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猪传染性胃肠炎病毒spike蛋白亲和肽的原核表达

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西北农林科技大学学报（自然科学版） 2020年第1期48卷 49-56页

作者：于天飞董慧莹谢鹏宇孙婉姝尹海畅黎明于志丹齐齐哈尔大学生命科学与农林学院黑龙江齐齐哈尔161006 齐齐哈尔大学计算机与控制工程学院黑龙江齐齐哈尔161006 黑龙江省抗性基因工程与寒地生物多样性保护重点实验室黑龙江齐齐哈尔161006

【目的】原核表达猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus of swine,TGEV)spike蛋白亲和肽(SQHT),检测其病毒亲和性,为建立TGEV诊断方法奠定理论和物质基础。【方法】人工合成TGEV spike蛋白亲和肽基因,亚克隆后将该... 详细信息

【目的】原核表达猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus of swine,TGEV)spike蛋白亲和肽(SQHT),检测其病毒亲和性,为建立TGEV诊断方法奠定理论和物质基础。【方法】人工合成TGEV spike蛋白亲和肽基因,亚克隆后将该基因分别插入至原核表达载体pET-32a和pGEX-6p-1中,构建重组质粒pET-32a-SQHT和pGEX-6p-SQHT,对重组质粒进行BamHⅠ单酶切和BamHⅠ/XhoⅠ双酶切及测序鉴定。将重组质粒分别转化至大肠杆菌Rosetta(DE3),用IPTG进行诱导表达,对其表达产物的生物学活性进行检测。【结果】亚克隆获得了150 bp的TGEV spike蛋白亲和肽基因。成功构建了重组质粒pET-32a-SQHT和pGEX-6p-SQHT,并诱导表达出重组蛋白TRX-SQHT和GST-SQHT,其分子质量分别为25和31 ku。Western blot分析表明,2种重组蛋白与TGEV病毒粒子具有良好的亲和性;Dot-ELISA分析表明,2种重组蛋白与TGEV病毒粒子的最低结合滴度TCID50为5×102 mL-1。特异性试验表明,重组蛋白TRX-SQHT和GST-SQHT均可与TGEV产生特异性结合,而不与猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪轮状病毒(PoRV)结合。【结论】使用原核细胞成功表达了TGEV spike蛋白亲和肽,表达的重组蛋白具有很好的TGEV特异亲和性。

关键词：猪传染性胃肠炎病毒 spike蛋白亲和肽原核表达

SARS冠状病毒S基因的最近共同祖先序列重建及spike蛋白的适应性进化检测

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科学通报 2004年第11期49卷 1121-1122页

作者：张原郑楠郝沛钟扬中国科学院植物研究所系统与进化植物学开放实验室北京100093 北京师范大学生命科学学院中国科学院上海生命科学研究院生物信息中心复旦大学生命科学学院上海200433

严重急性呼吸系统综合症(severe acute respiratory syndrome,SARS)病原体--SARS冠状病毒(SARS-CoV)的基因组结构和表达模式已被详细描述[1～10].spike蛋白作为冠状病毒粒子表面的结构性糖蛋白,负责结合宿主细胞受体,诱导病毒包膜和细... 详细信息

严重急性呼吸系统综合症(severe acute respiratory syndrome,SARS)病原体--SARS冠状病毒(SARS-CoV)的基因组结构和表达模式已被详细描述[1～10].spike蛋白作为冠状病毒粒子表面的结构性糖蛋白,负责结合宿主细胞受体,诱导病毒包膜和细胞膜的融合,刺激机体产生中和抗体并与介导细胞发生免疫反应[1].……

关键词： SARS冠状病毒 S基因最近共同祖先序列 spike蛋白适应性严重急性呼吸系统综合症

SARS病毒spike蛋白具有中和活性的抗原表位预测和初步鉴定

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细胞与分子免疫学杂志 2006年第5期22卷 628-629,632页

作者：潘浩周晓明朱凤才史智扬李显郭喜玲韩卫宁汪华江苏省疾病预防控制中心江苏南京210009 香港中文大学微生物系苏州市疾病预防控制中心检验科江苏苏州215000

目的:预测并合成SARS病毒spike蛋白中具有中和活性的抗原表位,鉴定其在免疫检测和疫苗设计中的作用。方法:使用二级结构以及基因组对比预测方法,预测spike蛋白中具有较高抗原活性的肽段序列并人工合成。用直接ELISA法检测在SARS确诊阳... 详细信息

目的:预测并合成SARS病毒spike蛋白中具有中和活性的抗原表位,鉴定其在免疫检测和疫苗设计中的作用。方法:使用二级结构以及基因组对比预测方法,预测spike蛋白中具有较高抗原活性的肽段序列并人工合成。用直接ELISA法检测在SARS确诊阳性患者血清和健康人血清之间相应抗体的检出差别,确定预测肽段是否为SARS的抗原肽段。结果:预测并人工合成了具有抗原活性的GEVFNATKFPSVYAW多肽,在ELISA检测中,可检测出SARS阳性血清中的针对性抗体,阳性符合率为71.4%,在健康人血清中不能检测出对应的抗体,阴性符合率为92%。结论:预测并合成了具有SARS病毒spike蛋白的中和表位抗原,其特异性高于全病毒抗原,为SARS的诊断及疫苗的设计奠定了基础。

关键词： SARS病毒 spike蛋白多肽中和表位

冠状病毒spike蛋白及其针对性治疗研究进展

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南京医科大学学报（自然科学版） 2021年第7期41卷 1095-1103页

作者：林欢冯旰珠南京医科大学第二附属医院呼吸与危重症医学科江苏南京210011

冠状病毒(coronavirus,CoV)是可以感染人类及动物的正链RNA病毒,其包含的最大RNA基因组长度为32 kb,可分为4类:α、β、γ和δ。冠状病毒颗粒包含4个标准结构蛋白:包膜蛋白(E)、膜蛋白(M)、核衣壳蛋白(N)和刺突蛋白(S)。S蛋白既包含受... 详细信息

冠状病毒(coronavirus,CoV)是可以感染人类及动物的正链RNA病毒,其包含的最大RNA基因组长度为32 kb,可分为4类:α、β、γ和δ。冠状病毒颗粒包含4个标准结构蛋白:包膜蛋白(E)、膜蛋白(M)、核衣壳蛋白(N)和刺突蛋白(S)。S蛋白既包含受体结合域(receptor-binding domain,RBD),又包含融合相关结构域,使其成为CoV进入过程中的关键蛋白。本文主要阐述S蛋白的主要结构、结构域以及该蛋白在病毒入侵宿主细胞过程中的自身水解切割、构象变化等相关特点,并就该蛋白的相关中和抗体以及CoV尤其是新型冠状病毒(SARS-CoV-2)灭活疫苗、亚单位疫苗RNA疫苗等研究现状进行介绍。

关键词：冠状病毒 spike蛋白受体结合域膜融合中和抗体

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spike蛋白的生物信息学研究分析

中国科技论文在线精品论文 2022年第3期15卷 288-294页

作者：郑柳凤伊嘉豪梁定发叶远浓贵州医科大学大健康学院生物信息学与生物医学大数据挖掘实验室贵阳550025

本研究通过挖掘国内外文献,系统地分析了spike(S)蛋白的作用机制和生物信息学方面的研究进展。总结目前国内外科学家利用生物信息学领域工具开发spike蛋白的药物、疫苗等方面的研究。此外,还对现有的spike蛋白数据资源进行了系统整理。... 详细信息

本研究通过挖掘国内外文献,系统地分析了spike(S)蛋白的作用机制和生物信息学方面的研究进展。总结目前国内外科学家利用生物信息学领域工具开发spike蛋白的药物、疫苗等方面的研究。此外,还对现有的spike蛋白数据资源进行了系统整理。总结分析了现有国内外与spike蛋白相关的生物信息学工具及数据库,最后对病毒spike蛋白在该领域的研究提出了展望。本综述旨在为研究spike蛋白的生物学家、病毒学家等研究人员提供系统的spike蛋白研究参考,以促进spike蛋白机制研究、有效药物和疫苗研发。

关键词：生物物理学 spike蛋白综述冠状病毒 SARS-CoV-2 生物信息学数据库

SARS冠状病毒spike蛋白受体结合域的表达及S1抗原表位多肽多克隆抗体制备

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SARS冠状病毒spike蛋白受体结合域的表达及S1抗原表位多肽多克隆...

作者：徐德意广州医学院

学位级别：硕士

目的利用大肠杆菌BL21原核表达系统对spike蛋白的受体结合域(RBD)片段进行融合表达,为进一步研究spike蛋白免疫原性及抗原特性提供了物质基础,同时建立HIS融合表达实验室系统;运用Fmoc技术合成纯化抗原多肽,免疫小鼠获得多克隆抗体,为... 详细信息

目的利用大肠杆菌BL21原核表达系统对spike蛋白的受体结合域(RBD)片段进行融合表达,为进一步研究spike蛋白免疫原性及抗原特性提供了物质基础,同时建立HIS融合表达实验室系统;运用Fmoc技术合成纯化抗原多肽,免疫小鼠获得多克隆抗体,为进一步研究抗体特性并应用于SARS疾病的预防、预后诊断及治疗提供了物质基础。方法 1、构建PET32(a)-RBD重组质粒进行原核表达依赖高效T4连接酶连接PET32(a)和RBD,转化感受态BL21大肠杆菌。提取质粒酶切电泳初步确定获得PET32(a)-RBD重组质粒,送TaKaRa公司测序。以IPTG诱导BL21大肠杆菌对融合蛋白进行表达,运用聚丙烯酰胺凝胶电泳及Western-blotting来检测表达产物,保存菌种。 ***-CoV的S1蛋白抗原表位多肽合成及其抗体的制备以DNAstar软件对S1蛋白RBD片段的原始序列进行软件分析,选择三段亲水性强,抗原指数高的多肽,运用Fmoc固相法合成三条肽链:CQ19(CFSNVYADSFVVK GDDVRQ)、TY-14(TRNIDATSTGNYNY)和LV-11 (LRPFERDISNV),分别与KLH和BSA偶联成三条具有免疫原性多肽:KLH(BSA)-CQ19 KLH(BSA)-LV11 KLH(BSA)-TY14,免疫BABL/c小鼠剪尾取血检测抗体产生情况(ELISA法)。小鼠在第一次免疫注射之前,首先剪尾取血,该血清作为阴性对照加0.05% NaN3-70℃保存。结果 1、PET32(a)-RBD重组质粒构建及其表达: (1)重组质粒构建及鉴定:琼脂糖凝胶电泳及测序表明重组质粒PET32(a)-RBD构建成功。 (2)IPTG诱导融合蛋白表达:SDS-PAGE及Western-blotting实验表明融合蛋白在IPTG诱导下大量表达,未经IPTG诱导的细菌对融合蛋白几乎不表达。(见图1.3)。 2、合成多肽制备抗体: (1)分析S蛋白:根据DNAstar软件分析筛选S蛋白三段多肽:CQ19(378～396AA)、TY14(425～438AA)、LV11(448～458AA)具有较强抗原性和亲水性。 (2)多肽合成:氨基酸组分析表明合成正确序列CQ19、TY14、LV11多肽。 (3) KLH-CQ19免疫小鼠获得抗CQ19多克隆抗体:ELISA检测血清结果表明抗体产生为弱阳性。1:10和1:10滴度OD值约等于阴性对照2倍。 (4) KLH-LV11、KLH-TY14免疫小鼠均无抗体产生。结论 1、本研究构建了PET32(a)-RBD重组质粒,获得融合蛋白在IPTG诱导下的稳定表达,建立本实验室PET32(a)载体融合的平台,为进一步对SARS-CoVspike蛋白的研究奠定了基础,但其纯化效果及蛋白在纯化后所具有的免疫特性还有待进一步研究。 2、应用软件分析技术,合成高纯度抗原多肽片断,免疫动物实验可获得抗CQ19多克隆抗体,为抗spike蛋白抗体的后续研究及临床应用抗体治疗及预防SARS疾病提供了可能。

关键词： SARS spike蛋白受体结合域表达多肽抗体

多物种ACE2与SARS-CoV-2 spike蛋白结合力分析及组织差异表达

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多物种ACE2与SARS-CoV-2 Spike蛋白结合力分析及组织差异表达

作者：王刚昆明理工大学

学位级别：硕士

由新型冠状病毒感染导致新冠肺炎,在全球范围内发展迅猛,对全人类的生命健康和经济发展造成了严重影响。2020年2月11日,世界卫生组织(WHO)正式将此次流行的肺炎命名为COVID-19(corona virus disease 2019),引起该肺炎的新型冠状病毒由... 详细信息

由新型冠状病毒感染导致新冠肺炎,在全球范围内发展迅猛,对全人类的生命健康和经济发展造成了严重影响。2020年2月11日,世界卫生组织(WHO)正式将此次流行的肺炎命名为COVID-19(corona virus disease 2019),引起该肺炎的新型冠状病毒由国际病毒分类委员会命名为SARS-CoV-2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2)。SARSCoV-2与一种蝙蝠冠状病毒(RaTG13)基因序列的相似度高达96%,由此猜测该病毒宿主可能为蝙蝠,但是其明确的起源尚未确定。随着不断研究,有研究结果显示血管紧张素转化酶2(angiotensin-converting enz yme 2,ACE2)是SARS-CoV-2的一个功能性受体,证实了SARS-CoV-2确实是通过ACE2蛋白入侵受体细胞。SARS-CoV-2不仅可以感染人类,还可以感染其他物种,从而可能导致跨物种感染。基于此,所以本研究选取了SARS-CoV-2的可能溯源-野生蝙蝠,在自然界中分布广泛且可能携带大量病原体的野生老鼠,以及由实验室繁育的C57BL/6、BALB/c、树鼩、叙利亚黄金仓鼠,还有在宠物市场购买的花枝鼠、家兔、熊崽仓鼠、三线仓鼠这11个物种,然后分离了这11个物种的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、大脑、结肠、十二指肠、胃和气管这10种组织进行核酸提取。为了获得多物种ACE2基因的编码区全长序列,在NCBI数据库中下载了相关的参考序列,通过设计引物以及PCR扩增得到了多物种的ACE2基因编码区全长序列。经过生物信息学分析,发现多物种与人ACE2基因编码区序列相似性都在84%以上,其中,野生蝙蝠、老鼠和人ACE2基因编码区序列的相似度为84.8%、84.9%,相似度最高的为家兔,达到了88.2%。用人与扩增得到的多物种的ACE2基因编码区全长序列构建分子系统发育树,发现野生蝙蝠(小蹄蝠)和树鼩与人的ACE2基因编码区序列的亲缘关系更相近。本研究还以多物种的ACE2基因的编码区全长序列为模板,通过SWISS-MODEL进行同源建模得到了多物种ACE2的蛋白模型,然后用HADDOCK将得到的多物种ACE2的蛋白模型与SARS-CoV-2 spike进行对接,再通过Fold X软件计算了对接复合物的蛋白结合能,结果表明人ACE2蛋白与spike蛋白结合能为-3.82 Kcal/mol,结合能更高的有家兔(-6.05Kcal/mol)、黄金仓鼠和熊崽仓鼠(-5.39 Kcal/mol)、三线仓鼠(-5.16 Kcal/mol)、野生蝙蝠(小蹄蝠)(-4.67 Kcal/mol),说明这几个物种的ACE2蛋白可能较为容易地与SARS-CoV-2 spike结合。最后,本研究选取了SARS-CoV-2的可能宿主-野生蝙蝠、在自然界中广泛分布的野生老鼠、与野生蝙蝠ACE2基因编码区亲缘关系更相近的树鼩这3个物种,通过q PCR比较了这3个物种的不同组织种ACE2mRNA的相对表达量,还在表达量较高的组织中通过Western Blot验证了ACE2蛋白的表达。结果表明,ACE2 mRNA在这3个物种体的肾脏、消化系统中的表达量更高,而且在这些组织部位均能检测到ACE2蛋白的表达。

关键词： SARS-CoV-2 ACE2 野生动物实验动物 spike蛋白

SARS-CoV-2中spike蛋白通过NLRP3通路介导肥大细胞活化在荨麻疹中的作用与机制研究

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SARS-CoV-2中Spike蛋白通过NLRP3通路介导肥大细胞活化在荨麻疹中...

作者：龚倩遵义医科大学

学位级别：硕士

目的:通过研究严重急性呼吸综合征冠状病毒2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)的刺突蛋白(spike protein,S蛋白)对NLRP3通路以及人肥大细胞(Human maset cells,HMC-1)的活化作用,初步探讨SARS-CoV-2感染合并荨麻疹的发病机制,以求为临床应用提供理论依据。方法:以不同浓度的S蛋白(10、20、40μM)作为实验组、磷酸缓冲盐溶液(Phosphate buffer saline,PBS)作为对照组分别处理HMC-1 24h后,检测HMC-1的活化(中性红染色观察脱颗粒情况、组胺试剂盒检测组胺释放、底物法测β-氨基己糖苷酶释放(β-hexosaminidase,β-hex);Transwell小室实验测各组细胞上清液对人真皮微血管内皮细胞(Human Dermal Microvascular Endothelial Cells,HDMECs)通透性的影响;实时荧光定量PCR(Real-time quantitative polymerase chain reaction,q RT-PCR)检测HMC-1促炎症介质(IL-6、IL-8、NLRP3)的m RNA表达;蛋白质印迹法(Western Blot,WB)检测HMC-1的NF-κB p-p65、NLRP3蛋白表达水平。结果:1.S蛋白(20、40μM)时可诱导HMC-1活化,HMC-1脱颗粒、组胺释放、以及IL-6、IL-8 m RNA表达均增加;2.不同浓度的S蛋白(10、20、40μM)对HMC-1细胞的β-hex的释放无显著影响(P>0.05);3.S蛋白(40μM)处理HMC-1后其上清液可使HDMECs(20min、40min时)通透性增加,且较阴性对照组差异具有统计学意义(P蛋白(20、40μM)促进HMC-1细胞的NF-κB p65的磷酸化表达;5.S蛋白(40μM)可促进HMC-1细胞的NLRP3 m RNA以及蛋白的表达,且差异具有统计学意义(P蛋白可能通过促进NF-κB通路中NF-κB-p65磷酸化表达,并激活NLRP3通路从而诱导肥大细胞活化脱颗粒从而释放组胺和炎症细胞因子(IL-6、IL-8),诱导血管通透性的改变,从而诱导荨麻疹样皮损的产生。

关键词： SARS-CoV-2 spike蛋白 NLRP3 荨麻疹

猪传染性胃肠炎病毒spike蛋白抗原位点C和D的原核表达

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猪传染性胃肠炎病毒Spike蛋白抗原位点C和D的原核表达

作者：朱可佳齐齐哈尔大学

学位级别：硕士

猪传染性胃肠炎(Transmissible gastroenteritis,TGE)是猪的一种急性,高度接触性传染病。该病由猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus of swine,TGEV)引起。各种年龄及品种的猪对TGE均易感,其中2周龄以下仔猪的死亡... 详细信息

猪传染性胃肠炎(Transmissible gastroenteritis,TGE)是猪的一种急性,高度接触性传染病。该病由猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus of swine,TGEV)引起。各种年龄及品种的猪对TGE均易感,其中2周龄以下仔猪的死亡率可达100%,严重危害养猪业的发展。本研究分别合成了编码TGEV纤突蛋白(spike蛋白)线性抗原位点C和D的核苷酸片段,正反链退火后分别克隆至原核表达载体pET32a中,重组质粒分别命名为pET32a-C1C2和pET32a-D。同时将D片段克隆至重组质粒pET32a-C1C2中,重组质粒命名为pET32a-C1C2D。将上述3种重组质粒pET32a-C1C2、pET32a-D和pET32a-C1C2D分别转化大肠杆菌Rosetta(DE3),重组菌经1.0 mmol/L的IPTG诱导4 h后,分别表达出21 kDa、22 kDa和25 kDa的重组蛋白。重组蛋白切胶纯化。Western blot和Dot-ELISA检测结果表明,3种重组蛋白能被TGEV阳性血清识别。对重组蛋白诱导时间和IPTG浓度等表达条件进行了初步优化。重组菌Rosetta(DE3)(pET32a-C1C2)重组蛋白表达量从38.0%提高到41.4%;重组菌Rosetta(DE3)(pET32a-D)重组蛋白表达量从30.9%提高到33.8%;重组菌Rosetta(DE3)(pET32a-C1C2D)重组蛋白表达量从15.7%提高到26.5%。本研究为TGEV血清学诊断方法的研究及建立提供了必要的物质基础。

关键词：猪传染性胃肠炎病毒 spike蛋白抗原位点原核表达