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日本血吸虫sjshh基因的鉴定分析及SjWnt1蛋白功能的初步研究

日本血吸虫SjShh基因的鉴定分析及SjWnt1蛋白功能的初步研究

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作者：贾英英吉林农业大学

学位级别：硕士

日本血吸虫病是由日本血吸虫引起的一种严重的寄生虫病,危及人类及家畜的健康,影响社会经济的发展。治疗上用药物单一,存在用药风险。Hedgedge(Hh),Wnt信号通路是与发育相关的通路,均可以影响个体的胚胎发育及维持组织稳态。本文对日本... 详细信息

日本血吸虫病是由日本血吸虫引起的一种严重的寄生虫病,危及人类及家畜的健康,影响社会经济的发展。治疗上用药物单一,存在用药风险。Hedgedge(Hh),Wnt信号通路是与发育相关的通路,均可以影响个体的胚胎发育及维持组织稳态。本文对日本血吸虫中的Sonic Hedgehog(Shh)基因进行鉴定分析,通过小分子干扰(siRNA)抑制Hh通路中的Shh及wnt通路的wnt1的靶基因,来进一步明确其在日本血吸虫中的作用,为寻求日本血吸虫的新的药靶基因提供思路。1、日本血吸虫sjshh基因的鉴定分析及不同发育阶段及不同性别虫体的mRNA的表达利用NCBI检索Shh的EST序列,并通过RACE技术得到全基因序列并命名为sjshh基因,并对其进行生物信息学分析,开放阅读框(ORF)为2145bp。sjshh蛋白有两个蛋白结构域,位于氨基端的“Hedge”结构域(HhN)和位于羧基末端的“Hog”结构域(HhC)。对sjshh进行转录水平结果的分析,表明sjshh基因在日本血吸虫的整个发育阶段均起到必不可少的作用。基因进行各虫体阶段的mRNA表达水平分析,提示sjshh基因调控日本血吸虫的整个发育过程,在童虫阶段表达量明显高于成虫、虫卵及尾蚴阶段,童虫的18天虫体转录水平达到最大,提示sjshh基因对日本血吸虫的生殖系统发育相关。非适宜宿主与单性别感染的非正常发育的虫体的mRNA转录水平增高,提示虫体发育滞后可以导致Hh通路的转导延迟。2、日本血吸虫sjshh蛋白的功能研究成功筛选出有效且稳定的siRNA,编号为Shh796,并确定最适干扰浓度为1.5OD/ml,进行Shh796 siRNA的体内14、24天两个阶段的干扰实验,结果表明均有良好的抑制效果,体外sjshh siRNA的干扰试验中,72小时时抑制效果做好。但是sjshh基因的体内的siRNA干扰,对虫体的形态和宿主的血常规没有明显的影响。生化指标ALT、AST和LDH的减少,表明干扰Hh通路,可以减轻日本血吸虫对宿主肝脏的损伤。3、日本血吸虫SjWnt1蛋白的功能研究23天虫体免疫组化结果分析,Wnt1蛋白主要分泌在体被下层,肠管周围和睾丸中,其中睾丸的分布最密集,提示SjWnt1蛋白的功能可能与日本血吸虫雄虫的生殖相关。对SjWnt1进行siRNA干扰,降低其转录水平,通路的下游基因的mRNA的表达量也出现下调,表明SjWnt1参与Wnt通路的三个转导途径即Wnt/β-catenin、Wnt/PCP及Wnt/Ca2+信号通路。体外siRNA干扰后虫体电镜结果:皮层变得肿胀,体被出现较大空泡,基底膜溶解,扩散,体棘减少,线粒体激增且伴有严重的肿胀,肠道微绒毛脱落,出现断裂,表明SjWnt1的抑制使日本血吸虫的表层受损,虫体能量代谢失衡,虫体自身的稳态受到影响。本文通过Race技术获得了sjshh基因,并对其进行了鉴定分析,通过定量的方法确定了sjshh基因在日本血吸虫中的表达情况。对sjshh及SjWnt1进行siRNA的体内与体外的干扰实验,为了解sjshh、SjWnt1在日本血吸虫中的功能作用提供了基础。

关键词：日本血吸虫 sjshh SjWnt1

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