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CRISPR/Cas9基因编辑技术在猪上的应用

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黑龙江畜牧兽医 2017年第5期 71-76,293页

作者：杨晓峰汤飞李紫聪刘德武吴珍芳蔡更元郑恩琴华南农业大学动物科学学院/国家生猪种业工程技术研究中心广州510642

CRISPR/Cas9(clustered regulatory interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9)系统在活细胞中能精确有效地进行基因组编辑,被广泛应用在生命科学的各个领域中。相比原有的基因编辑技术,CRISPR/Cas9基因编辑技术程序简易、操作方便灵活,极大简化了遗传工程的操作,提高了基因编辑效率。文章回顾了CRISPR/Cas9基因编辑技术的发展历程,阐述了其作用机制及在哺乳动物猪上的应用。通过sgrna的设计原理、作用机制对CRISPR/Cas9技术存在的问题进行分析,试图提高其打靶效率,降低脱靶效应,为优化CRISPR/Cas9的设计及应用提供参考。

关键词： CRISPR/Cas9 猪 sgrna 打靶效率脱靶效应

CRISPR/Cas9技术初步探究橙色红曲菌AS3.4384 pksCT基因敲除方法

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CRISPR/Cas9技术初步探究橙色红曲菌AS3.4384 pksCT基因敲除方法

作者：刘欣南昌大学

学位级别：硕士

红曲菌是一种药食两用的丝状真菌,其在发酵过程中可以产生色素、Mona colin K等多种次级代谢产物,它们具有抗癌、降脂、抑菌等功效。然而,红曲菌也会产生一种真菌毒素—桔霉素,其具有致畸、致癌、致突变的作用,从而限制了红曲菌更广泛... 详细信息

红曲菌是一种药食两用的丝状真菌,其在发酵过程中可以产生色素、Mona colin K等多种次级代谢产物,它们具有抗癌、降脂、抑菌等功效。然而,红曲菌也会产生一种真菌毒素—桔霉素,其具有致畸、致癌、致突变的作用,从而限制了红曲菌更广泛的应用。探索一种安全可靠、操作简便的降低桔霉素方法,解决红曲菌产桔霉素的问题具有重要的实际意义。CRISPR/Cas9基因编辑技术能够进行精准定点的编辑,具有操作简便、高效率等优点,为基因编辑提供了一种新的方向。因此,本论文主要的目的是探索CRISPR/Cas9基因编辑技术在红曲菌中的应用,试图从分子生物学的角度解决红曲菌产桔霉素的问题,同时为红曲菌基因组的编辑寻求一种新的方法。本文首先探讨了 sgrna和spCas9在体外对目的基因的酶切效果;然后根据体外验证试验的结果选择一条sgrna用于载体构建;最后研究了载体导入菌体后对菌体生长的影响以及目的基因是否发生突变或缺失。主要研究结果如下:1.在红曲米的发酵培养中加入黄酮类化合物,30 g大米中添加1%金雀异黄酮可以降低桔霉素31.3%,添加1%木犀草素,桔霉素的产量可以降低37.7%。2.三条sgrna的体外酶切试验中,位于pksCT基因的第一个外显子上的第一个靶点的体外酶切效果最好,酶切效率可以达到75%。3.108个/mL红曲菌孢子悬液在潮霉素平板上培养7 d,80 μg/mL的潮霉素能完全抑制红曲菌的生长。***1-Hygro-EGFP质粒为真菌表达质粒,其中EGFP基因所对应的gpdA启动子和trpC终止子,通过荧光蛋白分析,可以确定gpdA启动子在红曲菌中可以发挥作用。5.通过测序结果分析,确认Ps6C以及Ps敲除载体的构建成功。***质粒转入红曲菌后在抗性平板上可以生长,而没有转Ps质粒的红曲菌则不能生长,证明质粒已成功转入红曲菌。

关键词：红曲菌 CRISPR/Cas9 sgrna 桔霉素 pksCT

布鲁氏菌中CRISPRi与CRISPR/Cas9系统的构建及功能验证

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布鲁氏菌中CRISPRi与CRISPR/Cas9系统的构建及功能验证

作者：汪洋华中农业大学

学位级别：硕士

布鲁氏菌病(brucellosis)是一种波及世界的重要的人畜共患病,对畜牧业造成了严重的经济损失,因为它人畜共患病的特点,也使其成为了人类健康和社会安全的一大威胁。然而,迄今为止,都未能研发出安全有效的疫苗。布鲁氏菌(Brucella),又称... 详细信息

布鲁氏菌病(brucellosis)是一种波及世界的重要的人畜共患病,对畜牧业造成了严重的经济损失,因为它人畜共患病的特点,也使其成为了人类健康和社会安全的一大威胁。然而,迄今为止,都未能研发出安全有效的疫苗。布鲁氏菌(Brucella),又称作布氏杆菌,是造成布鲁氏菌病的病原体,要研发出安全有效的疫苗,对该菌各类基因的功能研究是十分重要的。目前,对布鲁氏菌基因的功能研究存在许多困难。一是布鲁氏菌生长缓慢,在实验室稳定的培养环境下,菌体需要生长36-48h才能在平板上长出肉眼可见的菌落。初次分离的野生菌株生长往往更加缓慢。二是布鲁氏菌病人畜共患的特征,使得对布鲁氏菌的操作变的相当繁琐和耗时。这些因素都使得对布鲁氏菌基因的研究变得格外困难。目前,对布鲁氏菌基因功能的研究主要是依靠自杀质粒,通过单交换和双交换建立基因缺失株,再通过对基因缺失株的研究探索基因功能。但是,该方法耗时长,操作量大,大大增加了科研人员的操作风险,同时也减缓了研究进度。所以,在布鲁氏菌中创建一类迅速、精准、有效的基因研究方式是具备重要意义的。CRISPRi与CRISPR/Cas9系统,是近年发展迅速的领先的基因研究方法。由于其快速、精确、高效的基因编辑效果,马上成为众多科学家的研究热点。当前已普遍用在对多种生物的研究中。为此,本研究中,我们研究了CRISPRi与CRISPR/Cas9系统在布鲁氏菌中应用的可行性。首先,我们建立了可在布鲁氏菌中复制表达的CRISPRi工作质粒。CRISPRi系统由两个重要部分组成,具有阻遏目标基因转录功能的dCas9蛋白和具有目标基因识别功能的sgrna。本研究中,我们以布鲁氏菌外膜蛋白基因omp19为靶基因设计sgrna,对omp19的表达进行下调,评估了CRISPRi系统在布鲁氏菌中对基因表达下调的作用。此外,我们又建立了可在布鲁氏菌中复制表达的CRISPR/Cas9工作质粒,并利用该表达系统尝试对布鲁氏菌omp19基因进行敲除。主要成果如下:1.利用CRISPRi系统使布鲁氏菌外膜蛋白基因omp19表达下调,且下调具有显著性。成功构建2种可以在布鲁氏菌中复制的CRISPRi工作质粒,分别通过组成型表达和诱导型表达的形式表达dCas9蛋白。设计sgrna,靶定下调omp19基因。将CRISPRi工作质粒转化布鲁氏菌16M感受态,应用实时荧光定量PCR分析该基因在mRNA水平的表达,通过western blot的方法分析该基因在蛋白水平的表达。结果显示,omp19基因表达量下调,并具有显著性。2.利用CRISPR/Cas9系统成功切割布鲁氏菌基因组。成功建立了在布鲁氏菌中诱导型表达wtCas9蛋白的CRISPR/Cas9工作质粒。设计sgrna,在omp19基因上对布鲁氏菌基因组进行切割。将该质粒转化至布鲁氏菌16M感受态,结果显示CRISPR/Cas9成功地切断布鲁氏菌基因组。3.增强了布鲁氏菌通过非同源末端连接途径(non-homologous end joining,NHEJ)的基因修复功能。构建能够在布鲁氏菌中复制并表达NHEJ途径重要相关蛋白Mku与LigD的工作质粒,且验证了该质粒增强了菌体内NHEJ途径的修复活性。

关键词：布鲁氏菌 CRISPRi CRISPR/Cas9 sgrna NHEJ

CRISPR／Cas9基因组编辑技术及其影响因素

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中国畜牧杂志 2017年第8期53卷 5-9页

作者：梁奔梦狄冉刘秋月王翔宇胡文萍储明星中国农业科学院北京畜牧兽医研究所农业部动物遗传育种与繁殖重点实验室北京100193

CRISPR/Cas9技术可对基因组进行定点修饰,近几年已被广泛用于细胞和生物体中,是目前最新、最高效的基因组编辑技术。本文主要介绍了CRISPR/Cas9基因组编辑技术的原理、在动物基因组修饰中的应用以及该技术可能存在的问题,比如sg RNA的... 详细信息

CRISPR/Cas9技术可对基因组进行定点修饰,近几年已被广泛用于细胞和生物体中,是目前最新、最高效的基因组编辑技术。本文主要介绍了CRISPR/Cas9基因组编辑技术的原理、在动物基因组修饰中的应用以及该技术可能存在的问题,比如sg RNA的设计、ss ODNs模板的设计以及降低脱靶效应的研究,从而为提高CRISPR/Cas9基因组编辑效率奠定基础。

关键词： CRISPR/Cas9 sgrna ssODNs 脱靶效应

基于AGO1融合甲基转移酶的DNA甲基化修饰技术研究

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基于AGO1融合甲基转移酶的DNA甲基化修饰技术研究

作者：米克（Shramik Shrestha）东南大学

学位级别：硕士

基因表达调控是治疗疾病和遗传性疾病的一项很有前途的技术。现有的基因调控技术大多是不可逆的,但DNA甲基化是可逆的。有一个稳定的载体将甲基转移酶负载到核酸酶中对于DNA甲基化的成功是非常重要的。在这项研究中,我们研究了新的AGO1... 详细信息

基因表达调控是治疗疾病和遗传性疾病的一项很有前途的技术。现有的基因调控技术大多是不可逆的,但DNA甲基化是可逆的。有一个稳定的载体将甲基转移酶负载到核酸酶中对于DNA甲基化的成功是非常重要的。在这项研究中,我们研究了新的AGO1与DNMT3a3l甲基转移酶的融合,并将其装载到细胞核中,从而实现基因的甲基化。我们鉴定了未甲基化的靶基因并开发了基于AGO的甲基转移酶融合蛋白,研究了其通过靶DNA甲基化抑制基因表达的作用。研究的主要结果如下:首先,我们构建了AGO1与甲基转移酶(DNMT3a3l)的融合蛋白。这两种蛋白在连接子(5*G3S)的帮助下融合。对融合蛋白进行了在线模拟,制备了两种结合方式的融合蛋白。在此基础上设计了两种融合模式,并用共焦显微镜观察了负载情况,其中DNMT3a3l-linker-ago1基于荧光对比度在细胞核内显示出更好的结果。然后对融合蛋白的表达进行监测,并用SiRNA转染融合蛋白,观察融合蛋白和SiRNA在细胞核内的负载效率。最后,我们选择了肿瘤相关基因RASSF1A,并利用T-3克隆技术检测了该基因的甲基化状态。我们研究了HeLa细胞系、Raji细胞系和C-33A细胞系,发现HeLa细胞系的RASSF1A未甲基化,而Raji和C-33A在基因启动子区甲基化。用该融合蛋白进行DNA甲基化后,在HeLa细胞中观察到RASSF1A基因的表达模式。在这里我们还建立了一个dCas9-DNMT3a3l质粒并研究了表达的变化。RASSF1A启动子区在AGO系统中以SiRNA为定位靶点,而在dCas9系统中以sgrna为定位靶点。荧光显微镜观察融合蛋白和rna的定位,表明转染成功。RT-q PCR结果表明,两个系统都显示在这个特定的非甲基化基因启动子区域基因表达水平的变化。我们开发了一种基于AGO1的甲基化化合物,它能成功地表达并装载到细胞核中,并且利用该系统靶向未甲基化的基因并抑制其表达。我们也可以通过相应的SiRNA设计来靶向其他基因。

关键词： AGO蛋白 TGS SiRNA sgrna 甲基化

猕猴桃表皮毛发育基因的筛选及其在海沃德猕猴桃中的基因编辑研究

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猕猴桃表皮毛发育基因的筛选及其在海沃德猕猴桃中的基因编辑研究

作者：李创西北农林科技大学

学位级别：硕士

猕猴桃果实维生素C含量高,具有均衡的矿物质营养、膳食纤维和利于人体健康的代谢物组分,被誉为“水果之王”。果皮毛是影响猕猴桃外观品质和消费的因素之一,果实少毛或无毛是猕猴桃育种的主要目标之一。本论文以‘红阳’猕猴桃(Actinidi... 详细信息

猕猴桃果实维生素C含量高,具有均衡的矿物质营养、膳食纤维和利于人体健康的代谢物组分,被誉为“水果之王”。果皮毛是影响猕猴桃外观品质和消费的因素之一,果实少毛或无毛是猕猴桃育种的主要目标之一。本论文以‘红阳’猕猴桃(Actinidia chinensis cv.‘Hongyang’)、毛花猕猴桃(Actinidia eriantha)、和山梨猕猴桃(Actinidia rufa)为材料,基于猕猴桃二代和三代转录组数据,筛选出2个调控猕猴桃表皮毛发育的候选基因并在六倍体美味猕猴桃‘海沃德’(Actinidia deliciosa‘Hayward’)中进行基因编辑研究,以筛选出调控猕猴桃表皮毛发育的基因,为基因编辑育种奠定基础。本试验主要结果如下:1.以AtGL1、AtGL2、AtGL3、AtTTG1和AtSAD2等5个调控拟南芥表皮毛起始和发育的基因为模板,基于猕猴桃基因组数据库,通过比对获得了相应的同源基因,通过蛋白质序列比对和进化树的构建和分析,分别获得了AtGL1的候选基因Achn116791,AtGL2的候选基因Achn198951,AtGL3的候选基因Achn244201、Achn302211和Achn071731,AtTTG1的候选基因Achn045741,AtSAD2的候选基因Achn379131和Achn379141。分析了上述候选基因在红阳猕猴桃、毛花猕猴桃和山梨猕猴桃的幼果、成熟叶和茎尖的表达水平以及在红阳猕猴桃果实不同发育阶段的表达水平。最后筛选出了2个调控猕猴桃表皮毛发育的候选基因:AtGL1的候选基因Achn116791和AtGL3的候选基因Achn302211,而基因AtSAD2的候选基因Achn379131可能不是调控猕猴桃表皮毛发育的关键基因。2.选取候选基因Achn116791,Achn302211和Achn379131为目标基因,利用软件CRISPRdirect,根据sgrna设计的原则,对目标基因进行sgrna设计,成功构建了目标基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体,利用农杆菌介导法转化海沃德猕猴桃叶盘。经抗性筛选和PCR鉴定,我们获得了16个猕猴桃Achn116791转基因株系,经测序分析有9个株系发生了碱基的插入、缺失或替换。通过叶片表皮毛的观察,4号、5号和6号株系的叶片表皮毛密度降低、长度变短;我们获得了4个猕猴桃Achn302211转基因株系,其中1个株系发生了碱基的插入,引起了叶片表皮毛密度降低、长度变短;我们获得了4个猕猴桃Achn379131转基因株系,但均未检测到靶位点被编辑。这些结果不仅说明Achn116791基因和Achn302211基因调控着猕猴桃叶片表皮毛的发育,也证实了在六倍体海沃德猕猴桃中可以利用CRISPR/Cas9技术进行基因编辑,且在本试验转基因株系中基因编辑效率为41.7%。

关键词：猕猴桃表皮毛 sgrna CRISPR/Cas9 基因编辑效率

基于CRISPR系统的丝状真菌基因组快速编辑

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基于CRISPR系统的丝状真菌基因组快速编辑

作者：李丹丹福州大学

学位级别：硕士

真菌因其高分泌蛋白质的能力而备受关注,黑曲霉(Aspergillus niger)是一种常见的丝状真菌。黑曲霉在代谢过程中会产生多种高活性的酶,如α-淀粉酶、果胶酶、葡萄糖淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、纤维素酶、单宁酶等,而这些酶都具有重要的经... 详细信息

真菌因其高分泌蛋白质的能力而备受关注,黑曲霉(Aspergillus niger)是一种常见的丝状真菌。黑曲霉在代谢过程中会产生多种高活性的酶,如α-淀粉酶、果胶酶、葡萄糖淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、纤维素酶、单宁酶等,而这些酶都具有重要的经济价值。其中,黑曲霉用于生产柠檬酸的应用最为广泛。实现黑曲霉的基因组编辑使其表型向更利于人类的方面发展,这有着重要的经济价值。但真菌转化难问题限制着真菌基因组编辑的研究。近年来,CRISPR系统(Clustered regμlarly interspersed short palindromic repeats)因其独特的优势,广受国内外科研工作者的青睐。CRISPR系统具有很大潜力能突破传统基因编辑方法的局限,但CRISPR系统黑曲霉中的应用还未有报道。本研究通过尝试将CRISPR系统应用于丝状真菌的基因组编辑,初步探究CRISPR系统在黑曲霉中的适用性及编辑效率。主要研究成果如下:(1)pCAMBIA1302-hFnCpf1 载体的构建。hFnCpf1 来源于Francisella novicida,是具有核酸内切酶活性的蛋白。使用PCR的方法从pcDNA3.1-hFnCpf1质粒上体外扩增目的hFnCpf1蛋白基因序列,再连接到pCAMBIA1302载体上(载体上携带潮霉素抗性基因)。在此过程中不引入任何冗余序列,保证了 hFnCpf1蛋白阅读框架的正确性,成功构建pCAMBIA1302-hFnCpf1载体。(2)农杆菌介导*** CBS513.88遗传转化系统构建。通过优化5个影响因素,建立了高效的转化体系。在这一转化体系中,以潮霉素为筛选标签,使用1.2×107个的孢子,通过三个平行实验获得的转化子数量为85个。成功将pCAMBIA1302-hFnCpf1稳定整合到*** CBS513.88的基因组上(pCAMBIA1302载体上的潮霉素抗性基因也随之整合*** CBS513.88的基因组上)。(3)sgrna的设计与合成。综合考虑sgrna的种子序列、靶标编辑位点(以潮霉素抗性基因为靶编辑基因)、发夹结构、PAM(protospacer adjacent motif)序列等,确定 sgrna 所对应的 DNA 序列(5'-AATTAACCCTCACTAAAGAATTTC TACTGTTGTAGATTGCGGCCATTGTCCGTCAGGACA-3 ')。随后,以该双链DNA序列为模板体外转录获得sgrna。相比于直接合成sgrna,体外转录的方法更为经济。(4)验证 CRISPR/Cpf1 系统在*** CBS513.88 中的适用性。以 *** CBS513.88基因组上的潮霉素抗性基因为靶编辑基因,通过电击转化的方法将外源的 sgrna 瞬时导入到*** CBS513.88-pCAMBIA1302-hFnCpf1 中。以潮霉素抗性基因为筛选标签,结合测序的方法寻找目的突变子并进行分析。本研究对10个突变子序列进行BLAST对比,分析突变的位点。并使用Clustal X软件对突变子的表达框架进行分析,并对实验结果进行讨论。本研究为CRISPR系统首次应用于黑曲霉的基因组编辑,扩充了 CRISPR系统在丝状真菌中的应用。

关键词：黑曲霉 CRISPR Cpf1 sgrna 基因编辑

肿瘤相关抗原CD147促进肺癌细胞恶性行为的机制研究

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肿瘤相关抗原CD147促进肺癌细胞恶性行为的机制研究

作者：王雪妍广西医科大学

学位级别：硕士

目的和意义:构建CD147敲除和过表达的LLC细胞系,探究LLC细胞中CD147在细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡方面的作用。方法:利用CRISPR/Cas9技术,构建lenti CRISPRv2-CD147KO重组质粒,利用工具细胞293T包装慢病毒,再转染至目的细胞LLC,然后用... 详细信息

目的和意义:构建CD147敲除和过表达的LLC细胞系,探究LLC细胞中CD147在细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡方面的作用。方法:利用CRISPR/Cas9技术,构建lenti CRISPRv2-CD147KO重组质粒,利用工具细胞293T包装慢病毒,再转染至目的细胞LLC,然后用含嘌呤霉素的培养基筛选,构建稳定的CD147敲除LLC细胞系LLC-CD147 KO,同时使用购买的CD147过表达慢病毒,转染筛选构建出稳定的CD147过表达LLC细胞系LLC-CD147 OE,并用qPCR检测CD147的表达水平变化,选取稳定转染的细胞株保存。TCGA数据库挖掘分析CD147在正常组织和肺腺癌及泛癌中的差异表达,以及对预后的影响和免疫浸润的差异。进行CCK8实验检测各组细胞的增殖能力,进行Transwell实验检测细胞的迁移能力和侵袭能力,流式细胞术检测Annexin V研究细胞的早期凋亡。结果:构建了lenti CRISPRv2-CD147KO重组质粒,构建稳定的CD147敲除和过表达LLC细胞系LLC-CD147 KO、LLC-CD147 OE。TCGA数据库挖掘分析发现CD147在肺腺癌及多种癌症组织中高表达,与肺腺癌患者的预后不良有关,差异表达CD147的肺腺癌组织中免疫浸润也有差异。将构建的CD147差异表达LLC细胞系与对照组细胞一起进行细胞学实验,发现CD147能够促进LLC细胞的增殖,CD147能够增强LLC细胞的迁移能力,CD147可以增强LLC细胞的侵袭能力,CD147可以抑制细胞的早期凋亡。结论:CD147能够促进LLC细胞的增殖、迁移、侵袭能力,可以抑制细胞早期凋亡,通过促进这些恶性行为促进肿瘤发生发展,验证了CD147分子是肺癌治疗的一个有效的靶点。

关键词： CD147 肺癌 CRISPR/Cas9技术 sgrna

基于CRISPR/Cas9系统的B16F10细胞CD44基因定向修饰的功能研究

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基于CRISPR/Cas9系统的B16F10细胞CD44基因定向修饰的功能研究

作者：王凯鲁东大学

学位级别：硕士

CRISPR/Cas9系统是继锌指核酸酶(ZFNs)技术和转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)技术后新的基因编辑技术。与ZFNs和TALENs相比,CRISPR/Cas9系统具有操作简单,花费低的优点。CRISPR/Cas系统有三种类型,即I型、II型和III型,其中II型是最... 详细信息

CRISPR/Cas9系统是继锌指核酸酶(ZFNs)技术和转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)技术后新的基因编辑技术。与ZFNs和TALENs相比,CRISPR/Cas9系统具有操作简单,花费低的优点。CRISPR/Cas系统有三种类型,即I型、II型和III型,其中II型是最为简单的,人们将其改为基因组定点修饰技术,即CRISPR/Cas9系统。CD44是一组分布极为广泛的多分子形式的膜整合糖蛋白,可以在细胞中介导粘附作用,参与细胞之间特异性粘连过程,包括细胞与细胞之间,细胞与基质之间等。大量研究表明,CD44分子在许多恶性肿瘤中表达,参与肿瘤的发生及其调控,但当前CD44分子的作用机制尚不明确,所以,建立CD44表达降低的小鼠黑色素瘤(B16F10)细胞研究其CD44蛋白的作用有重要的意义。研究目的:利用CRISPR/Cas9系统基因编辑技术,在小鼠黑色素瘤细胞中建立CD44表达降低的细胞株,并以CD44表达降低的细胞为研究对象,进行各种生物学活性的检测。研究方法:(1)对CD44基因设计sgrna序列,sg RNA序列与线性化的PX459质粒连接形成重组质粒,经测序验证,构建出sg RNA/Cas9表达载体。(2)通过电转化将重组质粒转染B16F10细胞,通过流式细胞仪和Western Blot检测重组质粒对B16F10细胞的影响。(3)划痕实验检测CD44蛋白降低后对B16F10细胞迁移能力的影响。(4)MTT法测定CD44蛋白降低后对B16F10细胞增殖能力的影响。(5)流式细胞实验检测CD44蛋白降低后对B16F10细胞凋亡的影响。实验结果:成功构建出针对CD44基因特异性靶位点的重组质粒sg RNA2和sg RNA3;电转染B16F10细胞后经流式和Western Blot鉴定,CD44蛋白表达降低;选取蛋白降低的B16F10细胞经划痕实验验证,CD44表达降低后的B16F10细胞迁移能力下降;选取蛋白降低的B16F10细胞经MTT实验验证,CD44表达降低后的B16F10细胞增殖能力下降;选取CD44蛋白降低的B16F10细胞经流式结果显示,CD44表达降低会使B16F10细胞凋亡显著增加。结论:CRISPR/Cas9技术能够降低B16F10细胞中的CD44蛋白,通过CD44蛋白的降低,进而实现对B16F10细胞迁移能力的影响,进一步实验表明,CD44蛋白降低会引起B16F10细胞活力降低和细胞凋亡变化,使细胞增殖降低。本实验结果有助于我们进一步研究CD44在肿瘤细胞方面的其它调控机制,为其它恶性肿瘤细胞中高表达CD44基因提供潜在的应用价值。

关键词： CRISPR/Cas9 CD44基因 PX459 sgrna B16F10细胞