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水母雪莲smmyb1的克隆及表达研究

水母雪莲SmMYB1的克隆及表达研究

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作者：郭佳磊青海大学

学位级别：硕士

水母雪莲（Saussurea medusa Maxim.）又称水母雪兔子,属菊科（Compositae）风毛菊属（Saussurea DC.）,主要生长于青藏高原地区,是一种对极端环境高度适应的典型高山植物。强紫外辐射是青藏高原的主要环境因子之一,研究水母雪莲对紫外... 详细信息

水母雪莲（Saussurea medusa Maxim.）又称水母雪兔子,属菊科（Compositae）风毛菊属（Saussurea DC.）,主要生长于青藏高原地区,是一种对极端环境高度适应的典型高山植物。强紫外辐射是青藏高原的主要环境因子之一,研究水母雪莲对紫外辐射的生存策略,对揭示高山植物适应环境的特殊机制将具有重要的理论意义。为此,本研究以水母雪莲作为实验材料,通过RT-PCR,结合RACE技术,克隆与花青素合成相关的smmyb基因,并研究该基因的功能及紫外辐射下的表达模式。主要研究结果如下:1.水母雪莲smmyb1基因cDNA全长1 011 bp（Gen Bank登录号MT188153.1）,其中包括810 bp开放阅读框,86 bp 5’-端非编码区,125 bp的3’-端非编码区。扩增的gDNA序列（Gen Bank登录号MT188154.1）和cDNA序列比对显示该基因包含3个外显子和2个内含子。该基因编码蛋白中包含R2R3-MYB结构域,含有保守的[DE]Lx（2）[RK]x（3）Lx（6）Lx（3）R和ANDV两个模体,水母雪莲smmyb1蛋白和菊科MYB蛋白亲缘关系最近,属于拟南芥MYB第六亚族。smmyb1基因启动子（Gen Bank登录号MT188154.1）全长1 407 bp,含有多个光响应元件。2.荧光定量分析发现,smmyb1基因在根、茎、叶和花中均表达,且在花中的表达量最高。在紫外胁迫下,smmyb1基因的表达量在4 h达到最高,随后逐渐降低。推测smmyb1可能参与到水母雪莲对紫外辐射的胁迫响应途径中。3.克隆了smmyb1下游基因SmDFR的启动子（Gen Bank登录号MT634229）。SmDFR和其他菊科植物DFR启动子区均存在着保守的MYB结合元件,同时上游还存在MYB结合元件MYBPLANT。酵母单杂交实验表明,smmyb1蛋白和SmDFR启动子有结合的可能性。推测smmyb1通过调控SmDFR的表达调控花青素的合成。4.克隆了smmyb1上游基因SmHY5（Gen Bank登录号MW590585）。SmHY5和其他菊科植物以及拟南芥HY5有着很高的保守性,尤其是在b ZIP结构域和COP1蛋白互作结构域,为下一步研究SmHY5对smmyb1的调控作用以揭示光信号如何调控水母雪莲花青素的合成奠定了基础。

关键词：水母雪莲花青素 smmyb1 酵母单杂交表达分析

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光形态建成因子SmCOP1调控茄子果实发育和花色苷合成的机理研究

光形态建成因子SmCOP1调控茄子果实发育和花色苷合成的机理研究

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作者：王文明郑州大学

学位级别：硕士

茄子（Solanum melongena L.）被联合国作为一种重要的蔬菜作物,在中国有着广泛的栽培面积,茄子富含花青素对人体健康有益。在茄子栽培的过程中,由于光照的不均匀导致果实表皮的花色苷不能有效的合成与积累,从而严重影响茄子的商品价值... 详细信息

茄子（Solanum melongena L.）被联合国作为一种重要的蔬菜作物,在中国有着广泛的栽培面积,茄子富含花青素对人体健康有益。在茄子栽培的过程中,由于光照的不均匀导致果实表皮的花色苷不能有效的合成与积累,从而严重影响茄子的商品价值。如何在弱光条件下提高茄子果实表皮花色苷的积累显得至关重要,因此本研究探究光形态建成因子Sm COP1调控茄子果实发育和花色苷合成的机理。在弱光条件下提高茄子果实表皮花色苷的合成,本文通过RNA干扰技术,构建了Sm COP1-RNAi沉默载体并通过遗传转化获得了稳定遗传的转基因株系,在转录、蛋白及代谢三个层面,结合q RT-PCR、WB、酵母双杂、HPLC及p H示差法检测技术,分析光形态建成因子Sm COP1调控茄子果实发育和花色苷合成的具体作用机制。主要结果如下:（1）紫茄花色苷的合成受到严格的光照调控,随着光照的时间增加果实着色越强,色素含量越高,q RT-PCR检测发现花色苷合成调控早期、中期、晚期关键酶基因Sm PAL、Sm F3H、Sm3GT,受到光照诱导调控,Sm MYB1蛋白随着光照时间的增加蛋白丰度也会上调,与花色苷的积累成正相关。（2）通过花色苷组织表达模式分析,发现花色苷的合成具有组织特异性,花色苷在果皮中表达最高,根和果肉中几乎不表达。Sm COP1蛋白在叶片、花、果皮中都有表达没有组织特异性,Sm MYB1蛋白在果皮中积累最高与花色苷表达高度相关,光敏素受体的表达与花色苷的积累成正相关,蓝光受体Sm CRY1在花蕊中表达最高,Sm CRY2在各组织表达没有差异。（3）在Sm COP1-RNAi幼苗和茄子果实表皮中的花色苷含量积累显著上调,Sm MYB1蛋白质水平的增加有利于花色苷的合成与积累。Sm MYB1蛋白质丰度显著上调,促进了花色苷生物合成相关基因Sm PAL、Sm CHS、Sm CHI、Sm DFR、Sm3GT和Sm ANS与绿原酸合成成基因Sm C3H、Sm4CL、Sm HQT的显著上调,从而促进了花色苷和绿原酸含量显著上调。（4）在弱光条件下Sm COP1-RNAi茄子果实表皮Sm MYB1蛋白变化显著增加,Sm MYB1蛋白促进了花色苷生物合成相关基因Sm PAL,Sm CHS,Sm CHI,Sm DFR,Sm3GT和Sm ANS与绿原酸合成结构基因Sm C3H、Sm4CL、Sm HQT显著上调从而促进了花色苷和绿原酸在果实表皮也显著的上调。（5）通过克隆Sm COP1基因并对其蛋白结构预测,发现其靠近C末端部位具有保守的WD40重复序列结构域,酵母双杂体外实验表明Sm MYB1 R3结构域与Sm COP1 WD40结构域相互作用。（6）在本文研究中,我们还发现Sm COP1-RNAi幼苗在黑暗中表现出短下胚轴,在正常光照条件下其地上部分也显著变短表现为光形态建成的表型。沉默Sm COP1基因发现Sm CIP7显著上调,并且茄子果实变大,种子数量增多,种子变大,子粒重量增加,木质素合成基因显著上调,木质素含量增加。本文不仅探究了Sm COP1在蛋白水平调控花色苷的生物合成,而且使我们能够获得提高色素产量以及改善果实品质的目标,并且在其他作物中花色苷的积累分析中提供了一个新的理论模型。

关键词：花青素 SmCOP1 smmyb1 紫茄酵母双杂

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