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slit2和Robo1蛋白对乳腺癌病变的作用及其分子机制研究

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Slit2和Robo1蛋白对乳腺癌病变的作用及其分子机制研究

作者：李瑞锦州医科大学

学位级别：硕士

目的本研究拟观察slit2、Robo1在乳腺癌组织和细胞中表达变化,并分析其与乳腺癌`临床病`理特征的相关性;通过进一步体外细胞实验,验证slit2过表达情况下对乳腺癌细胞生物学行为的影响,进而探讨slit2/Robo1信号通路参与乳腺癌发展和转移... 详细信息

目的本研究拟观察slit2、Robo1在乳腺癌组织和细胞中表达变化,并分析其与乳腺癌`临床病`理特征的相关性;通过进一步体外细胞实验,验证slit2过表达情况下对乳腺癌细胞生物学行为的影响,进而探讨slit2/Robo1信号通路参与乳腺癌发展和转移的作用机制。方法1、组织实验应用免疫组织化学技术观察slit2、Robo1在乳腺癌组织、癌旁正常组织、乳腺纤维腺`瘤的定`位、表达;结合图像分析技术检测其表达变化。并运用统计学方法,分析slit2、Robo1表`达与患者年‘龄、肿`瘤大`小、淋`巴`结转移、组织`学`分级、病理分期、分子病理指标及组织类型的相关性。同时采用列联相关分析,验证slit2和Robo1在乳腺癌组织中表达水平差异的相关性。2、细胞实验(1)应用免疫荧光技术、蛋白印迹技术和实`时`定量`PCR`技术检测`S`lit2、Robo1在永生化乳腺上皮细胞MCF10A和乳腺癌细胞系MCF-7的定位、定量和m RNA表达。(2)构建slit2过表达细胞模型(1)应用CCK8法检测乳腺癌MCF-7细胞在slit2过表达组、空载组及空白对照组48h细胞增殖情况,分析slit2对乳腺癌细胞增`殖能`力的影响。(2)应用细胞划痕实验检测乳腺癌细胞在slit2过表达组、空载组及空白对照组24h及48h划痕间隙愈合情况,分析slit2对乳腺癌细胞迁移能力的影响。(3)应用Transwell法计数slit2过表达组、空载组及空白对照组24小时穿过基质胶乳腺癌细胞数,分析slit2对乳腺癌细胞侵`袭`能力的影响。(4)应用细胞平板克隆实验检测乳腺癌MCF-7细胞在slit2过表达组、空载组及空白对照组集落形成数目,分析slit2对乳腺癌细胞集落形成能力的影响。(5)应用流式细胞术检测乳腺癌MCF-7细胞在slit2过表达组、空载组及空白对照组细胞周期,分析slit2对乳腺癌细胞周期进程的影响。结果1、组织实验(1)slit2主要表达于细胞的胞质,其在乳腺纤维腺瘤和乳腺正常组织中的阳性表达率分别为90.5%和85.0%均明显高于浸润性乳腺癌(44.2%),Pslit2阳性表达率之间的差异无统计学意义,P>0.05。浸润性乳腺癌中slit2与Robo1表达高度相关,slit2蛋白表达与ER、PR、Her2`表达呈正相关(Pslit2蛋白表达与浸润性乳腺癌患者年龄、淋巴结转移、肿瘤大小、病理分期和组织学分级无关(P>0.05)。(2)Robo1主要表达于肿瘤细胞的胞核和胞浆,Robo1在乳腺纤维腺瘤和乳腺正常组织中的阳`性表达`率`分别为`85.7%和90.0%均明显高于浸润性乳腺癌(38.8%),P0.05。浸润性乳腺癌组织中,Robo1蛋白表达与ER、PR呈正相关(P2表达无相关性`(P>0.05),Robo1蛋白表达与浸润性乳腺癌患者年龄、淋巴结转移、肿瘤大小、病理分期和组织学分级无关(P>0.05)。2、细胞实验(1)应用免疫荧光技术检测slit2、Robo1在永生化乳腺上皮细胞MCF10A和乳腺癌细胞系MCF-7的定位。结果表明slit2主要表达于M`CF10A细胞及M`CF-7细胞胞质,Robo1主要表达于M`CF10A细胞及MCF-7细胞胞核及胞浆。(2)应用蛋白印迹技术检测slit2、Robo1在永`生化乳腺上皮细胞`M`CF10A和乳腺癌细胞系MCF-7的`定`量表达,结果表明slit2、Robo1在MCF10A中的表达量均高于MCF-7细胞(Pslit2、Robo1在永生化乳腺上皮细胞MCF10A和乳腺癌细胞系MCF-7的m RNA表达,结果表明slit2在MCF10A细胞中的m RNA表达量是MCF-7的2.63倍,Robo1在MCF10A细胞中的m RNA表达量是MCF-7的2.92倍,slit2、Robo1在MCF10A细胞中的m`RNA表达量均明`显高于M`CF-7细胞(Pslit2过表达细胞模型(1)应用CCK8法检测乳腺癌MCF-7细胞在48h细胞增殖情况,结果表明slit2过表达组乳腺癌MCF-7细胞增殖情况明显低于空载组及空白对照组(P2)应用细胞划痕实验检测乳腺癌细胞迁移情况,结果表明slit2过表达组乳腺癌`MCF-7细胞迁`移能力明显低`于空`载`组及空`白`对照组(P24小时穿过基质胶乳腺癌细胞数,结果表明slit2过表达组乳腺癌MCF-7细胞24小时穿过基质胶数量明显低于空载组及空白对照组(Pslit2过表达组乳腺

关键词： slit2 Robo1 乳腺癌

slit2和Robo1在浸润性乳腺癌中的表达及其临床意义

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锦州医科大学学报 2023年第2期44卷 17-22页

作者：李瑞陈德杰田娟锦州医科大学基础医学院组织胚胎学教研室辽宁锦州121000 襄阳市中心医院湖北襄阳441021

目的观察slit2和Robo1在浸润性乳腺癌的表达变化及其与浸润性乳腺癌临床病理指标的相关性,探讨slit2/Robo1信号通路对浸润性乳腺癌病理过程的调控作用。方法应用免疫组织化学法观察slit2和Robo1在浸润性乳腺癌、乳腺纤维腺瘤和正常乳... 详细信息

目的观察slit2和Robo1在浸润性乳腺癌的表达变化及其与浸润性乳腺癌临床病理指标的相关性,探讨slit2/Robo1信号通路对浸润性乳腺癌病理过程的调控作用。方法应用免疫组织化学法观察slit2和Robo1在浸润性乳腺癌、乳腺纤维腺瘤和正常乳腺组织的表达;应用卡方检验或校正的卡方检验分析slit2和Robo1在各组间阳性率差异;采用方差分析、Kruskal-Wallis或Mann-Whitney U检验分析slit2和Robo1的免疫组织化学染色量差异;采用非参数Spearman等级相关分析检验slit2和Robo1与浸润性乳腺癌临床病理指标相关性。结果 slit2定位表达于细胞质;Robo1定位表达于细胞质和细胞核。slit2和Robo1在浸润性乳腺癌的表达率和表达量明显低于乳腺纤维腺瘤和正常乳腺组织。在浸润性乳腺癌中,slit2和Robo1具有高度相关性,且slit2与ER、PR、Her2呈正相关(Pslit2/Robo1与浸润性乳腺癌患者年龄、淋巴结转移、肿瘤大小、病理分期和组织学分级无关(P>0.05)。结论 slit2和Robo1在浸润性乳腺癌低表达,且与其发生、发展和预后存在相关性,提示slit2/Robo1信号通路可能参与浸润性乳腺癌的病理过程,发挥调控作用。

关键词： slit2 Robo1 乳腺癌临床意义

不同年龄大鼠坐骨神经损伤后slit2 mRNA表达的差异

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中华医学杂志 2004年第13期84卷 1110-1113页

作者：周友清陈亮顾玉东复旦大学附属华山医院手外科上海200040

目的　检测不同年龄大鼠坐骨神经切断后slit2mRNA的表达差异 ,探讨幼年大鼠易发生同步收缩的分子机制。方法　幼、成年大鼠 (各 2 8只 )右坐骨神经切断后 ,用硅胶管桥接使形成3mm缺损。分别于损伤前与伤后 1d、3d、7d(每个时间点 6只 )... 详细信息

目的　检测不同年龄大鼠坐骨神经切断后slit2mRNA的表达差异 ,探讨幼年大鼠易发生同步收缩的分子机制。方法　幼、成年大鼠 (各 2 8只 )右坐骨神经切断后 ,用硅胶管桥接使形成3mm缺损。分别于损伤前与伤后 1d、3d、7d(每个时间点 6只 )取神经近、远端各 3mm ,通过逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)比较slit2mRNA的表达差异 ;取幼、成年大鼠 (各 4只 )损伤前和伤后 3d(各 2只 )取神经近、远端各 3mm行原位杂交检测slit2mRNA表达的细胞定位。结果　除术后 7d近端神经幼年组较成年高外 ,RT PCR结果提示各时间段近端与远端神经幼年大鼠slit2mRNA的表达均较成年低 ,差异有非常显著的统计学意义 (P均 slit 2mRNA的阳性信号主要定位在雪旺细胞质。结论　周围神经损伤后幼年大鼠雪旺细胞slit 2mRNA表达量较成年低 ,提示slit 2蛋白的表达不足可能是幼年大鼠易发生同步收缩的分子生物学基础。

关键词：年龄大鼠坐骨神经损伤 slit2 mRNA表达肌电描计术神经再生

slit2对高糖诱导的肾小管上皮细胞上皮间质转分化的作用及机制

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解放军医学杂志 2019年第8期44卷 652-658页

作者：胡成芳李艺刘军辉王小龙侯世会官涛黄云剑陆军军医大学附属新桥医院肾内科

目的探讨slit2/ROBO1信号通路在高糖诱导肾小管上皮细胞上皮间质细胞转分化(EMT)中的作用及机制。方法体外培养人肾小管上皮细胞HK-2,进行高糖浓度梯度实验,随机分为正常组、对照组1、对照组2和高糖组1、高糖组2;同时进行高糖时间梯度实... 详细信息

目的探讨slit2/ROBO1信号通路在高糖诱导肾小管上皮细胞上皮间质细胞转分化(EMT)中的作用及机制。方法体外培养人肾小管上皮细胞HK-2,进行高糖浓度梯度实验,随机分为正常组、对照组1、对照组2和高糖组1、高糖组2;同时进行高糖时间梯度实验,随机分为正常组、对照组、高糖24h组、高糖36h组和高糖48h组,采用Western blotting检测HK-2细胞中slit2、ROBO1、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和纤维连接蛋白的表达变化,筛选出最佳高糖刺激浓度和时间。采用slit2过表达质粒及阴性对照质粒转染HK-2细胞,验证转染成功后,随机分为正常组、对照组、高糖组、高糖+空载组及高糖+slit2组,经最佳高糖浓度及时间刺激后提取总蛋白,Western blotting检测纤维连接蛋白及α-SMA的表达变化。结果在高糖浓度梯度实验中,与正常组相比,高糖组1、高糖组2的slit2表达明显下降(分别为0.647±0.048、0.210±0.023vs.1.000±0.050),ROBO1表达明显下降(分别为0.703±0.041、0.303±0.022vs.1.000±0.057),纤维连接蛋白表达明显增加(分别为1.953±0.042、2.997±0.078vs.0.990±0.059),α-SMA表达明显增加(分别为1.767±0.012、2.427±0.059vs.1.033±0.067),差异均有统计学意义(P2的slit2、ROBO1表达下降,纤维连接蛋白和α-SMA表达增加,差异有统计学意义(Pslit2表达明显下降(分别为0.557±0.020、0.450±0.055vs.0.943±0.032),ROBO1表达下降(分别为0.600±0.023、0.227±0.028vs.1.000±0.058),高糖24h组、高糖36h组、高糖48h组纤维连接蛋白表达增加(分别为1.247±0.052、1.733±0.084、2.780±0.090vs.0.970±0.040),α-SMA表达增加(分别为1.277±0.041、1.767±0.120、2.537±0.078vs.1.033±0.067),差异均有统计学意义(P24h组相比,高糖36h组、高糖48h组的slit2表达下降(分别为0.557±0.020、0.450±0.055vs.0.893±0.034),ROBO1表达下降(分别为0.600±0.023、0.227±0.028vs.0.930±0.025),纤维连接蛋白及α-SMA表达增加,差异均有统计学意义(Pslit2和ROBO1表达下降,纤维连接蛋白和α-SMA表达增加,差异均有统计学意义(Pslit2过表达及阴性对照质粒转染成功后,观察slit2过表达对肾小管EMT的影响发现,与正常组相比,高糖组、高糖+空载组、高糖+slit2组的纤维连接蛋白表达增加(分别为2.760±0.012、2.667±0.027、1.460±0.034vs.1.000±0.058),α-SMA表达水平增加(分别为2.487±0.048、2.557±0.037、1.270±0.017vs.1.000±0.050),差异有统计学意义(Pslit2组的纤维连接蛋白和α-SMA表达下降,差异均有统计学意义(Pslit2和ROBO1的表达下降参与了高糖诱导的肾小管上皮细胞EMT过程,过表达slit2可显著抑制高糖诱导的EMT。

关键词： slit2 ROBO1 上皮间质转分化高糖 HK-2细胞

H9N2禽流感病毒PB2蛋白627位点突变对小鼠肺脏RIP3、slit2和Robo4表达和分布的影响

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广东畜牧兽医科技 2023年第5期48卷 53-58页

作者：许丹邓志乐刘瑞东胡岂铭宁章勇范小龙华南农业大学兽医学院广东广州510642

PB2蛋白627位点被证实是决定甲型流感病毒宿主范围和致病性的关键因子,为深入探究H9N2禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)及其PB2蛋白627位点突变株对BALB/C小鼠肺脏RIP3、slit2和Robo4基因表达和组织分布的影响,该研究使用H9N2 AIV... 详细信息

PB2蛋白627位点被证实是决定甲型流感病毒宿主范围和致病性的关键因子,为深入探究H9N2禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)及其PB2蛋白627位点突变株对BALB/C小鼠肺脏RIP3、slit2和Robo4基因表达和组织分布的影响,该研究使用H9N2 AIV(V_(K627))和该毒株PB2蛋白627位点突变株(rV_(K627E))感染BALB/C小鼠,分别在攻毒后第1、3、5、6 d采集肺组织,通过qRT⁃PCR和免疫组织化学技术对RIP3、slit2和Robo4基因在小鼠肺组织中的特异性表达和分布进行研究。结果显示,攻毒组小鼠肺脏RIP3的表达量与对照组相比显著上升,同时VK627组RIP3的表达量显著高于rV_(K627E)组;slit2和Robo4的表达量在攻毒后第1 d明显低于对照组,之后rVK627E组的表达量与对照组和VK627E组相比显著上升。免疫组织化学检测结果显示,RIP3蛋白主要分布在小鼠肺泡壁上皮细胞以及肺动脉血管内皮细胞,呈弱阳性表达,而攻毒组RIP3蛋白在气管粘膜下层细胞也有中至强阳性表达;slit2蛋白在对照组和rVK627E组小鼠的肺泡上皮细胞以及气管粘膜上皮细胞中呈现中强阳性表达,而在VK627组中呈现弱阳性表达。Robo4蛋白的分布和表达情况与slit2蛋白相似。综上所述,H9N2 AIVs感染小鼠后,会显著影响RIP3和slit2/Robo4的表达和分布,且其表达和分布与H9N2 AIVs对小鼠的致病性密切相关;PB2蛋白627位点的突变在H9N2 AIVs影响RIP3、slit2和Robo4表达和分布中起着重要作用。该研究结果将为进一步探究H9N2 AIVs及其点突变毒株介导宿主病理发生的分子机制和抗炎策略的选择提供基础数据。

关键词： H9N2禽流感病毒 RIP3 slit2 Robo4 表达分布组织学分布

电针对局灶性脑梗死大鼠slit2及SrGAP1表达的影响

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第二军医大学学报 2016年第1期37卷 46-51页

作者：龙飞李学智龚标汪莹代恩泽郭全虎重庆医科大学中医药学院针灸推拿教研室重庆400016

目的观察局灶性脑梗死大鼠皮质slit2、SrGAP1的表达和电针对其表达的影响;探讨电针对脑梗死后神经可塑性的作用机制。方法将60只雄性SD大鼠随机分为模型组(n=30)和电针组(n=30),根据电针治疗时间分为0d(n=10)、7d(n=10)、14d(n=10)三个... 详细信息

目的观察局灶性脑梗死大鼠皮质slit2、SrGAP1的表达和电针对其表达的影响;探讨电针对脑梗死后神经可塑性的作用机制。方法将60只雄性SD大鼠随机分为模型组(n=30)和电针组(n=30),根据电针治疗时间分为0d(n=10)、7d(n=10)、14d(n=10)三个亚组。用线栓法栓塞模型组、电针组大鼠大脑中动脉1.5h后恢复血流。在0、7、14d时用尼氏染色观察大脑梗死灶周围组织形态学变化;用免疫荧光、蛋白质印迹法检测缺血侧大脑皮质slit2和SrGAP1的表达。结果神经功能评分(mNSS)结果表明,0d时模型组与电针组相比差异无统计学意义(P>0.05),7、14d时电针组的神经功能评分低于模型组(Pslit2、SrGAP1荧光强度及灰度值差异无统计学意义(P>0.05),7、14d时电针组荧光强度及灰度值高于模型组(Pslit2、SrGAP1低表达,电针治疗7、14d后可促进slit2、SrGAP1表达并延长其高表达时间,促进轴突的再生和修复,这可能是电针促进脑梗死后神经功能恢复的机制之一。

关键词：脑缺血再灌注损伤电针 slit2 SrGAP1

人肝癌中slit2基因表达及启动子甲基化分析

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复旦学报（医学版） 2007年第2期34卷 202-206页

作者：金洁游海燕余艳军黄明辉舒惠群姚根富杨胜利覃文新江苏大学生命科学院上海交通大学医学院-上海市肿瘤研究所癌基因及相关基因国家重点实验室上海交通大学医学院-上海市肿瘤研究所癌基因及相关基因国家重点实验室上海200032

目的研究slit2在肝癌组织中表达和沉默的机制。方法32个肝癌病人的癌组织及癌旁肝组织、3例正常肝组织及8个肝癌细胞系样本DNA和RNA抽提后,半定量RT-PCR检测slit2的表达。亚硫酸氢钠处理DNA,用MSP和测序法检测slit2启动子甲基化状态。结... 详细信息

目的研究slit2在肝癌组织中表达和沉默的机制。方法32个肝癌病人的癌组织及癌旁肝组织、3例正常肝组织及8个肝癌细胞系样本DNA和RNA抽提后,半定量RT-PCR检测slit2的表达。亚硫酸氢钠处理DNA,用MSP和测序法检测slit2启动子甲基化状态。结果slit2启动子在肝癌组织中的甲基化率为84.3%,在相对应的癌旁肝组织中甲基化率为56.3%。肝癌细胞系的甲基化率为75%。而在正常肝组织中无甲基化。slit2启动子甲基化与肝癌的临床病理指标无相关性,但和患者的年龄有关。在用甲基化酶抑制剂5-aza-dC处理细胞后,slit2表达缺失的肝癌细胞系恢复了mRNA的表达。结论slit2启动子甲基化是肝癌发生过程中的早期事件,可能是slit2在肝癌中表达沉默的主要机制。

关键词：肝癌 slit2 DNA甲基化抑癌基因

slit2/Robo1信号通路蛋白在早期糖尿病肾病肾小球中的表达及临床意义

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第三军医大学学报 2017年第1期39卷 60-66页

作者：刘军辉唐璐瑶侯世会官涛张均黄云剑第三军医大学新桥医院肾内科重庆400037

目的探讨早期糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)肾小球中slit2和Robo1的表达与肾小球内皮细胞增生的关系及临床意义。方法收集符合Tervaert’s糖尿病肾病病理分型Ⅰ~Ⅱa期,患者24 h尿蛋白>30 mg且90 m L/(min·1.73 m2)等纳入标准的1... 详细信息

目的探讨早期糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)肾小球中slit2和Robo1的表达与肾小球内皮细胞增生的关系及临床意义。方法收集符合Tervaert’s糖尿病肾病病理分型Ⅰ~Ⅱa期,患者24 h尿蛋白>30 mg且90 m L/(min·1.73 m2)等纳入标准的19例2型糖尿病DN标本,以及15例正常肾组织手术标本,采用HE染色、PAS染色和电镜观察DN肾小球组织形态结构的变化,免疫组化检测slit2、Robo1和血管内皮细胞标记物CD31在肾小球中的表达,分析DN肾小球中slit2和Robo1与CD31表达的相关性,以及slit2、Robo1和CD31的表达与24 h尿蛋白以及e GFR的相关性。结果早期DN存在肾小球肥大、系膜基质轻度增多、基底膜增厚、毛细血管扩张、血管内皮细胞增大和增多等典型早期DN病理特征。slit2表达于肾小球血管内皮、肾小管上皮和系膜细胞区域;Robo1表达于肾小球血管内皮、肾小管上皮和足细胞区域。与正常肾组织相比,早期DN肾小球中CD31的表达水平显著增高。早期DN肾小球中slit2和Robo1的表达较正常肾组织也显著性增高(Pslit2和Robo1的表达与CD31表达呈显著正相关(r=0.73,P2,Pslit2、Robo1和CD31表达与e GFR呈显著正相关(r=0.78,Pslit2、Robo1和CD31表达与24 h尿蛋白也呈显著正相关(r=0.46,Pslit2/Robo1信号通路可能通过参与早期DN肾小球内皮细胞增生促进病理性血管生成,从而加速蛋白尿的进展。

关键词：糖尿病肾病肾小球内皮细胞血管生成 slit2 Robo1 CD31

slit2/Robo1在宫颈癌中的表达及意义

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中国临床药理学杂志 2015年第6期31卷 429-431,438页

作者：黄小莉曲军英福建医科大学附属第一医院妇产科福州350004

目的探讨slit2及其受体Robo1在宫颈鳞癌（SCC）、宫颈上皮内瘤变（CIN）及正常宫颈上皮（NCE）中的表达,及其与宫颈病变发展的关系。方法组织芯片与免疫组化技术法检测55例SCC、30例CINⅠ-Ⅱ级、30例CINⅢ级及20例NCE中slit2、Robo1蛋... 详细信息

目的探讨slit2及其受体Robo1在宫颈鳞癌（SCC）、宫颈上皮内瘤变（CIN）及正常宫颈上皮（NCE）中的表达,及其与宫颈病变发展的关系。方法组织芯片与免疫组化技术法检测55例SCC、30例CINⅠ-Ⅱ级、30例CINⅢ级及20例NCE中slit2、Robo1蛋白的表达;实时荧光定量聚合酶链式反应法检测20例SCC、20例CINⅢ级及20例NCE中slit2-mRNA的表达;分析患者临床特征与slit2表达水平的相关性。结果 slit2、Robo1蛋白阳性表达率在NCE、CIN、SCC中逐渐降低,CINⅢ级组阳性表达率显著低于CINⅠ-Ⅱ级组（P〈0.05）。slit2蛋白表达与宫颈癌临床分期、宫颈浸润深度、淋巴结转移相关（P〈0.05）;与年龄、组织分化、肿物大小无关（P〉0.05）。NCE组slit2-mRNA的表达水平显著高于CINⅢ组和SCC组（P〈0.05）。结论 slit2/Robo1信号通路对促癌基因表达及功能的失调控是宫颈癌发生、发展的重要因素。

关键词： slit2 Robo1 宫颈癌宫颈上皮内瘤变