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Methylation of PLK1 by set7/9 ensures accurate kinetochore–microtubule dynamics

Journal of Molecular Cell Biology 2020年第6期12卷 462-476页

作者： Ruoying Yu Huihui Wu Hazrat Ismail Shihao Du Jun Cao Jianyu Wang Tarsha Ward Fengrui Yang Ping Gui Mahboob Ali Lingluo Chu Fei Mo Qi Wang Youjun Chu Jianye Zang Yun Zhao Mingliang Ye Guowei Fang Peng RChen Zhen Dou Xinjiao Gao Wenwen Wang Xing Liu Xuebiao Yao MOE Key Laboratory for Cellular Dynamics&Anhui Key Laboratory for Chemical Biology CAS Center for Excellence in Molecular Cell ScienceHefei National Science Center for Physical Sciences at Microscale&University of Science and Technology of ChinaHefei 230027China BUCM-MSM-USTC Joint Program on Global Health Equity Beijing University of Chinese MedicineBeijing 100029China Department of Physiology Morehouse School of MedicineAtlantaGA 30310USA Harvard Medical School BostonMA 02115USA Dalian Institute for Physical Chemistry Dalian 116023China Shanghai Institute of Biochemistry and Cell Biology Center for Excellence in Molecular Cell ScienceChinese Academy of SciencesShanghai 200031China College of Chemistry and Molecular Engineering Peking UniversityBeijing 100871China

Faithful segregation of mitotic chromosomes requires bi-orientation of sister chromatids, which relies on the sensing of correct attachments between spindle microtubules and kinetochores. Although the mechanisms underlying PLK1 activation have been extensively studied, the regulatory mechanisms that couple PLK1 activity to accurate chromosome segregation are not well understood. In particular, PLK1 is implicated in stabilizing kinetochore–microtubule attachments, but how kinetochore PLK1 activity is regulated to avoid hyperstabilized kinetochore–microtubules in mitosis remains elusive. Here, we show that kinetochore PLK1 kinase activity is modulated by set7/9 via lysine methylation during early mitosis. The set7/9-elicited dimethylation occurs at the Lys191 of PLK1, which tunes down its activity by limiting ATP utilization. Overexpression of the non-methylatable PLK1 mutant or chemical inhibition of set7/9 methyltransferase activity resulted in mitotic arrest due to destabilized kinetochore–microtubule attachments. These data suggest that kinetochore PLK1 is essential for stable kinetochore–microtubule attachments and methylation by set7/9 promotes dynamic kinetochore–microtubule attachments for accurate error correction. Our findings define a novel homeostatic regulation at the kinetochore that integrates protein phosphorylation and methylation with accurate chromosome segregation for maintenance of genomic stability.

关键词： mitosis PLK1 kinase set7/9 methylation kinetochore-microtubule attachment

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Roles of set7/9 and LSD1 in the Pathogenesis of Arsenicinduced Hepatocyte Apoptosis

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Journal of Clinical and Translational Hepatology 2021年第3期9卷 364-372页

作者： Bing Han Yi Yang Lei Tang Qin Yang Rujia Xie Department of Pathophysiology College of Basic Medical SciencesGuizhou Medical UniversityGuiyangGuizhouChina Guizhou Provincial Key Laboratory of Pathogenesis and Drug Research on Common Chronic Diseases Guizhou Medical UniversityGuiyangGuizhouChina Medical College of Guizhou University GuiyangGuizhouChina

Background and Aims:Multiple regulatory mechanisms play an important role in arsenic-induced liver *** investigate whether histone H3 lysine 4(H3K4)methyltransferase(set7/9)and histone H3K4 demethyltransferase(LSD1/KDM1A)can regulate endoplasmic reticulum stress(ERS)-related apoptosis by modulating the changes of H3K4 methylations in liver cells treated with ***:Apoptosis,proliferation and cell cycles were quantified by flow cytometry and real-time cell *** expression of ERS-and epigenetic-related proteins was detected by Western blot *** antisense set7/9 expression vector and the overexpressed LSD1 plasmid were used for transient transfection of LO_(2) *** effects of NaAsO_(2) on the methylation of H3 in the promoter regions of 78 kDa glucose-regulated protein,activating transcription factor 4 and C/EBP-homologous protein were evaluated by chromatin immunoprecipitation ***:The protein expression of LSD1(1.25±0.08 vs.1.77±0.08,p=0.02)was markedly decreased by treatment with 100μM NaAsO_(2),whereas the set7/9(0.68±0.05 vs.1.10±0.13,p=0.002)expression level was notably increased,which resulted in increased H3K4me1/2(0.93±0.64,1.19±0.22 vs.0.71±0.13,0.84±0.13,p=0.03 and p=0.003).After silencing set7/9 and overexpressing LSD1 by transfection,apoptosis rate(in percentage:3.26±0.34 vs.7.04±0.42,4.80±0.32 vs.7.52±0.38,p=0.004 and p=0.02)was significantly decreased and proliferation rate was notably increased,which is reversed after inhibiting LSD1(in percentage:9.31±0.40 vs.7.52±0.38,p=0.03).Furthermore,the methylation levels of H3 in the promoter regions of GRP78(20.80±2.40 vs.11.75±2.47,20.46±2.23 vs.14.37±0.91,p=0.03 and p=0.01)and CHOP(48.67±4.04 vs.16.67±7.02,59.33±4.51 vs.20.67±3.06,p=0.004 and p=0.001)were significantly increased in LO_(2) cells exposed to 100μM NaAsO_(2) for 24 ***:Histone methyltransferase set7/9 and histone demethyltransferase LSD1 jointly regulate the changes of H3K4me1/me2 levels in

关键词： Arsenic set7/9 LSD1 H3K4me1/2 ER stress

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set7/9介导的内质网应激对砷致肝细胞凋亡的影响

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中国病理生理杂志 2019年第2期35卷 370-373页

作者：汤雷谢汝佳郑璐田甜余蕾胡晓霞蔡爽马子华杨勤韩冰贵州医科大学病理生理学教研室贵州省常见慢性疾病发病机制及药物研究重点实验室贵州贵阳550000 贵州医科大学生理学教研室贵州贵阳550000

目的:通过研究set7/9(set domain containing 7/9)对内质网应激(ERS)的蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)信号通路的影响,探讨其在砷致肝细胞凋亡机制中的作用。方法:把人肝细胞LO2分为对照组、砷染毒模型组、阴性转染组和set7/9 siRNA转染... 详细信息

目的:通过研究set7/9(set domain containing 7/9)对内质网应激(ERS)的蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)信号通路的影响,探讨其在砷致肝细胞凋亡机制中的作用。方法:把人肝细胞LO2分为对照组、砷染毒模型组、阴性转染组和set7/9 siRNA转染组。流式细胞术检测各组细胞凋亡的变化;Western blot方法观察各组LO2细胞set7/9、葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、PERK和p-PERK表达水平的变化。结果:抑制set7/9表达可降低砷染毒LO2细胞的凋亡率(P set7/9表达水平升高,上调LO2细胞GRP78和p-PERK的蛋白水平(P set7/9 siRNA转染后可下调其GRP78和p-PERK的蛋白水平。结论:砷可以通过上调set7/9激活了ERS的PERK信号通路,从而导致肝细胞凋亡。

关键词： set7/9 内质网应激细胞凋亡砷中毒肝损伤

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sh-set7/9表达载体的构建及其在HepG2细胞中的功能

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西安交通大学学报（医学版） 2015年第6期36卷 753-757页

作者：马克君施星臣李平李晓强任雯秦龙施鑫鹤兰州大学第二医院中心实验室甘肃兰州730030 兰州市第二人民医院骨科甘肃兰州730030 兰州大学第二医院药剂科甘肃兰州730030

目的构建sh-set7/9表达载体并筛选稳定转染HepG2细胞株,考察其干扰效果,为后续研究set7/9基因的功能及其在肝癌细胞系中的作用提供实验基础。方法寻找靶向序列,设计siRNA片段,构建针对人set7/9基因的shRNA和对照载体,将干扰载体和载体... 详细信息

目的构建sh-set7/9表达载体并筛选稳定转染HepG2细胞株,考察其干扰效果,为后续研究set7/9基因的功能及其在肝癌细胞系中的作用提供实验基础。方法寻找靶向序列,设计siRNA片段,构建针对人set7/9基因的shRNA和对照载体,将干扰载体和载体稳定转染肝癌细胞HepG2,Real-time PCR检测细胞中set7/9基因的表达水平;同时利用Western blot方法在蛋白质水平进行检测,确定该基因的干扰效果。结果成功构建载体set7/9-shRNA;Real-time PCR结果显示该基因表达水平明显被抑制(P9h1蛋白表达水平升高1.1倍。结论构建稳定转染株后,可以显著下调set7/9基因的表达,同时影响与其相关的Sirt1和Suv39h1蛋白表达水平,提示对肝癌HepG2细胞活性产生影响。

关键词： set7/9 HepG2细胞 Western blot 甲基转移酶载体构建肝癌

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PLMT家族成员set7/9的非组蛋白甲基化作用

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生命科学 2011年第8期23卷 773-778页

作者：高丽丽余卫平水东南大学医学院病理学与病理生理学系南京210009

set7/9是蛋白赖氨酸甲基化转移酶(protein lysine methyltransferases,PLMTs或PKMTs)家族成员,具有set结构域。现已发现set7/9是一种赖氨酸单甲基化转移酶,除了能使组蛋白H3第四位赖氨酸(lysine4 of histone 3,H3K4)单甲基化外,更重要... 详细信息

set7/9是蛋白赖氨酸甲基化转移酶(protein lysine methyltransferases,PLMTs或PKMTs)家族成员,具有set结构域。现已发现set7/9是一种赖氨酸单甲基化转移酶,除了能使组蛋白H3第四位赖氨酸(lysine4 of histone 3,H3K4)单甲基化外,更重要的能使一些转录因子、肿瘤抑制因子、膜相关受体等非组蛋白单甲基化,其甲基化作用主要与蛋白稳定和转录活化有关。该效应受赖氨酸特异性去甲基酶1(lysine specifcdemethylase,LSD1)的抑制。set7/9与LSD1两者效应的平衡对维持体内活性蛋白质含量、调节基因表达具有重要意义。

关键词： set7/9 赖氨酸甲基化转移酶非组蛋白甲基化作用

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蛋白赖氨酸甲基转移酶set7/9表达对肝癌细胞增殖、凋亡和迁移的影响

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东南大学学报（医学版） 2017年第3期36卷 351-356页

作者：刘宏顾页蔡盈盈余卫平东南大学医学院病理学与病理生理学系江苏南京210009

目的:探讨set7/9表达对肝癌细胞增殖、凋亡和迁移的影响。方法:对SMMC-7721与Bel-7404肝癌细胞株分别转染set7/9表达干扰质粒(shRNA-set7/9)、set7/9表达质粒(p set7/9),采用CCK8法检测转染后24、48、72、96 h的OD值;用流式细胞术检测转... 详细信息

目的:探讨set7/9表达对肝癌细胞增殖、凋亡和迁移的影响。方法:对SMMC-7721与Bel-7404肝癌细胞株分别转染set7/9表达干扰质粒(shRNA-set7/9)、set7/9表达质粒(p set7/9),采用CCK8法检测转染后24、48、72、96 h的OD值;用流式细胞术检测转染48 h的凋亡率;用Transwell实验测定细胞迁移力。结果:与对照组比较,SMMC-7721细胞转染shRNA-set7/9后OD值呈时间依赖性下降,凋亡率增高[(26.8±3.4)%vs(11.4±3.9)%],迁移力明显降低(21.7±7.8 vs 104.8±11.3);而Bel-7404细胞转染pset7/9后OD值呈时间依赖性增加,凋亡率下降[(8.7±3.6)%vs(16.4±3.1)%],迁移力增强(142.5±11.1 vs104.7±10.5)。结论:肝癌细胞中set7/9表达呈现肿瘤促进因子效应,相关机制值得深入研究。

关键词：肝癌细胞 set7/9 细胞增殖凋亡迁移

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山奈酚靶向set7/9甲基转移酶抗肺癌的作用及分子机制

山奈酚靶向SET7/9甲基转移酶抗肺癌的作用及分子机制

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作者：何书贵广州中医药大学

学位级别：硕士

目的:肺癌是当今世界发病率和死亡率均较高的癌症,是最常见的恶性肿瘤,已成为严重危害人类健康和生命的重要疾病之一[1]。近年来尽管肺癌发病率有所下降,但死亡率仍持续上升且5年预后生存率仅17%[2,3]。大多数病人在确诊肺癌时已是晚期... 详细信息

目的:肺癌是当今世界发病率和死亡率均较高的癌症,是最常见的恶性肿瘤,已成为严重危害人类健康和生命的重要疾病之一[1]。近年来尽管肺癌发病率有所下降,但死亡率仍持续上升且5年预后生存率仅17%[2,3]。大多数病人在确诊肺癌时已是晚期,因此早期筛查、早诊断、早发现和早预防成为肺癌预防和治疗的有效措施[4]。组蛋白甲基转移酶(HTMs),在肺癌的发生发展中扮演重要的角色,可招募染色质重塑、组蛋白修饰酶控制基因和蛋白表达以及结构改造[5]。组蛋白甲基转移酶的催化了一些抑癌基因以及促癌基因发生甲基化,促进基因沉默或者过表达,导致癌症的萌芽[6]。因此,有人提出控制甲基化是对抗癌症的前提[71。山奈酚是一种黄酮醇类化合物,存在于多种天然植物和瓜果蔬菜。研究证明山奈酚可以促进正常细胞的再生和发育,使得细胞免受外来侵扰,具有良好的抗氧化、抗炎、抗病毒、抗菌以及抗肿瘤等药理活性[8]。体外研究证明山奈酚可调节包括肺癌在内的多种肿瘤细胞中 P16 和 MGMT(O^6-methylguanine-DNA methyhransferase)等抑癌基因的甲基化,恢复其活性,阻止癌症的进一步恶化[9]。也有研究证明山奈酚可以促进肿瘤细胞凋亡、抑制增殖、炎症和侵袭转移且与甲基化程度相关[10.11]。但是,鲜有报道山奈酚在组蛋白甲基转移酶方面的研究,而这一研究正是控制癌症不可缺少的部分[5]。基于目前研究现状,本文将采用肺癌细胞模型以及小鼠移植瘤模型评价山奈酚通过抑制set7/9表达而对抗肺癌的作用及机制。方法:1.比较分析肺腺癌中set赖氨酸甲基转移酶利用在线数据库(http://***/searchesults/)分析来源于 TCGA数据库中491例肺腺癌病例set和set7/9基因的生存分析。采用Real-time qPCR和Western blot方法考察乌拉坦诱导的FVB小鼠、苯并芘诱导的A/J小鼠、裸鼠肺实体瘤组织以及癌旁组织,人肺癌细胞(A549、NCI-H1299、H1975、H1650、1-I1819)和人正常肺支气管上皮细胞(BEAS-2B)中set家族和set7/9基因和蛋白表达。2.考察山奈酚对肺腺癌细胞set基因和蛋白家族表达水平以 MTT 法考察山奈酚对 A549、NCI-H 1299(0-80μM)和 BEAS-2B(0-50 μM)细胞诱导48 h或5 d的细胞活力的影响。以A549和NCI-H1299作为体外研究模型,经山奈酚(5,10,20 μM)、阳性药 5-aza(5-azacytidine)(2.5 μM)/TSA(Trichostatin A)(500 nM)给药 5 天后,并通过 Real-time qPCR 和 Western blot技术检测set以及set7/9基因和蛋白家族表达水平。3.评价山奈酚对set7/9的靶向作用采用Docking(计算机模拟)、细胞热转移法(CETSA)和共定位的方法,考察set7/9是否为山奈酚的靶点?以Docking 4.2版模拟山奈酚对set7/9亲和性。通过细胞热转移法(CETSA)实验,以山奈酚(100 μM)与A549细胞裂解液体外常温孵育30 min,在44-54℃下加热后进行Western blot分析;再于山奈酚50-800 μM共孵育后于50℃下加热后,检测其蛋白表达情况。共定位分析则用山奈酚诱导细胞6 h后,伴随一抗二抗结合,采用激光共聚焦显微镜进行图像捕获,后进行分析。在A549细胞中,经山奈酚、5-aza/TSA给药5天后,应用Western blot 考察 PP2Ac、p-AKT、p-GSK-3β蛋白表达。在A549细胞中,通过siRNA和过表达方法,采用Lipofectamine TM 2000为转染试剂转染12 h后,继续给予山奈酚孵育48 h后检测其基因和蛋白表达,以及set7/9下游PP2Ac和Cytochrome C的影响。过表达则应用BEAS-2B细胞进行质粒转染pEX-4,后检测其PP2Ac和Cytochrome C的蛋白表达。在A549细胞沉默和BEAS-2B细胞过表达set7/9后,通过EdU实验,考察山奈酚对细胞增殖能力的影响。4.考察山奈酚对线粒体凋亡的影响经山奈酚或者5-aza与细胞体外孵育6h后,应用免疫荧光法考察山奈酚与线粒体的结合情况。继续应用罗丹明123荧光法考察山奈酚对细胞中线粒体膜电位的变化、Cytochrome C和caspase 9蛋白表达。5.山奈酚体内抗肿瘤作用研究及相关机制验证于雌性裸鼠皮下接瘤A549-1uc-C8荧光细胞,待肿瘤长至50-1003 mm后开始给药,给药时间为30天,每周给药5天。给药结束后剥离肿瘤和脏器指数并统计。再通过Real-time qPCR

关键词：山奈酚肺癌 set7/9 甲基转移酶

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抑制SIRT1和set7/9活性增加乙酰化TP53K382介导卵巢癌细胞的凋亡研究

抑制SIRT1和SET7/9活性增加乙酰化TP53K382介导卵巢癌细胞的凋亡...

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作者：李超广西医科大学

学位级别：硕士

背景与目的：卵巢癌顺铂耐药是临床亟待解决的问题,与患者预后密切相关。研究表明人卵巢癌顺铂耐药与抑癌蛋白TP53基因突变及其复杂的表观遗传修饰功能调控相关。TP53翻译后修饰过程对TP53功能活性极其重要,但这些机制目前并不清楚。近... 详细信息

背景与目的：卵巢癌顺铂耐药是临床亟待解决的问题,与患者预后密切相关。研究表明人卵巢癌顺铂耐药与抑癌蛋白TP53基因突变及其复杂的表观遗传修饰功能调控相关。TP53翻译后修饰过程对TP53功能活性极其重要,但这些机制目前并不清楚。近年来发现TP53翻译后修饰过程包括磷酸化、乙酰化、甲基化、泛素化、类泛素化、苏素化及N-乙醯葡萄糖胺等;对乳腺癌、肺癌等实体肿瘤细胞研究表明针对表观遗传修饰靶点而设计的特殊小分子抑制剂能增加乙酰化TP53表达。SIRT1是一种依赖NAD+组蛋白去乙酰化酶(HDAC),属于Sirtuins家族,通过去乙酰作用参与调节细胞分化、代谢、凋亡及DNA损伤后修复等过程。TP53是第一个被发现的SIRT1的非组蛋白作用靶蛋白。SIRT1对TP53(K382)去乙酰化作用可“捆绑”TP53,阻止TP53核输出。TP53要激活其依赖的线粒体凋亡通路,必须被核输出到线粒体外膜,改变线粒体外膜通透性后,TP53与BCL蛋白(BCL2、BCL1)才能相互作用而促进凋亡前体蛋白BAX释放,从而促发TP53依赖的细胞凋亡;同时TP53核输出可激活Caspase-9细胞死亡通路。set7/9是一种组蛋白甲基化转移酶,set7/9可甲基化TP53K272、K369等位点赖氨酸;TP53甲基化后因为其赖氨酸粘性增加,TP53在细胞核内更稳定,其对下游靶基因活化作用降低;研究发现set7/9也能甲基化SIRT1,但并不一定影响SIRT1去乙酰化作用;set7/9对SIRT1的甲基化可引起SIRT1与TP53“捆绑”结构发生解离。因此,通过调节SIRT1和set7/9活性可能有效增加TP53功能,增加肿瘤治疗有效性。针对TP53的表观遗传调控(Epigenetic Modulator)是目前生物学领域研究的热点。本研究同样旨在探讨抑制去乙酰化酶SIRT1和组蛋白甲基化转移酶set7/9的酶活性后乙酰化TP53K382在人卵巢癌顺铂耐药细胞株中的表达及其介导细胞凋亡,进而从表观遗传修饰功能探讨入卵巢癌顺铂耐药与TP53的关系,为解决卵巢癌化疗过程中顺铂耐药寻找新的解决之路。方法：1、在细胞培养基础上,应用EX527抑制SIRT1酶活性,应用SAH、SIN抑制set7/9酶活性。2、MTT法检测顺铂、EX527、SAH和SIN对人卵巢癌细胞顺铂敏感株A2780和耐药株A2780CIS药物的药物敏感性及EX527、SAH和SIN是否具有增加顺铂细胞毒的作用。3、Western Blot检测顺铂引起的DNA损伤后两个细胞株中SIRT1、TP53、乙酰化TP53K382和BAX表达及EX527、SAH和SIN作用后蛋白表达情况;4、流式细胞仪检测A2780和A2780CIS细胞凋亡率。结果：1、A2780CIS较A2780细胞更为耐受顺铂(耐受指数=2.3)。2、EX527、SAH和SIN无明显增加顺铂对A2780和A2780CIS细胞的细胞毒作用。3、抑制SIRT1和set7/9均可增加乙酰化P53K382表达,且具有协同性。4、抑制SIRT1和set7/9可上调A278GCIS细胞顺铂作用24h后P53和乙酰化P53K382的表达。5、抑制SIRT1和set7/9可增加人卵巢癌P53介导的凋亡。结论：1、SIRT1和set7/9都会影响TP53介导的凋亡,尤其是高表达SIRT1的A2780CIS细胞。2、抑制SIRT1和set7/9可增加乙酰化TP53表达及其介导的凋亡。3、SIRT1及其甲基化可作为卵巢癌顺铂耐药治疗的靶点。

关键词：卵巢癌乙酰化甲基化 TP53 SIRT1 set7/9 凋亡耐药

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内质网应激上调set7/9表达机制及其在糖尿病肾病中的作用

内质网应激上调SET7/9表达机制及其在糖尿病肾病中的作用

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作者：陈吉刚第三军医大学

学位级别：硕士

研究背景和目的糖尿病肾病(DN)是糖尿病最严重的微血管并发症之一，是导致终末期肾病(ESRD)的重要原因。由于其发病机制尚未明确，缺乏有效的治疗手段。目前已经公认，糖尿病肾病是肾小球细胞炎症表型激活性疾病。因此揭示炎症激活的... 详细信息

研究背景和目的糖尿病肾病(DN)是糖尿病最严重的微血管并发症之一，是导致终末期肾病(ESRD)的重要原因。由于其发病机制尚未明确，缺乏有效的治疗手段。目前已经公认，糖尿病肾病是肾小球细胞炎症表型激活性疾病。因此揭示炎症激活的启动机制是遏制DN发生发展的重要措施。近年来研究表明，内质网应激(ERS)在糖尿病及糖尿病相关血管并发症发病中发挥重要作用。我们课题组在以前的研究中证实，ERS可通过调控氧化应激和炎症激活途径参与DN发病，应用分子伴侣4苯基丁酸干预内质网应激可降低ERS水平，减轻氧化应激及炎症激活，抑制DN的发展。此外，研究表明作为联系遗传和环境相互作用的枢纽，表观遗传修饰在DN的发病中也发挥重要作用。但内质网应激与表观遗传修饰之间是否存在调控联系目前尚不清楚。本研究拟利用db/db小鼠糖尿病肾病模型，通过甜菜碱调控ERS观察db/db小鼠肾组织ERS及相关转录因子变化规律，以及表观遗传修饰、炎症激活、肾脏病理、生化指标的变化情况。并利用RNAi实验进一步确认ERS调控set7/9表达的具体机制，探讨ERS-set7/9-MCP-1这一通路在DN发病机制中的作用。对象和方法 1.利用DN小鼠模型证实ERS与set7/9表达上调之间的关系 1.1选取4周龄体质量20-26g的C57BL/KsJ背景db/db小鼠作为2型糖尿病肾病动物模型，按随机数字表法分为糖尿病肾病组(DN组)和甜菜碱治疗组(DN+B组)，以同周龄体质量14-16g的db/m小鼠为对照组(NC组)，每组18只，甜菜碱按800mg/kg·d的剂量每日予治疗组小鼠灌胃，DN组以等体积生理盐水代替。 1.2在治疗开始后第4、8、12周末，分别随机从各组抽取6只小鼠。称量各组小鼠体重(BW)，留取24h尿液、血标本，采集双侧肾组织标本，应用过碘酸-希夫(PAS)染色观察db/db小鼠肾脏组织病理改变，并计算肾小球硬化指数(GSI)，半定量评估各组小鼠肾小球硬化程度。 1.3用全自动生化分析仪检测各组小鼠各时相点血糖(BG)、血肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN)含量。采用ELISA方法测定尿蛋白浓度及尿单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)含量，并计算24h尿蛋白排泄率(UPER)=24h总尿量(mL)×尿蛋白浓度(mg/L)。 1.4应用实时荧光定量PCR法检测各时相点各组小鼠肾皮质GRP78、set7/9、MCP-1的mRNA表达。 1.5应用免疫印迹法(Western blot)检测各时相点各组小鼠肾皮质GRP78、ATF6α、set7/9、XBP1s、H3K4me2的蛋白表达。 1.6应用染色质免疫共沉淀技术(CHIP)检测MCP-1启动子区H3K4me1、set7/9的水平及set7/9启动子区XBP1s的水平。 2.利用RNAi方法进一步阐明DN形成过程中内质网应激上调set7/9的机制 2.1选取4周龄体质量20-26g的C57BL/KsJ背景db/db小鼠作为2型糖尿病肾病动物模型，按随机数字表法分为生理盐水组、control siRNA组，set7/9siRNA组和XBP1siRNA组，每组6只。每10天1次给予各组小鼠尾静脉分别注射生理盐水（1ml）、control siRNA，set7/9siRNA和XBP1siRNA（各50ug siRNA试剂稀释在1ml PSB溶液中），2个月后收集各组小鼠肾组织。 2.2应用过碘酸-希夫(PAS)染色，光镜下观察各组小鼠肾脏组织病理改变，并计算肾小球硬化指数(GSI)，半定量评估各组小鼠肾小球硬化程度。 2.3应用免疫印迹法(Western blot)检测各组小鼠肾皮质set7/9、XBP1s的蛋白表达。 2.4应用染色质免疫共沉淀技术(CHIP)检测MCP-1启动子区set7/9募集及H3K4me1水平。 2.5应用实时荧光定量PCR法检测各组小鼠肾皮质set7/9、XBP1s、MCP-1的mRNA水平。结果 1利用DN小鼠模型证实ERS与set7/9表达上调之间的关系 1.1db/db小鼠肾脏病理动态改变及甜菜碱作用各时期NC组小鼠肾组织无明显异常。DN组小鼠第4周末时肾小球病理改变并不明显，第8周末逐渐出现肾小球基底膜增厚、系膜基质积聚等糖尿病肾病改变。12周时表现为肾小球系膜细胞明显增生、系膜基质大量积聚和基底膜增厚等典型的DN病理改变。而DN+B组较DN组肾脏改变明显减轻。第12周末时DN组小鼠的GSI(0.56±0.13)显著高于NC组(0.05±0.02)，DN+B组GSI(0.24±0.08)较DN组显著下降，肾脏病理改变显著减轻(P<0.05)。提示db/db小鼠随着鼠龄增加，DN不断进展，甜菜碱能有效抑制DN发展。 ***小鼠BW、BG、Scr、BUN、UPER、MCP-1的

关键词：糖尿病肾病内质网应激 set7/9 XBP1s

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组蛋白赖氨酸甲基转移酶set7/9对myogenin基因表达的影响

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医学研究杂志 2011年第1期40卷 32-35页

作者：潘炜松代辉张业沈珝琲中国医学科学院基础医学研究所/北京协和医学院基础学院医学分子生物学国家重点实验室北京100005

目的利用本组构建的小鼠组蛋白赖氨酸甲基转移酶set7/9真核表达质粒及RNA干扰(siRNA)质粒,在体外成肌细胞分化模型C2C12细胞中检测set7/9对肌肉分化关键基因myogenin基因表达的影响。方法转染set7/9真核表达质粒pCMV-3tag-6-set7/9至C2... 详细信息

目的利用本组构建的小鼠组蛋白赖氨酸甲基转移酶set7/9真核表达质粒及RNA干扰(siRNA)质粒,在体外成肌细胞分化模型C2C12细胞中检测set7/9对肌肉分化关键基因myogenin基因表达的影响。方法转染set7/9真核表达质粒pCMV-3tag-6-set7/9至C2C12细胞,Western blot技术验证其表达;利用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)技术检测set7/9对myogenin基因mRNA水平的影响;利用双荧光素酶报告系统检测set7/9对myogenin基因启动子活性的影响;转染set7/9的siRNA质粒,利用Real-time PCR技术检测其抑制效果以及对myogenin mRNA水平的影响。结果 set7/9真核表达质粒pCMV-3tag-6-set7/9可在C2C12细胞中有效表达;set7/9可使myogenin mRNA水平升高并能够促进myogenin启动子活性升高;干扰set7/9表达可使myogenin mRNA水平降低。结论组蛋白赖氨酸甲基转移酶set7/9可激活肌肉分化关键基因myogenin的转录。

关键词： set7/9 肌肉分化 RNA干扰 myogenin

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