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survivin启动子调控sea基因真核表达质粒的构建及其在肺癌细胞中的特异性表达

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中国生物制品学杂志 2009年第2期22卷 147-149,157页

作者：李奕璇陈全朱大冕重庆医科大学免疫学教研室重庆400016

目的构建survivin启动子调控的葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因真核表达质粒,并检测其在人肺腺癌A549细胞中的特异性表达。方法以金黄葡萄球菌(ATCC25923)基因组为模板,PCR扩增sea基因。用sea基因替代以survivin启动子为调控序列的pGL-S-RED... 详细信息

目的构建survivin启动子调控的葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因真核表达质粒,并检测其在人肺腺癌A549细胞中的特异性表达。方法以金黄葡萄球菌(ATCC25923)基因组为模板,PCR扩增sea基因。用sea基因替代以survivin启动子为调控序列的pGL-S-RED质粒中的Red基因,构建真核表达质粒pGL-S-SEA。酶切及测序鉴定后,用脂质体转染A549细胞和MRC-5人胚肺成纤维细胞,RT-PCR检测两种细胞sea基因的转录情况。结果survivin启动子调控的、以超抗原SEA编码序列CDS为目的基因的真核表达质粒pGL-S-SEA构建正确,并在A549细胞中启动了sea基因的转录,其强度为内参基因(GAPDH)的65.96%,而在MRC-5细胞对照中未检测到sea基因的转录。结论已成功构建survivin启动子调控的sea基因真核表达质粒,survivin启动子可在转录水平特异性地调控sea基因在A549细胞内表达,为下一步以其作为基因疫苗治疗肺癌奠定了基础。

关键词： survivin启动子超抗原葡萄球菌肠毒素A 肺癌基因疗法

survivin启动子控制LRIG1基因表达的重组腺病毒对人膀胱癌裸鼠移植瘤的治疗

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中山大学学报（医学科学版） 2012年第5期33卷 582-586页

作者：孙家媛何振宇李凤岩管迅行严泽军华南肿瘤学国家重点实验室//中山大学肿瘤防治中心放射治疗科广东广州510060 宁波大学医学院附属宁波市第一医院泌尿外科浙江宁波315010

【目的】探讨survivin启动子控制LRIG1基因表达的重组腺病毒对人膀胱癌裸鼠移植瘤的治疗作用及机制。【方法】建立膀胱癌裸鼠移植瘤模型,将成瘤裸鼠随机分为3组,Ad-Surp-LRIGl组(尾静脉注射Ad-Surp-LRIGl上清液)、AD-LRIG1组(尾静脉注射... 详细信息

【目的】探讨survivin启动子控制LRIG1基因表达的重组腺病毒对人膀胱癌裸鼠移植瘤的治疗作用及机制。【方法】建立膀胱癌裸鼠移植瘤模型,将成瘤裸鼠随机分为3组,Ad-Surp-LRIGl组(尾静脉注射Ad-Surp-LRIGl上清液)、AD-LRIG1组(尾静脉注射Ad-LRIGl上清液)、PBS组(尾静脉注射PBS),观察各组裸鼠移植瘤生长情况并绘制肿瘤生长曲线;RT-PCR和Western blot分别检测各组肿瘤组织中LRIG1和EGFR mRNA和蛋白的表达。【结果】Ad-Surp-LRIGl组肿瘤生长速度明显慢于其他2组,治疗结束后Ad-Surp-LRIGl组肿瘤较其他2组轻,差异有统计学意义(F=97.86,P<0.001),Ad-LRIGl组与PBS组相比差异无统计学意义(t=1.73,P=0.06)。与其他两组相比,Ad-Surp-LRIGl组LRIG1的mRNA和蛋白表达水平明显升高,而EGFR的mRNA和蛋白表达水平则显著降低(P<0.01)。【结论】Ad-Surp-LRIGl在体外均能明显抑制膀胱癌的生长,其机制可能部分与LRIG1能下调EGFR的表达有关。

关键词：腺病毒载体膀胱肿瘤 survivin启动子 LRIG1基因基因治疗

survivin启动子驱动的shRNA在宫颈癌SiHa细胞中的特异性表达

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生物技术通报 2009年第7期25卷 128-133页

作者：袁成福黄秀凝程莉卜友泉刘革力易发平杨正梅宋方洲重庆医科大学分子医学与肿瘤研究中心重庆400016

研究survivin启动子驱动的小发夹RNA(shRNA)在宫颈癌SiHa细胞中的特异性表达。PCR扩增survivin启动子,构建以survivin启动子驱动增强绿色荧光蛋白(EGFP)表达的真核表达载体pEGFP-C1/Surv,并检测survivin启动子的活性;构建针对EGFP的shRN... 详细信息

研究survivin启动子驱动的小发夹RNA(shRNA)在宫颈癌SiHa细胞中的特异性表达。PCR扩增survivin启动子,构建以survivin启动子驱动增强绿色荧光蛋白(EGFP)表达的真核表达载体pEGFP-C1/Surv,并检测survivin启动子的活性;构建针对EGFP的shRNA真核表达载体pGenesil-1-EGFP-shRNA/U6,并检测shRNA在U6启动子驱动下的干扰效果;用有活性的survivin启动子取代pGenesil-1-EGFP-shRNA/U6载体中的U6启动子,从而获得新的shRNA真核表达载体pGenesil-1-EGFP-shRNA/Surv;将pGenesil-1-EGFP-shRNA/Surv转染到宫颈癌SiHa细胞及正常人脐静脉内皮HuVEC细胞,观察EGFP在两种细胞中的表达变化。结果表明,成功扩增survivin启动子并验证该启动子具有活性;成功构建EGFP shRNA真核表达载体pGenesil-1-EGFP-shRNA/U6,并验证shRNA在U6启动子驱动下具有较好的干扰效果;成功构建pGenesil-1-EGFP-shRNA/Surv载体,分别转染SiHa及HuVEC细胞,在SiHa细胞中观察到较少的绿色荧光蛋白表达,而在HuVEC细胞中观察到较多的绿色荧光蛋白表达。survivin启动子能驱动shRNA在宫颈癌SiHa细胞中特异性表达,而在正常HuVEC细胞中不表达。

关键词： survivin启动子基因治疗 RNA干扰宫颈癌

survivin启动子调控的PUMA基因表达载体对乳腺癌MCF-7细胞凋亡的影响

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中国妇幼保健 2013年第20期28卷 3339-3341页

作者：陈绍坤刘晓华黄丽余红税青林泸州医学院医学生物学与遗传学教研室四川泸州646000

目的:探讨构建带有肿瘤特异性survivin启动子的PUMA基因表达载体pUC57-survivin-PUMA对乳腺癌MCF-7细胞的肿瘤特异性促凋亡作用。方法:化学合成PUMA基因片段克隆至pUC57质粒,构建重组质粒pUC57-PUMA;克隆survivin启动子序列,取代pUC57-P... 详细信息

目的:探讨构建带有肿瘤特异性survivin启动子的PUMA基因表达载体pUC57-survivin-PUMA对乳腺癌MCF-7细胞的肿瘤特异性促凋亡作用。方法:化学合成PUMA基因片段克隆至pUC57质粒,构建重组质粒pUC57-PUMA;克隆survivin启动子序列,取代pUC57-PUMA质粒原有的CMV启动子,构建重组质粒pUC57-survivin-PUMA,测序鉴定。实验设置pUC57-PUMA组、pUC57-survivin-PUMA组、阴性对照组(pUC57group)和空白对照组(blank group)。将以上各组分别转染人乳腺癌MCF-7细胞及人正常乳腺Hs 578Bst细胞。转染后48h,western blot技术检测各组细胞中PUMA蛋白表达情况,流式细胞仪检测细胞的凋亡率。结果:重组质粒经测序鉴定证实符合设计要求,构建成功;MCF-7细胞中pUC57-PUMA组和pUC57-survivin-PUMA组的PUMA蛋白表达均较对照组显著增高(Psurvivin-PUMA组的细胞凋亡率分别为29.02%和29.31%,均较对照组显著增高(Psurvivin启动子调控的PUMA表达载体能显著增高乳腺癌MCF-7细胞中PUMA的表达,进而促进乳腺癌MCF-7细胞凋亡,而对正常乳腺Hs 578Bst细胞的凋亡不产生影响。

关键词： survivin启动子 PUMA基因肿瘤靶向性细胞凋亡

survivin启动子调控的HSVtk/GCV自杀基因系统对肝癌细胞的杀伤作用

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Survivin启动子调控的HSVtk/GCV自杀基因系统对肝癌细胞的杀伤作用

作者：李勇芳山西医科大学

学位级别：硕士

目的:1.构建一种由survivin启动子介导的重组载体pc DNA3.1-p survivin-TK。2.检测由survivin启动子调控的单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVtk)自杀基因的真核表达载体pc DNA3.1-p survivin-TK在肝癌细胞内是否能够特异性表达。3.研究由survivi... 详细信息

目的:1.构建一种由survivin启动子介导的重组载体pc DNA3.1-p survivin-TK。2.检测由survivin启动子调控的单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVtk)自杀基因的真核表达载体pc DNA3.1-p survivin-TK在肝癌细胞内是否能够特异性表达。3.研究由survivin启动子介导的HSVtk自杀基因联合更昔洛韦(GCV)对肝癌细胞的体外杀伤作用。方法:1.体外培养HL-7702人正常肝细胞、HEK293T人胚肾细胞、Hep G2及Hu H-7人肝癌细胞。2.提取Hep G2细胞的基因组DNA,PCR扩增survivin启动子序列;构建重组载体pc DNA3.1-p survivin-TK并进行测序,通过BLAST对DNA序列的同源性进行比对;将该质粒载体转导入大肠杆菌DH5α中,通过菌液PCR扩增HSVtk基因,采用琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物。3.用重组质粒pc DNA3.1-p survivin-TK分别转染HL-7702、HEK293T、Hep G2及Hu H-7细胞,48小时后提取细胞总RNA及总蛋白,经RT-PCR法及Western blot法检测HSVtk基因在m RNA及蛋白水平的表达情况。4.重组质粒pc DNA3.1-p survivin-TK被转染到HL-7702、Hep G2及Hu H-7细胞中,48小时后,加入梯度剂量GCV处理,MTT法检测HSVtk/GCV自杀基因系统对细胞存活率的影响。5.质粒载体pc DNA3.1-p survivin-TK转染HL-7702、Hep G2及Hu H-7细胞后,加入150μg/ml GCV处理24小时,Hoechst 33258染色法检测细胞核形态变化;流式细胞仪检测细胞凋亡率及细胞内活性氧(ROS)水平;通过Caspase-3染色法在荧光显微镜下观察细胞内活化caspase-3水平。结果:1.通过PCR扩增得到survivin启动子序列,构建由survivin启动子介导的重组质粒载体pc DNA3.1-p survivin-TK,测序得DNA序列与Gen Bank中的HSVtk序列相同,重组质粒载体pc DNA3.1-p survivin-TK成功构建。***-PCR法及Western blot法检测结果表明,HSVtk基因在Hep G2及Hu H-7细胞中表达明显,而在HL-7702、HEK293T细胞中均未见HSVtk基因的表达。***法检测得知,随着前体药物GCV剂量的升高,Hep G2及Hu H-7细胞存活率逐渐下降,与空白组相比,具有显著统计学差异(P﹤0.05),而HL-7702细胞未见明显杀伤作用。4.通过Hoechst染色法分析,转染质粒pc DNA3.1-p survivin-TK的Hep G2及Hu H-7细胞在GCV处理后,其细胞核颜色发白呈致密浓染且染色质固缩,而HL-7702细胞的细胞核未见明显改变。5.流式细胞仪检测得知,经HSVtk/GCV自杀基因系统处理的Hep G2及Hu H-7细胞,其细胞凋亡率及细胞内活性氧水平显著升高,与空白组相比差异具有统计学意义(P﹤0.05),而HL-7702细胞凋亡不明显,且活性氧水平也未见明显变化。***-3染色法表明,Hep G2和Hu H-7细胞经HSVtk/GCV自杀基因系统干预后,荧光显微镜观察可见大量红色荧光,即caspase-3明显增多,而HL-7702细胞未见明显凋亡。结论:1.成功构建了一种新型的真核表达质粒载体pc DNA3.1-p survivin-TK。***自杀基因在Hep G2和Hu H-7细胞内成功表达,而在HL-7702、293T细胞内未见表达。***/GCV自杀基因系统对Hep G2和Hu H-7肝癌细胞有特异性的显著杀伤作用,而对HL-7702细胞未见显著杀伤。

关键词： survivin启动子胸苷激酶肝癌细胞更昔洛韦基因治疗

survivin启动子调控siRNA真核表达载体的构建及对HeLa细胞中stathmin基因表达的抑制作用

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survivin启动子调控siRNA真核表达载体的构建及对HeLa细胞中stath...

作者：王燕第四军医大学

学位级别：硕士

目的:探讨survivin基因启动子调控的siRNA真核表达载体对HeLa细胞中stathmin基因表达的肿瘤特异性封闭作用。方法: (1)将合成的siRNA寡核苷酸链退火形成双链,连接入经BamHI和HindIII双酶切后的pSilencer4.1-CMVneo真核表达载体,酶切及... 详细信息

目的:探讨survivin基因启动子调控的siRNA真核表达载体对HeLa细胞中stathmin基因表达的肿瘤特异性封闭作用。方法: (1)将合成的siRNA寡核苷酸链退火形成双链,连接入经BamHI和HindIII双酶切后的pSilencer4.1-CMVneo真核表达载体,酶切及测序鉴定。脂质体法转染重组质粒入HeLa细胞,G418筛选后RT-PCR检测其对stathmin基因mRNA的干涉效果。(2)PCR扩增suvivin基因启动子并测序,用EcoRI和BamHI分别双酶切,连接至经相同内切酶消化的载体,获得survivin启动子调控的siRNA真核表达载体,酶切及测序鉴定。脂质体法转染重组质粒入HeLa细胞,G418筛选。RT-PCR扩增stathmin基因,检测其对stathmin基因表达的干涉效果;流式细胞仪分析转染后Hela细胞增殖周期的改变。结果: (1)经酶切及测序鉴定,成功构建了CMV启动子调控的siRNA真核表达载体。经脂质体转染HeLa细胞后,RT-PCR结果显示HeLa细胞中stathmin基因的mRNA表达水平明显降低。(2)经酶切及测序鉴定,成功构建了survivin基因启动子调控的stathmin基因siRNA真核表达载体;RT-PCR结果显示所构建的干涉载体可有效封闭stathmin基因表达;流式细胞仪分析结果显示,Hale细胞在stathmin-siRNA作用下G2/M期细胞的比例明显增加。结论: (1)成功构建了人stathmin基因的RNA干涉真核表达载体pSilencer4.1-S1和pSilencer4.1-S2,并在HeLa细胞中有效的发挥了对stathmin基因表达的干涉作用。(2)survivin基因启动子调控的siRNA真核表达载体可有效地封闭HeLa细胞中stathmin基因表达,并使Hela细胞阻断于G2/M期,为以stathmin基因为靶点的恶性肿瘤生物治疗奠定了理论基础。

关键词： survivin启动子 stathmin RNA干涉真核表达载体 HeLa细胞

survivin启动子调控的hTERT基因RNAi载体的构建及其肿瘤靶向干扰作用研究

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泸州医学院学报 2013年第4期36卷 350-355页

作者：曾永秋曹洋余红赵矫税青林泸州医学院医学生物学与遗传学教研室四川泸州646000 泸州医学院生理学教研室四川泸州646000

目的:构建带有肿瘤特异性survivin启动子、hTERT基因靶向的shRNA表达载体pYr-survivinp-miR30-hTERT,探讨该载体的肿瘤靶向性及其RNAi作用效率,为RNAi技术在肿瘤基因治疗中的进一步优化进行有益的探索。方法:化学合成hTERT基因shRNA寡... 详细信息

目的:构建带有肿瘤特异性survivin启动子、hTERT基因靶向的shRNA表达载体pYr-survivinp-miR30-hTERT,探讨该载体的肿瘤靶向性及其RNAi作用效率,为RNAi技术在肿瘤基因治疗中的进一步优化进行有益的探索。方法:化学合成hTERT基因shRNA寡核苷酸序列,克隆至质粒pYr-CMV-Mir30-shRNA,构建重组质粒pYr-CMV-Mir30-hTERT;克隆survivin启动子序列,取代该质粒原有的CMV启动子,构建重组质粒pYr-survivinp-miR30-hTERT,同时构建阴性对照质粒pYr-CMV-Mir30-NC,以上质粒均进行酶切及测序鉴定。将以上载体分别转染人乳腺癌MCF-7细胞、人宫颈癌Hela细胞及293T细胞,荧光显微镜下观察细胞转染情况,并采用半定量RT-PCR、western blot技术检测MCF-7细胞和Hela细胞中hTERT mRNA和蛋白的表达。结果:重组质粒经酶切及测序鉴定证实均符合设计要求,构建成功;荧光检测结果表明,CMV组在三种细胞中均有荧光蛋白的表达,而survivin组质粒仅在MCF-7细胞和Hela细胞中表达绿色荧光,转染效率均能达到70%以上,而在293T细胞中则未见荧光;RT-PCR和Western blot的结果均显示MCF-7细胞和Hela细胞的survivin组和CMV组中hTERT mRNA和蛋白的表达均受到明显抑制(P0.05)。结论:survivin启动子调控的hTERT基因RNAi载体能有效抑制survivin阳性肿瘤细胞中hTERT的表达,而对正常细胞不产生影响。

关键词： survivin启动子 hTERT基因 RNA干扰肿瘤靶向性

survivin启动子介导的胞嘧啶脱氨酶(CD)自杀基因的抗肿瘤研究

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广东药学院学报 2015年第3期31卷 378-382,392页

作者：邵红伟陈辉李家明沈晗吴凤麟王辉黄树林广东药学院生命科学与生物制药学院/广东省生物技术候选药物研究重点实验室广东广州510006

目的探讨survivin启动子介导的CD/5-FC自杀系统的抗肿瘤效果。方法利用survivin启动子替换p EGFP-N1载体上的巨细胞病毒(CMV)启动子,构建重组表达载体p Sur P-EGFP,通过报告基因绿色荧光蛋白(GFP)的表达确定survivin启动子的特异性;将... 详细信息

目的探讨survivin启动子介导的CD/5-FC自杀系统的抗肿瘤效果。方法利用survivin启动子替换p EGFP-N1载体上的巨细胞病毒(CMV)启动子,构建重组表达载体p Sur P-EGFP,通过报告基因绿色荧光蛋白(GFP)的表达确定survivin启动子的特异性;将酿酒酵母的胞嘧啶脱氨酶(CD)基因克隆在p Sur P-EGFP中,构建成重组载体p Sur P-CD,转染肿瘤细胞后利用毛细管电泳仪检测前药5-氟胞嘧啶(5-FC)的转化效率,同时分析肿瘤细胞的凋亡。结果 GFP的表达表明survivin启动子具有较好的肿瘤靶向性;毛细管电泳检测表明CD能够有效地将5-FC转化为5-FU,显微镜观察和流式分析表明了survivin启动子介导的CD的抗肿瘤效果。结论 survivin启动子能有效地介导CD自杀基因的表达,具有较好的靶向性抗肿瘤效果。

关键词： survivin启动子自杀基因胞嘧啶脱氨酶 5-氟胞嘧啶

肿瘤特异性survivin启动子驱动的FAK shRNA真核表达载体的构建

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西安交通大学学报（医学版） 2012年第5期33卷 533-538页

作者：孙昊韩少山周振宇宋涛刘青光西安交通大学医学院第一附属医院肝胆外科陕西西安710061

目的构建肿瘤特异性survivin启动子驱动的FAK shRNA真核表达载体。方法 PCR扩增survivin启动子,构建重组载体pGEMT/pSurv并酶切、测序鉴定。体外化学合成编码FAK shRNA寡核苷酸链并退火互补成双链,构建真核表达载体pGenesil-FAK shRNA... 详细信息

目的构建肿瘤特异性survivin启动子驱动的FAK shRNA真核表达载体。方法 PCR扩增survivin启动子,构建重组载体pGEMT/pSurv并酶切、测序鉴定。体外化学合成编码FAK shRNA寡核苷酸链并退火互补成双链,构建真核表达载体pGenesil-FAK shRNA并酶切、测序鉴定。用survivin启动子替换pGenesil-FAK shRNA中的U6启动子,重组为survivin启动子驱动的FAK shRNA真核表达载体pGenesil-pSurv-FAK shRNA。将pGenesil-pSurv-FAK shRNA转染至肝癌细胞系HepG2,观察转染效率。48h后应用RT-PCR法检测转染重组质粒后HepG2细胞中FAK mRNA的表达变化。结果成功构建了肿瘤特异性survivin启动子驱动的真核表达载体pGenesil-pSur-FAKshRNA,转染至肝癌细胞HepG2后可明显下调HepG2细胞中FAK mRNA表达水平。结论以survivin启动子驱动的FAK shRNA真核表达载体能够有效下调肝癌细胞FAK的表达,为进一步以靶向干扰FAK表达为主要手段的肝癌联合治疗提供实验依据。

关键词： survivin启动子 FAK shRNA RNA干扰肝癌