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小鼠EPM细胞sp8基因沉默对Shh、Wnt信号表达的影响研究

小鼠EPM细胞Sp8基因沉默对Shh、Wnt信号表达的影响研究

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作者：程忠委遵义医科大学

学位级别：硕士

目的:沉默体外培养的小鼠腭胚突间充质(Embryonic Palate Mesenchymal,EPM)细胞的sp8基因,检测Shh、Wnt信号通路相关信号因子的表达,探讨sp8是否参与调控Shh、Wnt通路相关信号因子的表达及传递。方法:1.采用安死术处死胚胎13.5天的C57BL... 详细信息

目的:沉默体外培养的小鼠腭胚突间充质(Embryonic Palate Mesenchymal,EPM)细胞的sp8基因,检测Shh、Wnt信号通路相关信号因子的表达,探讨sp8是否参与调控Shh、Wnt通路相关信号因子的表达及传递。方法:1.采用安死术处死胚胎13.5天的C57BL/6J孕鼠,无菌条件下取出胚胎,分离获取腭胚突间充质组织,酶消化法培养细胞,免疫组化染色法进行细胞生物学鉴定。2.梯度实验测定最佳感染复数(Multiplicity of Infection,MOI)值,利用慢病毒介导的RNAi技术沉默第3代EPM细胞的sp8基因,倒置荧光显微镜观察转染效率,RT-PCR选择sp8基因沉默最佳慢病毒靶点。3.将EPM细胞分为三组:LV-sp8-RNAi实验组、阴性对照病毒组、空白对照组,用Western Blot技术分别检测PTCH1(Patched1)、GLI3、WNT3A、β-catenin蛋白的表达水平,并进行统计学分析。结果:1.酶消化法获取的EPM细胞经传代培养至第3代时细胞纯度较高,细胞呈梭形、多角形贴壁生长;免疫组化染色法鉴定所培养的细胞为EPM细胞。EPM细胞抗波形蛋白(Anti-Vimentin antibody)阳性;抗角蛋白(Anti-pan Cytokeratin antibody)阴性。2.倒置荧光显微镜观察转染后72h的EPM细胞,在MOI=40时荧光表达量约80%左右;RT-PCR选择sp8基因沉默最佳慢病毒靶点为LV-sp8-RNAi2号靶点,该靶点对应组细胞的sp8m RNA相对表达量最低(Psp8-RNAi实验组的WNT3A、β-Catenin表达水平显著降低,差异有统计学意义(Psp8基因沉默后可导致WNT3A、β-catenin相对表达量显著降低,推断sp8基因参与调控小鼠EPM细胞中的Wnt信号传导通路。***8基因沉默后引起PTCH1相对表达量明显升高、GLI3相对表达量降低,推断sp8基因参与调控小鼠EPM细胞中的Shh信号传导通路。

关键词： sp8基因基因沉默慢病毒信号通路

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