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河北农业科学 2018年第2期22卷 1-5,11页

作者：王根平刘敏轩张婷师志刚张喜瑞杨伟红李琳高翔董立程汝宏河北省农林科学院谷子研究所国家谷子改良中心河北省杂粮研究实验室河北石家庄050035 中国农业科学院作物科学研究所国家农作物基因资源与基因改良重大科学工程北京100081

自噬相关基因ATG5是植物应答逆境胁迫的一个关键基因。谷子siatg5响应干旱的作用模式尚不明确。研究干旱胁迫下谷子中ATG5的表达模式,可揭示siatg5在响应谷子抗旱中的作用。以谷子抗旱品种冀谷34为试材,克隆siatg5;研究轻度干旱(PEG-600... 详细信息

自噬相关基因ATG5是植物应答逆境胁迫的一个关键基因。谷子siatg5响应干旱的作用模式尚不明确。研究干旱胁迫下谷子中ATG5的表达模式,可揭示siatg5在响应谷子抗旱中的作用。以谷子抗旱品种冀谷34为试材,克隆siatg5;研究轻度干旱(PEG-6000浓度6%)、中度干旱(PEG-6000浓度18%)和重度干旱(PEG-6000浓度30%)胁迫下,siatg5在冀谷34中的表达模式。结果表明:siatg5全长1 092 bp,无内含子,编码363个氨基酸。预测分子量为40.3 kD,理论等电点为5.03,三级结构分析表明含有ATG5特有结构域,YLoc软件预测位于细胞质内。其siatg5与高粱和玉米中的ATG5同源性最高。siatg5在冀谷34中的表达结果分析表明,在轻度和中度胁迫下24 h内表达量逐渐升高;重度胁迫下6 h表达量达到最高,随后逐渐降低。中、重度胁迫下的表达量显著高于轻度胁迫下的表达量(P5)。siatg5参与冀谷34的抗旱反应,为研究siatg5在响应干旱胁迫中的作用及冀谷34抗旱机理奠定了基础。

关键词：自噬基因抗旱 siatg5 冀谷34

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降低自噬水平增强二氯乙酸二异丙胺抗胆管癌作用的研究

降低自噬水平增强二氯乙酸二异丙胺抗胆管癌作用的研究

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作者：吴龙云南京大学

学位级别：硕士

背景和目的胆管癌是消化道恶性程度较高的恶性肿瘤之一,近年来流行病学调查显示,胆管癌在国内外发病率呈上升趋势。胆管癌早期诊断困难,手术切除率低,药物治疗效果差,预后较差。因此,探讨新的治疗方法,对进一步提高胆管癌的疗效具有重... 详细信息

背景和目的胆管癌是消化道恶性程度较高的恶性肿瘤之一,近年来流行病学调查显示,胆管癌在国内外发病率呈上升趋势。胆管癌早期诊断困难,手术切除率低,药物治疗效果差,预后较差。因此,探讨新的治疗方法,对进一步提高胆管癌的疗效具有重要意义。大多数肿瘤都存在Warburg效应,该效应可能是肿瘤细胞对化疗和放疗抵抗的基础。国内外研究表明通过抑制糖酵解的某些关健酶(已糖激酶、6-磷酸果糖激酶-1和丙酮酸激酶)可以降低肿瘤细胞的能量代谢进而杀伤肿瘤。丙酮酸脱氢酶激酶(Pyruvate dehydrogenase kinase,PDK)是线粒体丙酮酸脱氢酶复合体(Pyruvate dehydrogenase complex,PDC)中丙酮酸脱氢酶(Pyruvate dehydrogenase,PDH)的负调节因子;目前PDK有四种同工酶:PDK1、PDK2、PDK3和PDK4。正常机体中,PDK1主要在心脏中表达,PDK3在睾丸中表达,而PDK4主要在心脏和骨骼肌中表达;PDK2表达广泛,在多种组织中均有表达。近年来越来越多研究表明PDK在多种肿瘤组织(如头颈癌、胃癌、非小细胞肺癌、胶质细胞癌、结肠癌等)中异常表达,而且PDK的异常表达与肿瘤的发生、发展及预后有着密切的关系。然而,目前关于PDK在胆管癌中所扮演的角色尚未探明。二氯乙酸(Dichloroacetate,DCA)是PDK的一种小分子抑制剂,目前被批准用于先天性乳酸中毒症的治疗。2007年,加拿大Alberta大学的Michelakis研究小组发现DCA具有抗癌活性;然而DCA随着剂量的累积存在导致周围神经病变和中枢性神经损伤的风险,限制了其在临床中的应用。二氯乙酸二异丙胺(Diisopropylamine Dichloroacetate,DPDA),一类新型 PDK 抑制剂,主要用于治疗脂肪肝、肝内胆汁淤积及肝损伤;与DCA相比,DPDA较为安全,几乎无外周神经毒性及其他不良反应报道。本研究旨在探讨DPDA对胆管癌细胞增殖和自噬的影响,并探讨自噬抑制剂和ATG5小干扰能否增强DPDA的抗肿瘤疗效。方法通过细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)检测不同浓度DPDA对人胆管癌细胞株RBE、QBC-939增殖的影响。DPDA处理胆管癌细胞后,使用免疫印迹法(Western Blotting,WB)检测微管相关蛋白轻链3(Microtubule-associated Protein1 Light Chain3,LC3)的蛋白表达情况,用电镜检测自噬体和自噬溶酶体的形成情况。使用溶酶体抑制剂氯喹与DPDA联合处理胆管癌细胞后采用WB检测LC3蛋白表达的变化:用CCK-8法检测联合使用自噬抑制剂和DPDA对胆管癌细胞增殖的影响。通过小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)抑制自噬相关基因5(Autophagy-related Gene 5,ATG5)表达后联合DPDA处理胆管癌细胞,用CCK-8法检测胆管癌细胞的增殖、Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒检测凋亡、PI周期检测试剂盒检测周期变化情况。结果CCK-8试验显示PDK特异性抑制剂DPDA能浓度性、时间性依赖的抑制胆管癌细胞的增殖,药物作用48h后半数抑制浓度(IC50):RBE为33mM,QBC-939为:18.2mM。DPDA可以诱导自噬的形成。小干扰RNA沉默ATG5之后联合使用DPDA可以促进细胞凋亡和周期阻滞抑制胆管癌细胞增殖(P5)。结论PDK的抑制剂DPDA对胆管癌细胞存在不同程度的抑制增殖的作用,这种作用呈现浓度依赖和时间依赖。DPDA可以诱导保护性的自噬,自噬抑制剂氯喹可以增强胆管癌细胞对DPDA的敏感性。利用小干扰技术沉默ATG5再联合使用DPDA,可以显著抑制细胞增殖。

关键词：胆管癌 Warburg效应 PDK DPDA 自噬氯喹 siatg5

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