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嗜水气单胞菌感染后鲤slc15基因表达研究

嗜水气单胞菌感染后鲤Slc15基因表达研究

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作者：姜洲河南师范大学

学位级别：硕士

溶质载体15(slc15)家族是利用质子梯度和负膜电位作为二肽/三肽和拟肽分子的跨膜转运蛋白,具有介导短肽链和拟肽物质进入各种细胞的功能。因此,slc15家族也被称为寡肽转运载体家族(POTs)。在哺乳动物中共记录了五个成员,包括slc15a1(Pep... 详细信息

溶质载体15(slc15)家族是利用质子梯度和负膜电位作为二肽/三肽和拟肽分子的跨膜转运蛋白,具有介导短肽链和拟肽物质进入各种细胞的功能。因此,slc15家族也被称为寡肽转运载体家族(POTs)。在哺乳动物中共记录了五个成员,包括slc15a1(Pep T1)、slc15a2(Pep T2)、slc15a3(Ph T2)、slc15a4(Ph T1)和slc15a5。本研究首次在鲤(Cyprinus carpio)基因组中鉴定出10个slc15基因家族成员,比较基因组学分析显示鲤slc15基因显著扩增,并验证了鲤的第四轮全基因组复制(4R-WGD)。通过进一步系统发育关系分析,证实该基因家族在鲤进化过程中具有高度保守性。使用半定量RT-PCR法对鲤健康组织中的slc15基因表达分析,发现大多数基因表达表现出组织特异性。在负责消化吸收的鲤肠道中观察到slc15基因具有相对较高的表达水平,表明slc15基因在营养转运过程中起到关键作用。部分基因拷贝具有相似的表达模式,如slc15a1b-1/-2、slc15a2-1/-2和slc15a4-1/-2,表明两个拷贝基因之间的功能可能没有发生大的分化。此外,还观察到部分拷贝基因之间的表达出现差异,例如slc15a1a-1/slc15a1a-2和slc15a5-1/slc15a5-2,这些差异反映基因复制后,不同拷贝之间的功能出现分化,该发现为鲤全基因组复制后基因的功能多样化提供了证据。为了研究嗜水气单胞菌感染后鲤slc15基因的蛋白表达模式,本研究首先制备鲤slc15a1a、slc15a1b、slc15a2-1和slc15a2-2基因的多克隆抗体,从蛋白质水平上探究了上述基因在鲤体内免疫应答机制中的变化。在对slc15a1两个拷贝基因的研究中,采用ELISA法检测获得鼠抗slc15a1a和slc15a1b的效价分别为8.1×10和2.7×10。当受到嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)感染时,鲤slc15a1a和slc15a1b的最高蛋白表达水平与空白对照组相比,分别增加了3.39和2.85倍,说明本实验制备的多克隆抗体具有较高的亲和力和特异性,并表现出较强的免疫原性,能够及时诱导机体产生免疫应答。slc15a1a在嗜水气单胞菌感染后3 h和6 h迅速做出高表达量响应,在12 h后开始出现表达水平的下降,但slc15a1b在3～24 h时却一直维持着较稳定的高表达响应,这说明slc15a1a和slc15a1b之间具有一定的表达差异。在感染过程中,slc15a1a的表达量基本高于slc15a1b。因此slc15a1a可能是slc15a1的主效基因,在鲤免疫应答过程中起到更加重要的作用。在对slc15a2的研究中,也发现了相似的结果。当嗜水气单胞菌感染后,两个拷贝基因之间整体具有相似的表达趋势,说明二者之间可能具有相似的基因功能。slc15a2-1虽在3 h时率先做出低表达响应,但与slc15a2-1相比,slc15a2-2在0 h至48 h之间显著高表达,可能是作为该基因拷贝中的主效基因,并且从6 h到24 h时,两个拷贝就一直呈现互补的表达方式,共同表达量维持在较高水平,在面对病原侵害时共同做出有效响应。当嗜水气单胞菌感染鲤后,实时荧光定量q RT-PCR结果显示:几乎所有的S lc15基因在感染早期都有表达增加的趋势,并在感染后12 h达到最高表达水平。在胁迫后的最后两个阶段,表达水平呈直线下降趋势,并在48 h达到最低表达水平。在感染早期,slc15基因可以在炎症因子的刺激下积极上调表达水平,通过“放大”免疫信号,提高机体抵抗外来入侵的防御能力。因此,激活slc15基因可能是一种治疗鲤嗜水气单胞菌感染病的有效方法。近年来,益生菌在增强机体抗病能力、改善鱼类养殖水体环境方面发挥着至关重要的作用。本研究通过在鲤饲料中添加3种不同乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)对感染嗜水气单胞菌后slc15基因表达模式进行研究,发现在乳酸乳球菌处理组的各阶段,大多数slc15基因的表达水平显著高于对照组,而菌株3对slc15基因的诱导效果优于菌株1和2。因此在饲料中添加乳酸乳球菌菌株3或许可作为一种治疗嗜水气单胞菌感染的好方法。

关键词：鲤 slc15 抗体嗜水气单胞菌乳酸乳球菌基因表达

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