有显著差异性。使用乌头碱与人参皂苷Re配伍给药后,人参皂苷Re具有心肌保护作用,利用Western blot技术检测CaN、c-NFAt3、n-NFAt3、GAtA4蛋白水平表达,结果显示,人参皂苷Re与乌头碱配伍后,与单独乌头碱给药组相比,CaN蛋白表达水平下降,c-NFAt3蛋白表达水平升高,n-NFAt3蛋白表达水平下降,细胞核內GAtA4蛋白表达水平下降,并且结果具有显著差异性;为了进一步验证CaN-NFAt3信号通路与心律失常直接关系,使用FK506刺激心肌细胞,FK506为CaN抑制剂,利用Western blot技术检测ANP以及c-NFAt3、n-NFAt3蛋白表达水平,结果显示与乌头碱单独使用组相比,与FK506合用后可

关键词：乌头碱人参皂苷Re 参附配伍钙瞬变钙调神经磷酸酶 t细胞核因子

针刺对骨骼肌顿挫伤模型兔CaN/NFAt信号通路的影响

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针灸临床杂志 2016年第4期32卷 69-73页

作者：王少怀李娜余飞陈紫岳夏晶马莹黄怡然李文迅北京中医药大学北京100029

目的:观察针刺对兔骨骼肌钝挫伤后组织超微结构和CaN/NFAt信号通路的影响,探讨该通路在骨骼肌损伤修复中的作用机制。方法:30只家兔,雌雄各半,随机分为空白组、模型组、环孢素A(CsA)组、针刺组、针刺合并CsA组。采用重物自由落体撞击法... 详细信息

目的:观察针刺对兔骨骼肌钝挫伤后组织超微结构和CaN/NFAt信号通路的影响,探讨该通路在骨骼肌损伤修复中的作用机制。方法:30只家兔,雌雄各半,随机分为空白组、模型组、环孢素A(CsA)组、针刺组、针刺合并CsA组。采用重物自由落体撞击法造成急性骨骼肌钝挫伤模型。针刺组于造模24 h后采用毫针斜刺腓肠肌全肌束的方法干预,CsA组于造模前3天按每天每只兔9.25mg/kg CsA进行注射,针刺合并CsA组进行针刺合并CsA干预。采用Western blot法检测CaN和NFAt蛋白表达量。结果:电镜下针刺组肌丝总体排列整齐,肌节未见明显肿胀,Z线、M线清晰;模型组、CsA组和针刺合并CsA组均有不同程度的肌原纤维断裂、溶解,Z线、M线有不同程度的溶解断裂。与空白组相比,各组CaN蛋白表达量均显著升高(Pt蛋白表达显著升高(Pt蛋白表达量显著升高(Pt蛋白表达量显著升高(Pt1蛋白表达升高;针刺可激活CaN/NFAt信号通路,促进骨骼肌的再生修复。

关键词：软组织挫伤钙调神经磷酸酶 t细胞核因子环孢素A 针刺骨骼肌