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川陈皮素通过上调Slfn5调控PTEN/Akt途径对肾细胞癌细胞的作用研究

中国中西医结合肾病杂志 2022年第9期23卷 781-785,I0002页

作者：杜伟孙伟重庆大学附属涪陵医院泌尿外科重庆408000

目的:探究川陈皮素对肾细胞癌的作用及其可能的作用机制。方法:将人肾透明细胞腺癌细胞786-O随机分为对照组、15μmol/L组、30μmol/L组、30μmol/L+sh-NC组和30μmol/L+sh-Slfn5组。按照分组,进行sh-NC、sh-Slfn5慢病毒转染以及川陈皮... 详细信息

目的:探究川陈皮素对肾细胞癌的作用及其可能的作用机制。方法:将人肾透明细胞腺癌细胞786-O随机分为对照组、15μmol/L组、30μmol/L组、30μmol/L+sh-NC组和30μmol/L+sh-Slfn5组。按照分组,进行sh-NC、sh-Slfn5慢病毒转染以及川陈皮素给药处理,CCK-8试剂盒检测细胞活力;克隆形成实验检测细胞增殖;流式细胞数检测细胞凋亡;RT-PCR检测Slfn5 mRNA表达;Western blot检测Bax、Bcl-2、Slfn5、PTEN、p-Akt和Akt蛋白表达。结果:川陈皮素对786-O细胞的IC50=30.08μmol/L;与对照组相比,川陈皮素15μmol/L组和30μmol/L组24 h、48 h和72 h的细胞活力、细胞克隆数以及Bcl-2、p-Akt/Akt蛋白表达水平显著降低(P5),细胞凋亡率、Slfn5 mRNA表达水平以及Slfn5、Bax、PTEN蛋白表达水平显著升高(P5);30μmol/L组和30μmol/L+sh-NC组细胞中各检测指标差异均无统计学意义(P>0.05);与30μmol/L+sh-NC组相比,30μmol/L+sh-Slfn5组24 h、48 h和72 h的细胞活力、细胞克隆数以及Bcl-2、p-Akt/Akt蛋白表达水平显著升高(P5),细胞凋亡率、Slfn5 mRNA表达水平以及Slfn5、Bax、PTEN蛋白表达水平显著降低(P5)。结论:川陈皮素可能通过上调Slfn5调控PTEN/Akt途径抑制肾细胞癌细胞增殖,促进细胞凋亡。

关键词：川陈皮素肾细胞癌 Slfn5 PTEN Akt途径

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Slfn5基因在卵巢癌上皮-间质转化中的作用及机制

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浙江医学 2022年第19期44卷 2056-2063页

作者：徐巧萍邓魁林青青张珍浙江大学医学院附属杭州市第一人民医院药学部 310006 浙江大学医学院附属杭州市第一人民医院妇产科 310006 西湖大学生命科学院浙江大学医学院附属杭州市肿瘤医院肿瘤内科

目的探讨Slfn5基因在卵巢癌组织中的表达及其对卵巢癌细胞增殖、迁移、侵袭和上皮-间质转化(EMT)的影响。方法收集杭州市第一人民医院确诊的卵巢癌患者手术切除标本,采用荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测卵巢癌组织中Slfn5 mRNA的相对表达量... 详细信息

目的探讨Slfn5基因在卵巢癌组织中的表达及其对卵巢癌细胞增殖、迁移、侵袭和上皮-间质转化(EMT)的影响。方法收集杭州市第一人民医院确诊的卵巢癌患者手术切除标本,采用荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测卵巢癌组织中Slfn5 mRNA的相对表达量。采用Western blot法检测并比较卵巢癌细胞系A2780、SKOV3、OVCAR3、HO8910中Slfn5蛋白的相对表达量;选取表达高的SKOV3、OVCAR3细胞株转染沉默Slfn5基因,分为si-NC组,si-Slfn5^(#1)组、si-Slfn5^(#2)组。Transwell和细胞划痕实验比较各组细胞侵袭、迁移能力。Western blot法考察各组细胞Slfn5及E-钙黏蛋白(E-cadherin)、波形纤维蛋白(Vimentin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)和Snail等EMT相关蛋白和Wnt/β-链环蛋白(β-catenin)信号通路关键蛋白β-catenin的相对表达量。结果相比正常组织,卵巢癌组织Slfn5 mRNA相对表达量明显增高,差异有统计学意义(P5)。相比人卵巢表面上皮细胞IOSE80,SKOV3、OVCAR3和HD8910细胞系Slfn5 mRNA均显著高表达,差异均有统计学意义(均PSlfn5^(#1)组、si-Slfn5^(#2)组穿过基底膜的细胞数量比均减少,差异均有统计学意义(均PSlfn5^(#1)组、si-Slfn5^(#2)组穿过基底膜的细胞数量比均减少,差异均有统计学差异(均PSlfn5^(#1)组、si-Slfn5^(#2)组EMT相关蛋白Vimentin、Snail、N-cadherin相对表达量下降,E-cadherin上升,相比si-NC组,差异均有统计学意义(均PSlfn5^(#1)组、si-Slfn5^(#2)组β-catenin相对表达量降低,相比si-NC组,差异均有统计学意义(均PSlfn5基因在人卵巢癌细胞系中高表达,沉默Slfn5基因降低了卵巢癌细胞系EMT相关蛋白的表达,并抑制细胞迁移和侵袭,其机制可能与调控β-catenin的表达有关。

关键词：卵巢癌 Slfn5 上皮-间质转化迁移侵袭

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Schlafen5对内皮祖细胞增殖、迁移的影响及其在血管损伤修复中的作用和机制

Schlafen5对内皮祖细胞增殖、迁移的影响及其在血管损伤修复中的...

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作者：李玉珠贵州大学

学位级别：硕士

1.背景和目的冠状动脉粥样硬化性心脏病（CHD）,主要是由动脉粥样硬化引起的,而内皮损伤是动脉粥样硬化的危险因素。目前的治疗包括危险因素的控制和经皮冠状动脉介入治疗（PCI）。但是PCI后部分病人会发生管腔再狭窄,因此需要新颖的治... 详细信息

1.背景和目的冠状动脉粥样硬化性心脏病（CHD）,主要是由动脉粥样硬化引起的,而内皮损伤是动脉粥样硬化的危险因素。目前的治疗包括危险因素的控制和经皮冠状动脉介入治疗（PCI）。但是PCI后部分病人会发生管腔再狭窄,因此需要新颖的治疗策略。内皮祖细胞（EPCs）,从起源包括脾和骨髓,能归巢至损伤血管局部,分化为内皮细胞,表明内皮祖细胞有血管修复的作用。但是,涉及EPCs属性调节的基本机制仍然不确定。Schlafens（slfns）（睡眠因子）是一类高度保守的蛋白,可控制T细胞的发育和成熟,并在过度表达时损害T细胞的增殖和活化。据报道,Slfn5可以调节涉及RCC迁移的基质金属蛋白酶（MMP）基因的表达,例如MMP-1和MMP-13。由此可见,Slfn5是一个具有极其重要功能的蛋白,对其进一步研究有着重要的意义。而我们的前期研究发现,Slfn5在大鼠EPCs有表达,其是否参与调节EPCs的作用,目前仍不清楚,因此,我们提出假设Slfn5可能参与EPCs增殖、迁移等生物理学形为的调节,从而影响其修复损伤血管的能力。2方法2.1脊椎动物slfn基因家族生物信息学分析对人和小鼠slfn家族基因的基因结构、染色体定位、表达的组织特异性、编码蛋白的理化性质进行了生物信息学分析。随后,对27个物种中的slfn基因家族成员进行系统进化树的构建以及基因结构和保守基序分析。2.2 sh RNA-Slfn5重组腺病毒载体的构建根据Rat Slfn5基因的m RNA序列设计合成si RNA片段5个,分别克隆到p DKD-CMV-U6-sh RNA上转入大肠杆菌感受态细胞,PCR筛选转化子,阳性克隆进行测序;利用Admax系统选取目的穿梭质粒sh RNASlfn5（5）包装和扩增重组腺病毒sh RNA-Slfn5及病毒滴度测定;利用Slfn5过表达腺病毒质粒中目的基因携带Flag标签,通过Western印迹法检测Slfn5过表达腺病毒质粒与靶点质粒共转染293T细胞中Flag表达,观察靶点质粒对Slfn5表达的影响;最后用病毒感染EPCs并用绿色荧光蛋白量检测转染效率。2.3 Slfn5对EPCs增殖和迁移的影响及机制2.3.1 Slfn5对EPCs增殖和迁移的影响2.***.1.1 EPCs培养与鉴定使用密度梯度离心法分离脾脏来源的单核细胞,用ac-LDL-Di与FITCUEA-I双染色阳性的细胞被鉴定为分化的内皮祖细胞。此外,通过流式细胞术分析评估内皮细胞标记物（CD31、KDR）和祖细胞标记物（CD34、CD133、CD45）的表达。通过免疫荧光鉴定VWF、CD34、CD133的表达。2.***.1.2 sh RNA-Slfn5及Ad-Slfn5转染EPCs转染效率的测定在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达,计算绿色荧光细胞所占所有细胞百分比,计算细胞转染效率;RT-PCR检测Slfn5 m RNA表达水平2.***.1.3体外细胞水平观察Slfn5对EPCs增殖和迁移的作用分离培养6-8天的大鼠骨髓源EPCs用于实验。实验分组:（1）Ad-Slfn5（Slfn5过表达组）;（2）sh RNA-Slfn5（Slfn5干扰组）;（3）Ad-control（过表达对照组）;（4）sh RNA-control（干扰对照组）;（5）control（未处理的EPCs空白对照组）将sh RNA-Slfn5、Ad-Slfn5及对应的空病毒对照腺病毒转染细胞,转染48小时后用于实验。采用CCK8法检测EPCs的增殖情况,流式细胞仪检测细胞周期分布情况,transwell小室检测细胞的迁移能力。2.3.2体外细胞水平观察Slfn5调控EPCs的作用机制经过sh RNA-Slfn5、Ad-Slfn5及对应的空病毒对照腺病毒转染EPCs,转染48小时后,用Western blot以及RT-PCR检测EPCs中MT1-MMP在蛋白水平及m RNA不平的表达;2.3.3在体动物模型水平观察Slfn5对颈动脉血管损伤修复的影响雄性SD大鼠用75mg/千克戊巴比妥麻醉,用100 UI/千克肝素钠肝素化。用2Forgarty导管在左颈总动脉进行球囊损伤三次。球囊损伤后,立即经尾静脉注入事先转染Ad-Slfn5、sh RNA-Slfn5、Ad-control、sh RNA-control的EPCs以及正常的EPCs,对照组注射生理盐水。术后用青霉素预防感染。伊文氏蓝染色观察损伤后14天血管再内皮化,HE染色观察损伤后14天新生内膜的增生情况。3.结果:3.1脊椎动物slfn基因家族生物信息学分析人slfn家族各成员的基因结构和表达的组织分布均存在较大差异。其编码蛋白多为酸性,亲水性高。系统发育分析表明,slfn成员聚集在四个主要谱系中,其中三个谱系有强有力的引导支持（90%-100%）。人类slfn家族表达的组织分布结果表明Slfn5主要在转化的皮肤成纤维细胞、皮下脂肪组织、肺以及脾脏中

关键词：内皮祖细胞 Slfn5 MT1-MMP 增殖迁移

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