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利用spytag/spycatcher体系提高毕赤酵母重组蛋白生产能力

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华南理工大学学报（自然科学版） 2022年第1期50卷 143-154页

作者：韩双艳李静文王媛媛华南理工大学生物科学与工程学院广东广州510006

毕赤酵母是一种甲基营养型酵母,可以利用甲醇作为唯一的碳源和能源,是应用最为广泛的真核外源蛋白表达系统之一。毕赤酵母的甲醇利用率和同化效率较低,高浓度甲醇对细胞有毒性,其中间代谢产物甲醛、甲酸等毒性物质的积累会严重抑制细胞... 详细信息

毕赤酵母是一种甲基营养型酵母,可以利用甲醇作为唯一的碳源和能源,是应用最为广泛的真核外源蛋白表达系统之一。毕赤酵母的甲醇利用率和同化效率较低,高浓度甲醇对细胞有毒性,其中间代谢产物甲醛、甲酸等毒性物质的积累会严重抑制细胞生长,限制目的蛋白的产量。本研究拟在毕赤酵母过氧化物酶体中,利用多酶组装技术在甲醇代谢关键酶之间构建底物通道,减少甲醛积累,增大同化途径通量,提高甲醇耐受性,提高毕赤酵母表达外源蛋白能力,获得高效利用甲醇的毕赤酵母人工细胞。研究首先采用双分子荧光互补(BiFC)分析技术验证了多酶组装技术—spytag/spycatcher体系在毕赤酵母中自组装的可行性,随后利用spytag和spycatcher成功实现了甲醇氧化酶(AOX)和二羟丙酮合酶(DAS)在胞内自组装形成双酶复合体;在此基础上,引入绿色荧光蛋白EGFP作为报告蛋白,考察表达自组装双酶复合体的重组毕赤酵母利用甲醇进行细胞生长和重组蛋白合成的能力。结果显示,在2%(体积分数)甲醇培养基中,相比原始菌株,表达双酶组装体系的重组菌株的生物量提高了2.3倍,单位D(600)细胞表达的EGFP荧光强度提高了4.51倍,是未组装菌株的2.76倍,EGFP产量约为1.52 mg/mL。

关键词：毕赤酵母甲醇代谢双酶组装 spytag/spycatcher 双分子荧光互补

A preparation strategy for protein-oriented immobilized silica magnetic beads with Spy chemistry for ligand fishing

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Journal of Pharmaceutical Analysis 2022年第3期12卷 415-423页

作者： Yu Yi Jianming Hu Shenwei Ding Jianfeng Mei Xudong Wang Yanlu Zhang Jianshu Chen Guoqing Ying Institute of Biopharmaceuticals College of Pharmaceutical ScienceZhejiang University of TechnologyHangzhou310014China

Due to the complexity of bioactive ingredients in biological samples,the screening of target proteins is a complex process.Herein,a feasible strategy for directing protein immobilization on silica magnetic beads for ligand fishing based on spytag/spycatcher(ST/SC)-mediated anchoring is presented.Carboxyl functional groups on the surface of silica-coated magnetic beads(SMBs)were coupled with SC using the 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride/N-hydroxysulfosuccinimide method,named SC-SMBs.The green fluorescent protein(GFP),as the capturing protein model,was ST-labeled and anchored at a specific orientation onto the surface of SC-SMBs directly from relevant cell lysates via ST/SC self-ligation.The characteristics of the SC-SMBs were studied via electron microscopy,energy dispersive spectroscopy,and Fourier transform infrared spectroscopy.The spontaneity and site-specificity of this unique reaction were confirmed via electrophoresis and fluorescence analyses.Although the alkaline stability of ST-GFP-ligated SC-SMBs was not ideal,the formed isopeptide bond was unbreakable under acidic conditions(0.05 M glycine-HCl buffer,pH 1e6)for 2 h,under 20%ethanol solution within 7 days,and at most temperatures.We,therefore,present a simple and universal strategy for the preparation of diverse protein-functionalized SMBs for ligand fishing,prompting its usage on drug screening and target finding.

关键词： EDC/Sulfo-NHS spytag/spycatcher Green fluorescent protein Silica magnetic beads Oriented immobilization Drug screening

spytag/spycatcher作用于多酶固定化系统的应用研究

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齐鲁工业大学学报 2022年第2期36卷 20-28页

作者：张欣宜蒋艺刘洪玲宋龙祥王腾飞齐鲁工业大学(山东省科学院)生物基材料与绿色造纸国家重点实验室山东济南250353

利用一组相互作用多肽对spytag/spycatcher之间的特异相互作用,以麦芽寡糖基海藻糖合酶(MTSase)和麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)为作用酶研究其固定化的应用效果。将spycatcher与具有高亲和力的纤维素结合模块(CBM)融合,得到融合蛋白S... 详细信息

利用一组相互作用多肽对spytag/spycatcher之间的特异相互作用,以麦芽寡糖基海藻糖合酶(MTSase)和麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)为作用酶研究其固定化的应用效果。将spycatcher与具有高亲和力的纤维素结合模块(CBM)融合,得到融合蛋白SC-CBM,利用CBM与纤维素之间的吸附作用将融合蛋白固定于纤维微球,形成稳定且通用的固定化载体,实现了79.8%的载体回收率。作用酶分别与spytag融合形成融合蛋白ST-treY和ST-treZ,其与SC-CBM之间的相互作用发现结合率分别达到60.3%和63%。应用此种特异性对接作用完成了ST-treY和ST-treZ在发酵液中的一步纯化及固定化,固定化率分别能达到69.6%和68.4%。因此,实现了spytag/spycatcher作为媒介的多酶固定化,为未来的多酶固定化系统打开了新思路,形成了通用固定化载体,节省了固定化步骤与成本,且能达到较高的回收效率。

关键词： spytag/spycatcher 固定化体系纤维素结合模块(CBM) 通用载体

利用spytag/spycatcher构建胞内自组装多酶复合体实现高效生物合成

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中国生物工程杂志 2018年第7期38卷 75-82页

作者：刘璐殷亮黄飞张勇刘倩冯雁上海交通大学生命科学技术学院微生物代谢国家重点实验室

spytagr和SpyCatche可通过自发反应形成共价键,产生稳定的分子自组装体。酶分子自组装体因具有高效有序的催化特性在合成生物学和纳米技术领域具有重要的应用价值。为探索spytag/spycatcher在大肠杆菌胞内多酶复合体系形成有序自组装分... 详细信息

spytagr和SpyCatche可通过自发反应形成共价键,产生稳定的分子自组装体。酶分子自组装体因具有高效有序的催化特性在合成生物学和纳米技术领域具有重要的应用价值。为探索spytag/spycatcher在大肠杆菌胞内多酶复合体系形成有序自组装分子能力,将spytagr和SpyCatche分别与P450BM3m单加氧酶和葡萄糖脱氢酶GDH进行融合表达,以期产生具有辅酶再生循环系统、高效生物合成靛蓝分子的spytag/spycatcher双酶自组装复合体。首先,通过电泳及质谱对重组工程菌表达蛋白进行分析,证实spycatcher-P450BM3m与spytag-GDH在胞内成功形成了自组装多酶复合体;然后,系统分析不同培养条件下组装体合成靛蓝的能力。结果发现,经0.5mmol/L IPTG诱导后,菌体在16℃继续培养18h后,工程菌对吲哚（2mmol/L）与葡萄糖（4mmol/L）的全细胞催化能力最强,靛蓝产量最高达258mg/L,是未组装多酶系统的1.9倍,比P450BM3m单酶表达系统高约2.4倍;反应70min后达到反应平衡,转化率为52%。成功实现了spytag/spycatcher介导的多酶体系在大肠杆菌细胞中的自组装和高效转化体系,为胞内多酶复合物组装体的设计提供了新思路。

关键词： spytag/spycatcher 自组装多酶复合物辅酶再生靛蓝

通过spytag/spycatcher介导的自发环化提高酿酒酵母S288C中Ulp1的稳定性（英文）

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农业生物技术学报 2020年第2期28卷 369-380页

作者：王梦珂郭玉堃郭婉莹贾宾张菡郭豫杰王江杨国宇韩莹倩河南农业大学牧医工程学院/农业部动物生化与营养重点实验室

spytag/spycatcher环化技术是一种自发迅速的共价连接反应,通过环化蛋白的骨架以实现目标蛋白的环化,从而提高目标蛋白稳定性。研究显示,spytag/spycatcher技术介导的环化过程不受环境的影响,不会影响目标蛋白原本的催化活性和功能,且... 详细信息

spytag/spycatcher环化技术是一种自发迅速的共价连接反应,通过环化蛋白的骨架以实现目标蛋白的环化,从而提高目标蛋白稳定性。研究显示,spytag/spycatcher技术介导的环化过程不受环境的影响,不会影响目标蛋白原本的催化活性和功能,且一旦完成便具有极强的稳定性。小泛素样修饰蛋白(small ubiquitin-like modifiers, SUMOs)是一种十分有效的促溶标签,广泛应用于重组蛋白的原核表达过程中。泛素样特异蛋白酶1 (ubiquitin-like-specific protease 1, Ulp1)是SUMO特异性蛋白酶中的一个重要成员,具有将SUMO从目标融合蛋白上切下,不残留任何氨基酸碱基的特异性酶切活性,且参与SUMO的成熟过程,但较差的稳定性限制了其应用。本研究使用截断型Ulp1 (Gly304～Lys621)代替全长Ulp1,并对其序列进行了优化,得到了重组截断型Ulp1。重组截断型Ulp1既具有Ulp1全部的酶活性,又能更好地在大肠杆菌(Escherichia coli)中高效表达。本研究设计并表达了重组截断型(recombinant truncated Ulp1-His6, rt Ulp1)、Spy Tag-rt Ulp1-Spy Catcher-His6 (crt Ulp1)和Spy-TagΔDA-rt Ulp1-Spy CatcherΔEQ-His6(lrt Ulp1)三种蛋白酶。综合比较3种蛋白酶的最适反应条件以及热稳定性,结果显示,crt Ulp1的最佳反应酶切温度比lrt Ulp1高10℃,比rt Ulp1高5℃。crt Ulp1在40℃条件下孵育2 h后仍保留87.3%的相对酶活,lrt Ulp1在40℃条件下孵育2 h后仍保留43.69%的相对酶活,而rt Ulp1几乎丧失了全部的酶活。且crt Ulp1在广泛的酸碱范围内都能保持较高的酶活,而rt Ulp1与lrt Ulp1只在其最佳反应p H下表现出较高的酶切活性。本研究利用Spy Tag/Spy Catcher技术获得了高稳定性的rt Ulp1,评价了环化结构对rt Ulp1热稳定性的影响以及Spy Tag/Spy Catcher技术对rt Ulp1热稳定性提高的效果,为获得具有高热稳定性的SUMOs特异性蛋白酶及促溶标签SUMOs的广泛使用提供技术基础。

关键词：小泛素样修饰蛋白(SUMOs) 泛素样特异蛋白酶1 (Ulp1) 重组截断型Ulp1 spytag/spycatcher 环化结构稳定性

spytag/spycatcher环化技术对rtULP1热稳定性的提高及效果评价

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SpyTag/SpyCatcher环化技术对rtULP1热稳定性的提高及效果评价

作者：郭婉莹河南农业大学

学位级别：硕士

spytag/spycatcher环化技术基于一种自发迅速的共价连接反应,是一种通过环化蛋白的骨架以实现目标蛋白的环化,从而提高目标蛋白稳定性的技术。已有研究结果显示spytag/spycatcher技术介导的环化过程不受环境的影响,不会影响目标蛋白原... 详细信息

spytag/spycatcher环化技术基于一种自发迅速的共价连接反应,是一种通过环化蛋白的骨架以实现目标蛋白的环化,从而提高目标蛋白稳定性的技术。已有研究结果显示spytag/spycatcher技术介导的环化过程不受环境的影响,不会影响目标蛋白原本的催化活性和功能,且一旦完成便具有极强的稳定性。小泛素样类修饰蛋白（SUMO）是一种十分有效的促溶标签,广泛的应用在重组蛋白的原核表达过程中。泛素样类特异蛋白酶1（ULP1）是SUMO的特异性蛋白酶（ULP）中的一个重要成员,具有将SUMO从目标融合蛋白上切下不残留任何氨基酸碱基的特异性酶切活性,且参与SUMO的成熟过程,但其较差的稳定性限制了它的应用。本文利用spytag/spycatcher技术环化ULP1,以期获得具有较好的热稳定性的SUMO特异性蛋白酶,为促溶标签SUMO的广泛使用提供支持。本研究使用截断型ULP1（Gly304-Lys621,t ULP1）代替全长的ULP1并对其序列进行了优化,得到了重组截断型ULP1（rtULP1,Gly304-Lys621）。rtULP1既具有ULP1全部的酶活性又能更好的在大肠杆菌中高效表达。本研究设计并表达了rtULP1、Spy Tag-rtULP1-Spy Catcher（crtULP1）、Spy Tag（DA）-rtULP1-Spy Catcher（EQ）（lrtULP1）三种蛋白酶。综合比较了三种蛋白酶的最适反应条件以及热稳定性,更客观的评价了环化结构对rtULP1热稳定性的影响以及spytag/spycatcher技术对rtULP1热稳定性提高的效果。结果显示,crtULP1的最佳反应酶切温度比lrtULP1高10℃,比rtULP1高5℃。crtULP1在40℃条件下孵育2 h后仍保留87.3%的相对酶活,lrtULP1在40℃条件下孵育2 h后仍保留43.69%的相对酶活,而rtULP1几乎丧失了全部的酶活。且crtULP1在广泛的酸碱范围内都能保持较高的酶活,而rtULP1与lrtULP1只在其最佳反应p H下表现出较高的酶切活性。综合分析实验结果,最终得到spytag/spycatcher介导的环化技术的确非常有效的提高了rtULP1的稳定性,是一种能显著提高rtULP1热稳定性的有效策略。

关键词： SUMO rtULP1 crtULP1 lrtULP1 spytag/spycatcher 环化结构热稳定性

利用spytag/spycatcher构建自组装多酶复合体实现高效生物合成

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利用SpyTag/SpyCatcher构建自组装多酶复合体实现高效生物合成

作者：刘璐上海交通大学

学位级别：硕士

多酶复合体系因其高效的整体催化能力已成为合成生物学的研究热点,构建高效稳定的人工多酶反应器在生物催化领域具有广阔的应用前景。在已有的报道中,研究者模拟和借鉴天然催化体系多酶组装的策略,建立了多种组装方法,包括蛋白融合技术... 详细信息

多酶复合体系因其高效的整体催化能力已成为合成生物学的研究热点,构建高效稳定的人工多酶反应器在生物催化领域具有广阔的应用前景。在已有的报道中,研究者模拟和借鉴天然催化体系多酶组装的策略,建立了多种组装方法,包括蛋白融合技术、骨架介导的自组装技术和固定化技术等,且应用这些策略在细菌体内外成功构建了高效稳定的人工多酶复合物,提高了级联反应催化效率。然而上述组装模块存在许多问题,如多酶复合物不稳定,易受环境因素影响;只能在特定末端进行组装;只适用于体外系统等。因此探索和挖掘新型组装模块,构建更加稳定且适用范围更广的多酶催化组装体系仍具有重要实际意义。spycatcher和spytag互作蛋白可在各种条件下通过自发反应形成共价键,产生稳定的分子自组装体,在蛋白质领域获得了广泛应用。为了探索spytag/spycatcher在大肠杆菌体内外多酶复合体系形成有序自组装分子的能力,本研究将spycatcher和spytag分别与细胞色素单加氧酶突变体P450BM3m(A74G/F87V/L188Q)和葡萄糖脱氢酶(Glucose dehydrogenase,GDH)进行融合表达,以期产生具有辅酶再生循环系统、高效生物合成靛蓝分子的spytag/spycatcher双酶自组装复合体。本课题主要包括体外实验和体内实验两部分。体外实验部分,首先对融合蛋白spytag-GDH、spycatcher-P450BM3m和原始酶GDH、P450BM3m进行表达纯化,酶活测定结果显示,蛋白融合不影响原始蛋白的催化活力。然后通过混合融合蛋白spytag-GDH和spycatcher-P450BM3m获得双酶复合物,并利用SDS-PAGE蛋白电泳和动态光散射实验证实体外成功实现了多酶复合物的自组装。对自组装双酶复合物和游离双酶系统的催化活力和温度稳定性进行分析,结果显示自组装多酶复合物能有效提高级联反应初速率,当NADP浓度为20μmol/L时,自组装多酶复合体系的催化速率是游离双酶系统的1.7倍;且自组装多酶复合物具有更优良的温度稳定性,孵育时间越长温度越高,自组装复合物稳定性优势愈加明显。体内实验部分,首先构建重组质粒pACYCDuet1-GDH和pACYCDuet1-spytag-GDH,将pACYCDuet1-spytag-GDH和pET28a-spycatcher-P450BM3m同时转入E.coli BL21(DE3),构建共表达spytag-GDH和spycatcher-P450BM3m的重组工程菌。SDS-PAGE蛋白电泳、Western Blotting及质谱结果证实spycatcher-P450BM3m与spytag-GDH在大肠杆菌胞内成功形成了自组装多酶复合体。对不同培养条件下组装体合成靛蓝的能力进行系统分析,结果表明,当自组装多酶复合物细胞培养至OD为0.6-0.8时加入0.5mmol/L IPTG在16℃继续培养18 h,工程菌对吲哚(2 mmol/L)与葡萄糖(4 mmol/L)的全细胞催化能力最强,靛蓝产量最高达258 mg/L,是未组装游离多酶系统的1.9倍,比P450BM3m单酶表达系统高约2.4倍;反应70 min后达到反应平衡,转化率为52%,证实了含有自组装辅酶再生系统的细菌具有更优生物合成效率。本研究成功实现了spytag/spycatcher介导的多酶体系在大肠杆菌体内和体外的自组装和高效转化体系,为体外多酶复合物组装体的设计和利用细胞工厂高效生产相关目标化学品提供了新思路。

关键词： spytag/spycatcher 自组装多酶复合物辅酶再生靛蓝

spytag/spycatcher体系蛋白共价连接条件的分析

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国际生物制品学杂志 2021年第5期44卷 271-275页

作者：王蓓胡海涛楼觉人上海至成生物科技有限公司研发部 200051 上海生物制品研究所有限责任公司第二研究室 200051

目的比较不同实验条件下spytag/spycatcher体系共价连接的效率,分析得出优化后的连接条件,为今后相关纳米颗粒疫苗的开发提供实验依据。方法用大肠埃希菌表达分别带有spytag和spycatcher结构的两种蛋白,摸索共价连接的反应时间、温度、... 详细信息

目的比较不同实验条件下spytag/spycatcher体系共价连接的效率,分析得出优化后的连接条件,为今后相关纳米颗粒疫苗的开发提供实验依据。方法用大肠埃希菌表达分别带有spytag和spycatcher结构的两种蛋白,摸索共价连接的反应时间、温度、缓冲体系和混合比例,采用非还原型凝胶电泳检测共价连接的效率。结果反应时间对共价连接的影响有统计学意义(F=22.028,Pspytag和spycatcher结构的两种蛋白质可形成稳定的共价键,6 h后连接效率约为50%,偶联蛋白在25℃稳定存在至少72 h。反应温度和缓冲体系对共价连接的影响没有统计学意义。spytag和spycatcher结构蛋白比例为物质的量比1.0∶2.0混合。结论spytag/spycatcher共价连接体系的关键工艺参数为反应时间,且该体系能适用于多种温度和缓冲条件。

关键词： spytag/spycatcher 共价键共价连接效率

基于分步偶联策略的抗原与CpG佐剂定点共价结合技术研究

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军事医学 2023年第2期47卷 127-134页

作者：孙燕歌黄竞石怡昕郭艳潘超王恒樑朱力军事科学院军事医学研究院生物工程研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071

目的基于分步偶联策略,借助经典的马来酰亚胺-巯基交联反应与异肽键分子黏合方法(spytag/spycatcher系统),建立抗原与CpG佐剂的定点共价结合技术。方法设计合成马来酰亚胺修饰的CpG-1018和N端加有半胱氨酸的spytag短肽,将二者于20℃... 详细信息

目的基于分步偶联策略,借助经典的马来酰亚胺-巯基交联反应与异肽键分子黏合方法(spytag/spycatcher系统),建立抗原与CpG佐剂的定点共价结合技术。方法设计合成马来酰亚胺修饰的CpG-1018和N端加有半胱氨酸的spytag短肽,将二者于20℃振荡孵育以获得中间产物spytag-CpG。将spycatcher与蛋白抗原Omp19融合表达,通过亲和层析及凝胶过滤层析获得spycatcher-Omp19重组蛋白。通过本实验室构建的志贺菌多糖抗原spycatcher-OPS糖蛋白表达系统,获得spycatcher-OPS糖蛋白。将spytag-CpG分别与spycatcher-Omp19重组蛋白和spycatcher-OPS糖蛋白连接,获得CpG佐剂与抗原共价偶联终产物CpG-Omp19和CpG-OPS,经SDS-PAGE分离后,通过荧光分析验证终产物结构。结果马来酰亚胺和FAM同时标记的CpG-1018和spytag连接后,SDS-PAGE检测结果可见对应于spytag-CpG交联产物的高相对分子质量条带。马来酰亚胺修饰的CpG-1018与spytag连接后,质谱分析结果显示,spytag-CpG的相对分子质量与其理论相对分子质量相符合。将中间产物spytag-CpG与蛋白抗原spycatcher-Omp19、多糖抗原spycatcher-OPS孵育连接后,考马斯亮蓝染色和FAM荧光检测均可见对应于终产物CpG-Omp19和CpG-OPS的高相对分子质量条带。结论成功建立基于分步偶联策略的抗原与CpG佐剂定点共价结合技术,获得了CpG佐剂与两种不同类型抗原的偶联终产物CpG-Omp19和CpG-OPS,为未来开发质量可控的自佐剂疫苗奠定了基础。

关键词： CpG佐剂 spytag/spycatcher 自佐剂疫苗分步偶联定点共价结合