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PRSV运动相关病毒蛋白的sos恢复系统诱饵载体构建及自激活效应检测

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热带作物学报 2008年第3期29卷 363-368页

作者：沈文涛周鹏中国热带农业科学院热带生物技术研究所海口571101

为研究与番木瓜环斑病毒运动相关的病毒蛋白(CP、HC-Pro、CI)互作的寄主因子,构建以sos恢复系统为原理的胞质酵母双杂交系统的3个病毒蛋白诱饵载体,并检测其自激活作用来验证是否适用于后续的文库筛选。通过RT-PCR从番木瓜环斑病毒海南... 详细信息

为研究与番木瓜环斑病毒运动相关的病毒蛋白(CP、HC-Pro、CI)互作的寄主因子,构建以sos恢复系统为原理的胞质酵母双杂交系统的3个病毒蛋白诱饵载体,并检测其自激活作用来验证是否适用于后续的文库筛选。通过RT-PCR从番木瓜环斑病毒海南分离物中扩增出这3个病毒蛋白的片段,按正确方向将目标片段分别插入诱饵载体psos中,并将重组质粒导入酵母温度敏感酵母菌株cdc25H,检测其表达产物对酵母sos恢复系统Ras信号通路的激活作用而产生的细胞温敏特性影响。结果表明,这3个含番木瓜环斑病毒运动相关的病毒蛋白的诱饵载体构建正确,对酵母菌株cdc25H的sos恢复系统无激活作用,激活试验为阴性。

关键词：番木瓜环斑病毒病毒运动 sos恢复系统酵母双杂交系统

sos恢复系统——一种新型的酵母双杂交系统

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生命的化学 2004年第1期24卷 69-70页

作者：赵兴卉朱旭东黄培堂北京生物工程研究所北京100071

sos恢复系统是一种新型的不依赖转录激活机制的酵母双杂交系统 ,原理是通过蛋白质的相互作用将sos富集在细胞膜上激活Ras信号通路 ,使得酵母温度敏感缺陷株可以在限制温度下生长。与传统的酵母双杂交系统相比 ,sos恢复系统的主要优点在... 详细信息

sos恢复系统是一种新型的不依赖转录激活机制的酵母双杂交系统 ,原理是通过蛋白质的相互作用将sos富集在细胞膜上激活Ras信号通路 ,使得酵母温度敏感缺陷株可以在限制温度下生长。与传统的酵母双杂交系统相比 ,sos恢复系统的主要优点在于被研究的蛋白质的相互作用发生在胞质而不是核中 ;而且 ,它更适合研究转录因子以及在胞质中行使生理功能的蛋白质。sos恢复系统克服了传统的酵母双杂交系统的一些限制 ,大大拓展了酵母双杂交技术的应用范围。

关键词：酵母双杂交 sos恢复系统 Ras信号通路膜定位信号

番木瓜环斑病毒CI互作寄主因子的筛选与分析

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番木瓜环斑病毒CI互作寄主因子的筛选与分析

作者：潘雪莹海南大学

学位级别：硕士

番木瓜环斑病毒病(Papaya Ringspot Virus,PRSV)一直是威胁番木瓜种植业发展最严重的病害之一。柱状内含体蛋白(Cylindrical inclusion protein,CI)做为PRSV重要的功能蛋白之一,具有RNA解旋酶的活性,并参与病毒粒子在细胞中的运动、病... 详细信息

番木瓜环斑病毒病(Papaya Ringspot Virus,PRSV)一直是威胁番木瓜种植业发展最严重的病害之一。柱状内含体蛋白(Cylindrical inclusion protein,CI)做为PRSV重要的功能蛋白之一,具有RNA解旋酶的活性,并参与病毒粒子在细胞中的运动、病毒粒子的复制和病毒侵染症状的产生等多个过程。CI的多功能性预示着它与寄主植物编码基因间的相互作用在病毒致病与植物防御过程中起重要作用。本研究是在前期成功构建PRSV诱导的番木瓜cDNA文库的基础上,应用不依赖转录激活机制的胞质酵母双杂交系统—sos恢复系统(sos recruitment system,SRS)来寻找与PRSV的CI蛋白互作的寄主蛋白因子,在此基础上探求PRSV与寄主相互作用的机制。本实验以PRSV海南分离物总RNA为模板,克隆出CI基因,并成功构建了可应用与sos恢复系统的诱饵载体psos-CI。应用醋酸锂法将诱饵质粒psos-CI转化温敏突变型酵母细胞cdc25H(α)。通过营养缺陷和温度敏感筛选,验证了CI可以在cdc25H(α)中表达,但不具有自激活作用,因而可作为诱饵蛋白筛选与其相互作用的蛋白。经过sos恢复系统初步筛选,共获得2个候选的互作寄主蛋白,同源比对分析结果表明：其中一个蛋白与叶绿体延伸因子Tu(Elongation factor Tu,EF-Tu)的氨基酸序列具有较高同源性;而另一个为未知蛋白。再将候选寄主蛋白EF-Tu基因的文库质粒和诱饵质粒进行回转和自激活验证,结果可以判定候选番木瓜蛋白EF-Tu在酵母细胞中可以与PRSV诱饵蛋白CI相互作用。通过运用生物信息学技术并结合PCR等基因工程技术获得了EF-Tu的全长序列。分析显示,各不同物种间EF-Tu的相似性较高,其蛋白质同源相似率在70%左右。其序列3’端较保守,5’端差异性较大。本研究初步获得了PRSV的CI蛋白互作寄主蛋白EF-Tu。为进一步阐明PRSV-番木瓜寄主互作机制提供了新的线索。CI-EF-Tu的互作情况与PRSV寄主范围相关,为PRSV寄主范围的研究奠定理论基础。为通过转基因方法抑制或过量表达突变关键位点的寄主因子,阻断关键因子互作获得抗病植株提供了可行性依据,为防治PRSV的的抗病毒新策略研究提供了良好的研究平台。但是EF-Tu基因是否为PRSV的寄主专一因子还需要进一步通过试验进行验证。

关键词：番木瓜番木瓜环斑病毒 sos恢复系统蛋白质相互作用 CI

橡胶树蔗糖转运蛋白基因sos酵母双杂交体系的诱饵载体构建及自激活检测

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热带生物学报 2010年第4期1卷 314-320页

作者：秦云霞戚继艳唐朝荣中国热带农业科学院橡胶研究所海南儋州571737

为了筛选巴西橡胶树蔗糖转运蛋白(HbSUT)的互作蛋白质,构建了以sos恢复系统为原理的胞质酵母双杂交系统的6个HbSUT基因的诱饵载体,并进行了自激活检测。通过PCR技术从携带HbSUT基因的质粒中获得预期的基因编码序列,将目标片段定向插入... 详细信息

为了筛选巴西橡胶树蔗糖转运蛋白(HbSUT)的互作蛋白质,构建了以sos恢复系统为原理的胞质酵母双杂交系统的6个HbSUT基因的诱饵载体,并进行了自激活检测。通过PCR技术从携带HbSUT基因的质粒中获得预期的基因编码序列,将目标片段定向插入诱饵载体psos的SalⅠ及NotⅠ酶切位点之间,酶切和测序结果表明,获得了序列和读框正确的6个HbSUT基因的诱饵载体psos-SUTs,进一步导入酵母温度敏感酵母cdc25H菌株中,检测其表达产物对酵母sos恢复系统Ras信号通路的激活作用,除psos-SUT5外,其他5个诱饵载体对酵母菌株均无激活作用,因而适合于进行后续互作蛋白质筛选研究。

关键词：巴西橡胶树蔗糖转运蛋白诱饵载体 sos恢复系统酵母双杂交系统

番木瓜环斑病毒Nla-Pro互作寄主因子的筛选与鉴定

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