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srgap2 suppression ameliorates retinal ganglion cell degeneration in mice

Neural Regeneration Research 2023年第10期18卷 2307-2314页

作者： Yi-Jing Gan Ying Cao Zu-Hui Zhang Jing Zhang Gang Chen Ling-Qin Dong Tong Li Mei-Xiao Shen Jia Qu Zai-Long Chi State Key Laboratory of Ophthalmology Optometry and Vision ScienceEye HospitalWenzhou Medical UniversityWenzhouZhejiang ProvinceChina Department of Ophthalmology The First Affiliated Hospital of University of Science and Technology of ChinaDivision of Life Sciences and MedicineUniversity of Science and Technology of ChinaHefeiAnhui ProvinceChina

Slit-Robo GTPase-activating protein 2(srgap2) plays important roles in axon guidance, neuronal migration, synapse formation, and nerve regeneration. However, the role of srgap2 in neuroretinal degenerative disease remains unclear. In this study, we found that srgap2 protein was first expressed in the retina of normal mice at the embryonic stage and was mainly located in the mature retinal ganglion cell layer and the inner nuclear layer. srgap2 protein in the retina and optic nerve increased after optic nerve crush. Then, we established a heterozygous knockout(srgap2+/–) mouse model of optic nerve crush and found that srgap2 suppression increased retinal ganglion cell survival, lowered intraocular pressure, inhibited glial cell activation, and partially restored retinal function. In vitro experiments showed that srgap2 suppression activated the mammalian target of rapamycin signaling pathway. RNA sequencing results showed that the expression of small heat shock protein genes(Cryaa, Cryba4, and Crygs) related to optic nerve injury were upregulated in the retina of srgap2+/– mice. These results suggest that srgap2 suppression reduced the robust activation of glial cells, activated the mammalian target of rapamycin signaling pathway related to nerve protein, increased the expression of small heat shock protein genes, inhibited the degeneration of retinal ganglion cells, and partially restored optic nerve function.

关键词： astrocyte crystallins intraocular hypertension microglia mTOR neuroprotection optic nerve crush optic neuropathy RGC degeneration srgap2

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srgap2 F-BAR结构域的结构生物学研究

srGAP2 F-BAR结构域的结构生物学研究

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作者：王宏鹏上海交通大学

学位级别：硕士

BAR结构域超家族蛋白通过诱导膜的内陷和突起在细胞经历的多种多样的过程中都发挥着重要的作用这些过程包括细胞器生物发生，细胞分裂，细胞迁移，分泌和内吞。BAR结构域超家族可以分为三个不同的亚家族：“classical” BARs/N-BARs, F-... 详细信息

BAR结构域超家族蛋白通过诱导膜的内陷和突起在细胞经历的多种多样的过程中都发挥着重要的作用这些过程包括细胞器生物发生，细胞分裂，细胞迁移，分泌和内吞。BAR结构域超家族可以分为三个不同的亚家族：“classical” BARs/N-BARs, F-BARs (Fes/CIP4homology-BAR)和I-BARs (Inverse-BAR)。经典（Classical）BAR和F-BAR亚家族蛋白在网格蛋白介导的内吞作用中诱导膜的内陷，而I-BAR亚家族蛋白Missing-in-metastasis (MIM)和IRSp53可以在体外和活细胞中诱导膜的突起，形成丝状伪足（filopodia）。虽然srgap2（slit-robo GTPase activating protein2）含有一个N端F-BAR结构域，却能通过引起膜的突起来调控神经元的生长和迁移，这与I-BAR蛋白的功能存在相似之处。在本研究中，过表达srgap2蛋白的F-BAR结构域，并进行纯化和结晶。srgap2F-BAR结构域蛋白晶体X射线衍射得到的分辨率为3.50，所属空间群为P21，这些结果有利于srgap2F-BAR结构域最终的结构解析并最终解释其诱导膜突起而不是膜内陷的原因。本研究中还通过转染HEK293T细胞获得真核表达的Rab4，5，7，8，11;与原核表达的F-BAR-1-357和F-BAR-1-480蛋白（带6×HisTag）做Ni柱pulldown，来探索Rab与F-BAR不同区段的结合性质。实验中证实，Rab4，5，7，8，11与F-BAR-1-357和F-BAR-1-480均存在显著的相互作用。

关键词： srgap2 F-BAR 结晶晶体结构

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srgap2分子F-BAR结构域的可逆乙酰化修饰及其功能研究

SrGAP2分子F-BAR结构域的可逆乙酰化修饰及其功能研究

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作者：戴云凯上海交通大学

学位级别：硕士

srgap家族（Slit-Robo GTPase-activating proteins）主要有srgap1、srgap2、srgap3和ARHGAP4四个家族成员组成。srgap分子包含N端F-BAR结构域，主要介导细胞膜形态的变化，中间RhoGAP结构域特异性水解RhoGTPase，C端SH3结构域介导蛋白与蛋白之间的相互作用。目前的研究揭示接头蛋白srgap分子主要通过它的F-BAR结构域发挥着多种重要的功能.如srgap1在线虫胚胎形成过程中通过其F-BAR介导细胞之间的粘附作用;srgap2的F-BAR结构域能诱导神经元突起的生长和迁移;srgap3的F-BAR能促进树突棘发育的起始。而且，这种作用被证明与F-BAR结构域丝状伪足（filopodia）诱导活性密切相关。F-BAR结构域的作用机制被认为与其结构域中存在大量带正电荷的碱性氨基酸有关;这些赖氨酸（Lysine）和精氨酸（Argine）可以通过静电相互作用与细胞膜表面带负电荷磷脂相结合，介导细胞膜表面的形态变化。本研究聚焦srgap2的F-BAR/IF-BAR结构域关键赖氨酸（Lysine）的可逆乙酰化修饰及其对Filopodia诱导和内吞功能的影响。获得的主要结果如下： 1.我们在COS7L和HEK293FT等细胞系上转染C端融合有GFP标签的srgap-F-BAR/IF-BAR，结果观察到GFP-srgap(1-3)F-BAR主要分布于细胞膜，并且诱导Filopodia形成。进一步，我们利用纯化的重组GST-srgap(1-3)F-BAR蛋白进行了膜脂结合实验Membrane Lipid assay，srgap(1-3)F-BAR主要与PA、PtdIns(4)P、PtdIns(4,5)P2、PtdIns(3,4,5)P3等磷脂结合。 2.使用Cluster X软件进行序列比对不同种属的srgap分子F-BAR结构域，发现在所有50个赖氨酸中具有多个进化中高度保守的关键赖氨酸，将srgap2-F-BAR载体转染到HEK293FT，24-48小时后，裂解物用抗体检测，发现F-BAR存在乙酰化修饰，而经过去乙酰化抑制剂TSA/NAM处理后，乙酰化水平升高。我们选择两个关键赖氨酸位点制备了Ac-K226和Ac-K234抗体，进一步证明K226和K234位点存在乙酰化修饰。 3.我们利用Co-IP和Western Blot等手段筛选以srgap2作为底物的去乙酰化酶和乙酰化转移酶。结果显示，SIRT1和p300与srgap2有相互作用;SIRT1与srgap2共转染后，能降低其乙酰化水平;p300与srgap2共转染后，能增加其乙酰化水平。 4.我们以srgap2-F-BAR-WT为模板多位点突变获得2KQ和5KQ模拟乙酰化突变体以及6KR模拟去乙酰化突变体。功能研究发现：srgap2-F-BAR-WT具filopodia诱导和促进细胞迁移的功能;然而模拟乙酰化修饰的5KQ丧失了filopodia诱导和细胞迁移的功能，而转变为促进细胞内吞;模拟去乙酰化修饰的6KR具有抑制神经元分化的能力。综上所述，我们的研究初步证明srgap2-F-BAR结构域存在可逆的乙酰化修饰;p300是它的乙酰化酶，Sirt1是它的去乙酰化酶（也可以说，p300和SIRT1参与srgap2F-BAR乙酰化修饰作用）。进一步的功能研究揭示srgap2分子F-BAR结构域的可逆乙酰化修饰作用可以调控filopodia诱导和内吞（endocytosis）之间的功能转换。该研究将为研究作为信号接头蛋白的srgap2的多样的功能及作用机制提供了一个崭新的思路。

关键词： srgap2 F-BAR结构域赖氨酸乙酰化修饰乙酰化转移酶去乙酰化酶

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难治性癫痫模型大鼠脑组织中srgap2分子的表达

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中国组织工程研究 2013年第7期17卷 1207-1211页

作者：刘锦徐忠庞爱兰孟步亮王学峰任惠昆明医科大学第一附属医院神经内科云南省昆明市650032 昆明医科大学人体解剖学与组织胚胎学系云南省昆明市650500 重庆医科大学附属第一医院神经内科重庆市630014

背景:众多研究结果显示srgap2分子在突起生长和突触可塑性起到关键的作用,但具体机制不明。目的:检测srgap2在致痫大鼠模型中的表达,探讨srgap2与难治性癫痫发病机制的相关性。方法:选取雄性SD大鼠56只随机分为7组,其中随机选取6组建立... 详细信息

背景:众多研究结果显示srgap2分子在突起生长和突触可塑性起到关键的作用,但具体机制不明。目的:检测srgap2在致痫大鼠模型中的表达,探讨srgap2与难治性癫痫发病机制的相关性。方法:选取雄性SD大鼠56只随机分为7组,其中随机选取6组建立癫痫模型,构成实验组,剩余1组作为对照组。分别选取癫痫发作后的6h、1d、1周、2周、1个月、2个月等6个时间点的颞叶脑组织作为研究对象,并与对照组进行比较。利用免疫组织化学、免疫荧光以及免疫印迹3种方法检测srgap2在致痫动物模型以及对照组的脑组织中的表达及变化规律。结果与结论:实验组中srgap2除在皮质区表达增高外,还在海马区高表达,与对照组相比各时间点srgap2在颞叶癫痫动物组中的表达含量逐渐升高,且在2周左右达高峰并维持,到2个月左右降至接近对照组水平。结果提示srgap2可能通过促进苔藓纤维出芽,进而导致脑组织中异常神经网络的建立,并最终在难治性癫痫的发生发展中起到重要作用。

关键词：组织构建组织构建实验造模难治性癫痫 srgap2 苔藓纤维出芽癫痫模型脑组织细胞生物学分子生物学组织构建图片文章

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难治性癫痫患者脑组织中srgap2的表达

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神经解剖学杂志 2014年第3期30卷 367-371页

作者：庞爱兰王学峰孟步亮任惠刘锦昆明医科大学第一附属医院神经内科昆明650032 重庆医科大学附属第一医院神经内科重庆630014 昆明医科大学人体解剖学与组织胚胎学系昆明650500

目的:srgap2(Slit-Robo GTPase-activating protein 2)作为Slit-Robo下游信号通路中一个重要的RhoGAP分子,在大脑轴突的形成及神经细胞的迁移中发挥作用。本课题通过检测病人大脑组织中srgap2的表达,从分子水平探讨srgap2与难治性癫痫... 详细信息

目的:srgap2(Slit-Robo GTPase-activating protein 2)作为Slit-Robo下游信号通路中一个重要的RhoGAP分子,在大脑轴突的形成及神经细胞的迁移中发挥作用。本课题通过检测病人大脑组织中srgap2的表达,从分子水平探讨srgap2与难治性癫痫发病机制的相关性。方法:从已建立的难治性癫痫脑库中随机选取35例患者的颞叶脑组织和同期15例相对正常的颞叶脑组织作为实验组与对照组。利用免疫组化,免疫荧光以及免疫印迹三种方法检测srgap2在两组脑组织中的表达情况。结果:在正常人的颞叶脑组织中,srgap2主要少量表达在神经元胞膜和胞浆中;而在难治性癫痫患者颞叶脑组织中srgap2的表达量明显高于对照组(Psrgap2可能与难治性癫痫的发生发展密切相关。

关键词：难治性癫痫 srgap2 苔藓纤维出芽

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难治性癫痫患者和大鼠模型脑组织中srgap2的表达

难治性癫痫患者和大鼠模型脑组织中srGAP2的表达

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作者：刘锦昆明医学院

学位级别：硕士

目的：srgap2 (Slit-Robo GTPase-activating protein 2)作为Slit-Robo下游信号通路中一个重要的RhoGAP分子,在大脑轴突的形成及神经细胞的迁移中发挥作用。本课题通过检测srgap2在难治性癫痫患者及氯化锂-匹罗卡品致痫大鼠模型中的表达... 详细信息

目的：srgap2 (Slit-Robo GTPase-activating protein 2)作为Slit-Robo下游信号通路中一个重要的RhoGAP分子,在大脑轴突的形成及神经细胞的迁移中发挥作用。本课题通过检测srgap2在难治性癫痫患者及氯化锂-匹罗卡品致痫大鼠模型中的表达,从分子水平探讨srgap2与癫痫发病机制的相关性。方法：随机从已建立的难治性癫痫脑库中选取35例病人的颞叶脑组织和同期15例相对正常的颞叶脑组织分别作为实验组与对照组。同时,选取雄性SD大鼠56只随机分为7组,其中随机选取6组腹腔注射氯化锂-匹罗卡品(Lithium chloride- pilocarpine, LiCl- PILO)建立癫痫模型,构成实验组。剩下的一组作为对照组,除将腹腔注射氯化锂-匹罗卡品改为注射生理盐水之外其它与实验组的处理相同。分别选取癫痫发作后的6h、1d、1w、2w、1m、2m等6个时间点的颞叶脑组织作为研究对象,并与对照组进行比较。通过利用免疫组化,免疫荧光以及免疫印迹三种方法检测srgap2在难治性癫痫患者、氯化锂-匹罗卡品(LiCl-PILO)致痫动物模型以及它们各自的对照组的脑组织中的表达及变化规律。结果：在正常人的颞叶脑组织中,srgap2主要少量表达在皮质神经元中,并集中表达在细胞膜及细胞浆中。在难治性癫痫患者颞叶脑组织中srgap2的表达量明显高于正常对照组。在动物实验中：正常大鼠脑中srgap2的表达情况基本与正常人的脑组织表达相似。LiCl-PILO致痫大鼠模型的颞叶脑组织中srgap2的表达情况与在难治性癫痫患者的脑组织表达相似,并观察到,实验组中srgap2除在皮质区表达增高外,还在海马区高表达,与对照组相比,各时间点(从6h到1m时间点)srgap2在颞叶癫痫动物组中的表达含量逐渐升高,且在2w左右达高峰并维持,到2m左右降至接近对照组水平。结论：srgap2在难治性癫痫患者及氯化锂-匹罗卡品(LiCl- PILO)致痫大鼠模型中的表达量比各自对照组均有升高,提示其可能参与了难治性癫痫的病理过程。结合srgap2的功能,推测其可能通过促进苔藓纤维出芽,进而导致脑组织中异常神经网络的建立,并最终在难治性癫痫的发生发展中起到重要作用。

关键词：癫痫难治性癫痫 srgap2 苔藓纤维出芽

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难治性癫痫患儿脑组织srgap2γ-氨基丁酸及MCP-1表达的意义

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中国实用神经疾病杂志 2018年第23期21卷 2605-2611页

作者：刘伟吕秀丽李战华驻马店市第一人民医院儿科河南驻马店463000 驻马店市中心医院新生儿重症监护室河南驻马店463000

目的研究srgap2(Slit-Robo GTPase activating Protein 2)、γ-氨基丁酸以及单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)在难治性癫痫患儿脑组织中的表达情况及意义。方法选取11例患儿的颞叶脑组织和同期11例正常标本的颞叶脑组织,使用免疫组化和免疫印... 详细信息

目的研究srgap2(Slit-Robo GTPase activating Protein 2)、γ-氨基丁酸以及单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)在难治性癫痫患儿脑组织中的表达情况及意义。方法选取11例患儿的颞叶脑组织和同期11例正常标本的颞叶脑组织,使用免疫组化和免疫印迹等方法检测srgap2、γ-氨基丁酸以及MCP-1的表达情况。结果难治性癫痫患儿脑组织中,srgap2的阳性表达率显著高于正常脑组织。难治性癫痫患儿脑组织和正常脑组织可以看到染成棕褐色的神经元,但难治性癫痫患儿脑组织γ-氨基丁酸能神经元表达量明显低于正常脑组织。正常脑组织中MCP-1的表达较弱,而难治性癫痫患儿脑组织中MCP-1的表达较强。结论难治性癫痫患儿脑组织srgap2和MCP-1表达上升而γ-氨基丁酸表达下降,srgap2、γ-氨基丁酸及MCP-1与难治性癫痫发病密切相关,可能作为潜在治疗靶标。

关键词：难治性癫痫 srgap2 γ-氨基丁酸单核细胞趋化蛋白-1 脑组织

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