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中国兽医科学 2023年第9期53卷 1200-1206页

作者：李东晓李佳容赵子惠常倩雯白涛范小瑞贺俊平山西农业大学动物医学学院山西太谷030801

为探究热应激对猪睾丸spo11、DNA双链断裂分子标记γH2AX和DNA重组修复分子标记Rad51表达和定位的影响,笔者构建了环境热应激(37℃环境温度,每日加热3 h,连续7 d)和睾丸局部热应激(42℃,局部阴囊加热1 h)的猪动物模型,未处理组猪睾丸作... 详细信息

为探究热应激对猪睾丸spo11、DNA双链断裂分子标记γH2AX和DNA重组修复分子标记Rad51表达和定位的影响,笔者构建了环境热应激(37℃环境温度,每日加热3 h,连续7 d)和睾丸局部热应激(42℃,局部阴囊加热1 h)的猪动物模型,未处理组猪睾丸作为对照。通过免疫组织化学染色、Western-blot和qRT-PCR等方法检测spo11、Rad51和γH2AX在猪睾丸中的表达和定位。免疫组化结果显示,对照组生精小管内可见各级生精细胞,spo11和Rad51主要定位于初级精母细胞的细胞核,γH2AX免疫阳性染色见于初级精母细胞的细胞核。与对照组相比,环境热应激组初级精母细胞的细胞核spo11和γH2AX免疫阳性着色无明显差异,Rad51免疫阳性着色较弱;局部热应激组初级精母细胞的细胞核spo11、Rad51和γH2AX免疫阳性着色较强,细胞定位未发生变化。Western-blot和qRT-PCR结果显示,与对照组相比,环境热应激组spo11蛋白、m RNA和γH2AX蛋白水平均无显著差异,Rad51蛋白和m RNA表达水平均显著降低(Pspo11蛋白和m RNA表达水平均显著增加(Pspo11和γH2AX蛋白表达水平无显著影响,下调Rad51表达水平,提示DNA双链断裂后修复受损;局部热应激上调初级精母细胞spo11、Rad51和γH2AX表达水平,提示DNA双链断裂增加。

关键词： spo11 DNA双链断裂 Rad51 γH2AX 热应激猪

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温度升高对猪和大鼠睾丸spo11表达和定位及其诱导DNA双链断裂的影响

温度升高对猪和大鼠睾丸Spo11表达和定位及其诱导DNA双链断裂的影...

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作者：李东晓山西农业大学

学位级别：硕士

目的:大多数哺乳动物的睾丸下降到阴囊内悬挂在体外,比体温低3-8°C。当阴囊温度或者环境温度超过其生理温度时,减数分裂DNA双链断裂与修复受损。目前仍不清楚温度升高是否通过影响DNA核酸内切酶spo11表达和定位,进而诱导减数分裂DNA双... 详细信息

目的:大多数哺乳动物的睾丸下降到阴囊内悬挂在体外,比体温低3-8°C。当阴囊温度或者环境温度超过其生理温度时,减数分裂DNA双链断裂与修复受损。目前仍不清楚温度升高是否通过影响DNA核酸内切酶spo11表达和定位,进而诱导减数分裂DNA双链断裂与修复失衡。本研究目的是探究体温或者超过体温对睾丸spo11(sporulation-deficient mutants 11,spo11)、DNA双链断裂分子标记γH2AX和DNA重组修复分子标记Rad51表达和定位的影响,为生殖细胞不耐热的分子机制提供参考。方法:为了探究体温环境对精子发生的影响,手术构建大鼠单侧腹部隐睾模型(n=6),选择了3头自发性单侧隐睾猪。所有隐睾动物的对侧正常睾丸作为对照;隐睾大鼠分别于术后2天和14天乙醚麻醉后解剖双侧睾丸。此外环境温度和睾丸局部温度升高对睾丸spo11的表达和定位及其诱导DNA双链断裂是否也有影响仍不清楚,构建了环境热应激(每天将公猪置于37°C环境温度3 h,连续7天)(n=3)和局部热应激(42°C阴囊加热1 h)(n=3)公猪模型。未热处理的猪(n=3)作为对照。热处理后阉割取公猪的双侧睾丸。睾丸组织一部分装于冻存管存于液氮,用于提取总RNA和蛋白。一部分Bouin氏固定液固定,用于制备石蜡切片。通过Western blot、免疫组织化学染色及q RT-PCR等实验技术检测睾丸组织中spo11、DNA双链断裂的分子标记γH2AX和重组修复标记Rad51的表达和定位。结果:1 Western Blot结果显示:与对照组睾丸相比,2天大鼠隐睾睾丸组织中spo11和γH2AX蛋白表达水平没有显著差异,Rad51蛋白表达水平显著降低(pspo11蛋白表达水平显著升高(pspo11的蛋白表达水平显著升高(pspo11蛋白表达水平没有明显差异,Rad51和γH2AX蛋白表达水平显著降低(pspo11和RAD51定位于初级精母细胞的细胞核,γH2AX免疫阳性着色可在初级精母细胞细胞核被观察到。(2)2天大鼠隐睾与环境热应激睾丸组织中观察到初级精母细胞和圆形精子细胞数量减少,免疫组织化学结果相似。与对照组睾丸相比,初级精母细胞细胞核spo11和γH2AX免疫阳性着色无明显差异,Rad51免疫阳性着色较弱。(3)局部热应激睾丸组织生精小管内观察到精原细胞、少数初级精母细胞和精子细胞。与对照组睾丸相比,初级精母细胞细胞核spo11、Rad51和γH2AX免疫阳性着色较强。(4)14天大鼠隐睾与猪自发性隐睾睾丸组织中,除精原细胞和少数初级精母细胞外均未见减数分裂后生精细胞,免疫组织化学结果相似。与对照组睾丸相比,初级精母细胞细胞核spo11免疫阳性着色较强,未见Rad51和γH2AX免疫阳性细胞。3 qRT-PCR结果显示:与对照组睾丸相比,2天大鼠隐睾睾丸组织中spo11和Rad51 m RNA表达水平均显著降低;环境热应激睾丸组织中spo11 m RNA的表达水平没有显著变化,Rad51 m RNA的表达水平显著降低;局部热应激睾丸组织中spo11 m RNA的表达水平显著升高,Rad51 m RNA的表达水平显著降低;14天大鼠隐睾和猪自发性隐睾睾丸组织中spo11和Rad51m RNA表达水平均显著降低。结论:2天隐睾与环境热应激对spo11和γH2AX蛋白表达水平没有显著影响,下调Rad51表达水平,提示DNA双链断裂后修复受损;局部热应激上调初级精母细胞spo11、Rad51和γH2AX表达水平,提示DNA双链断裂增加;14天隐睾与自发性隐睾上调spo11蛋白表达水平,下调Rad51和γH2AX表达水平,提示DNA双链断裂减少。

关键词： spo11 DNA双链断裂 Rad51 γH2AX 温度睾丸

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嗜热四膜虫spo11基因缺陷型细胞株的基因表达变化分析

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基因组学与应用生物学 2016年第2期35卷 350-357页

作者：张晶闫冠雄田苗袁冬霞熊杰缪炜中国科学院水生生物研究所水生生物多样性与保护重点实验室武汉430072 中国科学院大学北京100049

有性生殖的关键过程是通过减数分裂产生生殖细胞,而减数分裂的一个重要环节是进行基于DNA双链断裂的同源染色体重组。在同源染色体重组过程中,spo11蛋白催化产生DNA双链断裂,从而起始同源染色体的重组。因此,研究spo11基因缺失在减数分... 详细信息

有性生殖的关键过程是通过减数分裂产生生殖细胞,而减数分裂的一个重要环节是进行基于DNA双链断裂的同源染色体重组。在同源染色体重组过程中,spo11蛋白催化产生DNA双链断裂,从而起始同源染色体的重组。因此,研究spo11基因缺失在减数分裂过程中所引起的基因表达变化有助于在转录组水平上了解该基因的作用。本研究通过对嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)野生型和spo11敲除细胞株在接合生殖时期2 h、3 h、4 h、5 h四个时间点的转录组进行高通量测序。通过差异表达基因分析和功能富集分析,发现spo11基因敲除之后嗜热四膜虫在接合生殖时期2 h时,与DNA代谢过程和DNA复制相关基因的表达发生变化,推测spo11基因敲除导致的减数分裂过程异常可能与DNA代谢过程和DNA复制相关。

关键词：嗜热四膜虫减数分裂 spo11 基因表达转录组

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DNA/RNA helicase DHX36 is required for late stages of spermatogenesis

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Journal of Molecular Cell Biology 2022年第11期14卷 50-61页

作者： Kejia Zhang Tianxin Zhang Yujie Zhang Jinyu Yuan Xinzhe Tang Chaobao Zhang Qianqian Yin Yonglian Zhang Ming-Han Tong School of Life Science Hangzhou Institute for Advanced StudyUniversity of Chinese Academy of SciencesChinese Academy of SciencesHangzhou 310024China State Key Laboratory of Molecular Biology Shanghai Key Laboratory of Molecular AndrologyShanghai Institute of Biochemistry and Cell BiologyCenter for Excellence in Molecular Cell ScienceUniversity of Chinese Academy of SciencesChinese Academy of SciencesShanghai 200031China

Spermatogenesis is a highly complex developmental process that typically consists of mitosis, meiosis, and spermiogenesis. DNA/RNA helicase DHX36, a unique guanine-quadruplex (G4) resolvase, plays crucial roles in a variety of biological processes. We previously showed that DHX36 is highly expressed in male germ cells with the highest level in zygotene spermatocytes. Here, we deleted Dhx36 in advanced germ cells with Stra8-GFPCre and found that a Dhx36 deficiency in the differentiated spermatogonia leads to meiotic defects and abnormal spermiogenesis. These defects in late stages of spermatogenesis arise from dysregulated transcription of G4-harboring genes, which are required for meiosis. Thus, this study reveals that Dhx36 plays crucial roles in late stages of spermatogenesis.

关键词： Dhx36 meiosis guanine-quadruplex(G4) spo11 synapsis meiotic recombination crossover

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拟南芥spo11基因的生物信息学分析

拟南芥SPO11基因的生物信息学分析

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作者：谢冰心郑州大学

学位级别：硕士

减数分裂是有性生殖生物进行细胞分裂时具有的一种特殊的分裂方式，在减数分裂过程中同源染色体的非姐妹染色单体之间个别片段发生交换(基因重组)，这不仅增加了基因的遗传多样性，而且为自然选择提供了更多的原材料。减数分裂是有性生... 详细信息

减数分裂是有性生殖生物进行细胞分裂时具有的一种特殊的分裂方式，在减数分裂过程中同源染色体的非姐妹染色单体之间个别片段发生交换(基因重组)，这不仅增加了基因的遗传多样性，而且为自然选择提供了更多的原材料。减数分裂是有性生殖的物种进行世代交替的转折点，而同源重组是减数分裂过程的关键。 spo11是Ⅱ型拓扑异构酶的同源蛋白，能够催化DNA双链缺口的形成，从而起始减数分裂重组的发生。在拟南芥中spo11含有三个同源基因分别是spo11-1、spo11-2和spo11-3，与其他物种中spo11蛋白序列有20%到30%的相似性。三个基因分别在两个途径中发挥作用：spo11-1和spo11-2基因主要在减数分裂重组中发挥作用，且二者存在相互作用;spo11-3主要在DNA修复过程中发挥作用，三者都是减数分裂特异性蛋白，也是DSB形成所必须的蛋白。spo11基因在很多物种中均存在，说明该基因是保守的。主要研究结果如下： 1、利用生物信息学的方法对spo11基因及其编码的蛋白进行分析通过对spo11基因进行开放阅读框、编码氨基酸序列、基因的基本理化性质等分析;编码蛋白的疏水性位点、跨膜区域、信号肽、蛋白质结构位点等进行分析，可以使我们更加清楚的了解减数分裂重组的调控机制。 2、电子克隆基因的获得由于玉米和油菜EST数据库很丰富，但关于spo11基因方面的研究很少，本研究的电子克隆选取在玉米和油菜数据库中进行。分别以拟南芥中的spo11-1、spo11-2、spo11-3基因为探针序列，采用BLAST检索工具获得若干相似性序列，利用CAP拼接程序进行拼接，获得了在玉米和油菜中的克隆序列。 3、不同物种中spo11蛋白的生物信息学分析利用生物信息学方法对氨基酸序列进行相关分析如保守氨基酸位点、保守结构域及蛋白质超家族等。分析可知，spo11蛋白在不同物种中有五个保守区域及四个保守氨基酸，表明spo11蛋白在不同物种中有一定的保守性。spo11蛋白除了玉米spo11-1蛋白外均含有TORPIMOPOIIBPO结构域，另外除了油菜的三个spo11同源基因外均含有TP6A结构域。三个物种的spo11基因分属于两个不同的超家族TORPIM和TP6A。电子克隆的出现，使得在较短的时间内克隆一个新的基因成为了可能。

关键词：减数分裂重组 DNA双链缺口 spo11 生物信息学分析电子克隆

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Double-stranded DNA breaks and gene functions in recombination and meiosis

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Cell Research 2006年第5期16卷 402-412页

作者： Wuxing Li~1 Hong Ma~1 ~1The Department of Biology,The Intercollege Graduate Degree Program in Plant Physiology,The Huck Institutes of the Life Sciences,The Pennsylvania State University,University Park,PA 16802,USA The Department of Biology The Intercollege Graduate Degree Program in Plant Physiology The Huck Institutes of the Life Sciences The Pennsylvania State University University Park USA

Meiotic prophase Ⅰ is a long and complex phase.Homologous recombination is an important process that occursbetween homologous chromosomes during meiotic prophase Ⅰ.Formation of chiasmata,which hold homologous chro-mosomes together until the metaphase Ⅰ to anaphase Ⅰ transition,is critical for proper chromosome segregation.Recentstudies have suggested that the spo 11 proteins have conserved functions in a number of organisms in generating sites ofdouble-stranded DNA breaks (DSBs) that are thought to be the starting points of homologous recombination.Processingof these sites of DSBs requires the function of RecA homologs,such as RAD51,DMC 1,and others,as suggested bymutant studies;thus the.failure to repair these meiotic DSBs results in abnormal chromosomal alternations,leading todisrupted meiosis.Recent discoveries on the functions of these RecA homologs have improved the understanding of themechanisms underlying meiotic homologous recombination.

关键词： meiosis homologous recombination double-stranded DNA breaks spo11 RAD51 DMC1

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作者：傅鸣上海交通大学

学位级别：硕士

减数分裂是有性生殖中的关键环节,减数分裂不仅保持物种遗传物质的稳定传递,同时通过同源染色体非姐妹染色单体的交叉互换产生基因重组,增强了群体的遗传多样性,是生物适应和进化的重要基础。减数分裂所特有的重组过程起始于DNA双链断... 详细信息

减数分裂是有性生殖中的关键环节,减数分裂不仅保持物种遗传物质的稳定传递,同时通过同源染色体非姐妹染色单体的交叉互换产生基因重组,增强了群体的遗传多样性,是生物适应和进化的重要基础。减数分裂所特有的重组过程起始于DNA双链断裂的形成(DNA double strand break,DSB),目前水稻减分过程中DSB的形成机制还很不清楚。在本研究中,我们通过Coγ-射线诱变得到一个水稻雌雄均不育的突变体osmtopVIB。遗传分析发现,突变体与野生型杂交的F2代植株中可育和不育植株的分离比为3:1,表明该突变体表型是由一个隐性单基因突变导致的。表型观察显示该突变体营养生殖阶段正常,但进入生殖阶段后,虽然花器官形态正常但不能产生可育的花粉粒。半薄切片和DAPI染色观察显示,osmtopVIB突变体的减数分裂过程存在异常,在减数分裂的前期I中,同源染色体不能完成配对过程。通过免疫荧光染色实验发现,轴向元件REC8、PAIR2和PAIR3可以正常定位在突变体染色体上,而中央元件ZEP1不能在染色体上正常定位,说明突变体无法完成联会复合体的装配。减数分裂重组过程始于DSB的形成。DSB特异性抗体γH2AX免疫定位结果显示在osmtopVIB突变体中没有γH2AX信号,表明突变体的DSB形成存在缺陷。同时,同源重组标记蛋白DMC1和MER3均不能定位在突变体中,进一步证明了突变体不能正常进行同源重组。因此我们认为OsMTOPVIB的功能缺失导致水稻减数分裂DSB过程无法正常进行,使依赖于DSB形成的同源配对、联会和重组过程受到阻碍,从而导致水稻雌雄不育。通过图位克隆和高通量测序,我们发现6号染色体上的一个基因LOCs06g49450中的第二个外显子内有1个碱基的缺失,导致蛋白翻译提前终止。对OsMTOPVIB的序列和结构分析表明,OsMTOPVIB与topo VIB亚基具有同源性,并且具有TOPVIB的四个典型结构域,包括GHKL结构域,SmD,transducer结构域和C-terminal结构域。进一步的酵母双杂交实验显示,OsMTOPVIB分别与水稻中的spo11-1和spo11-4相互作用,说明OsMTOPVIB可能与spo11-1和spo11-4结合形成复合体催化减数分裂DSB的形成。这些结果表明,OsMTOPVIB在水稻减数分裂过程中发挥重要作用,同时这也是首次在单子叶植物水稻中发现的topo VIB的同源蛋白,对于理解topo VIB在减数分裂DSB形成中的保守功能提供了新的认识。

关键词：水稻减数分裂 OsMTOPVIB DSB topo VIB spo11

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