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岩黄连对慢性肝性脑病大鼠的影响及其作用机制的研究

岩黄连对慢性肝性脑病大鼠的影响及其作用机制的研究

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作者：阮景晟广西医科大学

学位级别：硕士

目的:探讨岩黄连对肝性脑病大鼠的保护和防治作用及其相关的作用机制。方法:1、动物实验:选取（Sprague-Dawley,SD）大鼠30只,180-200g,雄性,随机分为3组,每组10只。分别为对照组（Control）组、模型（HE）组、岩黄连（CSB）组。慢性肝... 详细信息

目的:探讨岩黄连对肝性脑病大鼠的保护和防治作用及其相关的作用机制。方法:1、动物实验:选取（Sprague-Dawley,SD）大鼠30只,180-200g,雄性,随机分为3组,每组10只。分别为对照组（Control）组、模型（HE）组、岩黄连（CSB）组。慢性肝性脑病（HE）大鼠模型（C型）制备:4%（1ml/kg）水合氯醛大鼠腹腔麻醉后,无菌操作开腹结扎大鼠胆总管,并将两结扎之间的胆总管切除,给予胆总管切除术后大鼠连续灌胃浓度10%的乙酸铵（MSDS）每天一次,持续2周。对照组给予同样麻醉后开腹但不进行胆管结扎。造模后岩黄连组给予10ml/kg·d（0.2mg/ml）岩黄连水提物灌胃,除岩黄连组外其余组给予同等量的10ml/kg·d纯净水灌胃,持续4周。于末次灌胃24h后,用SMART3.0动物行为学采集和分析系统对各组大鼠在旷场实验和水迷宫实验中的行为、情绪、HE等级等状态进行采集分析和评分;全自动分析法和酶联免疫吸附法（Elisa）检测肝功血清生化指标（血氨、ALT、AST、ALP、TBA、Alb、TBil）;肝脏和脑组织进行切片HE染色,观察肝脏和大脑海马区的病理改变。2、体外细胞实验:通过体外培养大鼠星形胶质细胞（CTX-TNA）,用5mmol/L氯化铵刺激来制备HE细胞模型。以不同浓度（0.1mg/ml、0.2mg/ml）岩黄连水提物作用于HE CTX-TNA细胞模型组,以等量未处理培养基培养的CTX-TNA细胞为对照组,作用48h后,用光学显微镜观察细胞状态,并采用CCK-8、流式细胞实验检测岩黄连水提物对HE CTX-TNA细胞的增值凋亡的影响;Elisa检测各组细胞中活性成分（MDA、SOD、GSH-PX）。3、采用Real-time PCR、免疫组化、Weatern免疫印迹（WB）检测法检测以0.2mg/ml岩黄连水提物作用于HE大鼠模型和HE CTX-TNA细胞模型中sema3a/nrp-1信号通路的相关蛋白的表达。结果:1、动物实验表明:与对照组比较,模型组大鼠均出现不同程度的神经反射和自主活动的减弱,水迷宫实验中用时增加,旷场实验中行进距离减少,神经评分下降（P＜0.001）;与模型组比较,岩黄连组大鼠神经反射和自主活动明显增强,水迷宫实验中用时减少,旷场实验中行进距离明显增加,神经反射评分下降（P＜0.001）。2、大鼠肝脏和脑组织HE染色结果显示:与对照组比较,模型组大鼠肝脏汇管区及小叶周边可见纤维组织增生和炎性细胞浸,大脑前额叶皮层和海马区大量神经细胞核固缩变形,染色加深,细胞排列紊乱;与模型组比较,岩黄连组肝脏汇管区及小叶周边纤维组织和炎性细胞浸润减少,大脑海马区神经细胞核固缩变性相对减少,排列相对整齐。3、大鼠血清学检测:与对照组比较,模型组大鼠血清中血氨、ALT、AST、ALP、TBA、TBil的浓度均显著增加,Alb显著降低（P＜0.001）;与模型组比较,岩黄连组血氨、ALT、AST、ALP、TBA、TBil的浓度不同程度的降低,Alb增加（P＜0.001）。4、细胞实验表明:以不同浓度（0.1mg/ml、0.2mg/ml）岩黄连水提物干预HE CTX-TNA细胞48h后,与对照组增值率（1.32±0.12）和凋亡率（0.04±0.01）比较,模型组细胞增殖明显降低（0.53±0.14）,凋亡率（0.33±0.07）增明显增高（P＜0.001）;与模型组比较,（0.1mg/ml、0.2mg/ml）岩黄连组CTX-TNA细胞增殖（0.71±0.03）、（0.94±0.04）明显增高,凋亡率（0.21±0.06）、（0.18±0.02）降低（P＜0.001）。5、Elisa检测显示:与对照组MDA、GSH-PX、SOD浓度（1.98±0.02）、（0.052±0.005）、（0.052±0.012）比较,模型组细胞内MDA（5.7±0.32）浓度显著增加,SOD、GSH-PX浓度（0.013±0.002）（0.021±0.004）显著降低（P＜0.001）;与模型组比较,（0.1mg/ml、0.2mg/ml）岩黄连组MDA、浓度（4.12±0.35）,（3.13±0.02）下降,SOD、GSH-PX浓度（0.025±0.005）、（0.033±0.003）,（0.034±0.003）、（0.041±0.005）升高（P＜0.001）。6、Real-time PCR、免疫组化、WB检测结果表明:以0.2mg/ml岩黄连水提物作用于HE大鼠模型和HE CTX-TNA细胞模型中sema3a/nrp-1信号通路中,与对照组比较,模型组sema3a及nrp-1在HE大鼠模型和HE CTX-TNA细胞模型表达量均升高（P＜0.001）;与模型组比较,岩黄连组中sema3a及nrp-1在HE大鼠模型

关键词：岩黄连水提物肝性脑病大鼠星形胶质细胞(CTX-TNA) sema3a/nrp-1

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