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微生物学通报 2010年第9期37卷 1379-1384页

作者：文奇根叶小文黄家权廖伯寿中国农业科学院油料作物研究所农业部油料作物生物学重点开放实验室湖北武汉430062

茄科雷尔氏菌利用自身的分泌系统能向胞外分泌上百种蛋白,其中Ⅱ型和Ⅲ型分泌系统通过不同机制将分泌蛋白靶定到胞外或宿主细胞,是决定茄科雷尔氏菌对宿主产生致病性的主要因素。其中Ⅲ型分泌系统不依赖sec信号转导系统但必须依赖于宿... 详细信息

茄科雷尔氏菌利用自身的分泌系统能向胞外分泌上百种蛋白,其中Ⅱ型和Ⅲ型分泌系统通过不同机制将分泌蛋白靶定到胞外或宿主细胞,是决定茄科雷尔氏菌对宿主产生致病性的主要因素。其中Ⅲ型分泌系统不依赖sec信号转导系统但必须依赖于宿主细胞的识别激活,并在病原菌对宿主细胞的特异性识别和细菌在宿主细胞的生长增殖中发挥功能。到目前为止,已经从茄科雷尔氏菌的GMI1000株系中鉴定出两类在宿主细胞中存在靶标,并由Ⅲ型分泌系统分泌的效应蛋白Pop2和Gala蛋白家族。主要就茄科雷尔氏菌Ⅲ型分泌系统的基本特征以及效应蛋白及其宿主靶标的相互作用进行综述。

关键词：茄科雷尔氏菌效应蛋白致病性 sec途径

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双精氨酸转运(Tat)系统及其在大肠杆菌分泌表达重组蛋白中的应用

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药物生物技术 2012年第5期19卷 443-447页

作者：贾爱娟谭树华中国药科大学分子生物学教研室江苏南京210009

常见的分泌途径(sec途径)是细菌中蛋白分泌跨膜转运的主要途径,而双精氨酸转运(Tat)则是另外一个蛋白分泌跨膜转运系统,该系统的特征是在分泌蛋白的信号肽中含有一个高度保守的双精氨酸基序。与sec途径相比,Tat系统的显著优点是它只分... 详细信息

常见的分泌途径(sec途径)是细菌中蛋白分泌跨膜转运的主要途径,而双精氨酸转运(Tat)则是另外一个蛋白分泌跨膜转运系统,该系统的特征是在分泌蛋白的信号肽中含有一个高度保守的双精氨酸基序。与sec途径相比,Tat系统的显著优点是它只分泌已正确折叠的蛋白,而未正确折叠的蛋白则不能通过该系统分泌,这样就保证了分泌产物在结构上的正确性。因此,研究利用Tat信号肽牵引重组蛋白通过Tat系统进行分泌跨膜转运在重组蛋白的表达方面具有很好的应用前景。

关键词：细菌 sec途径双精氨酸转运(Tat)系统信号肽蛋白质跨膜转运

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α-淀粉酶的异源表达、调控元件优化和分泌瓶颈鉴定

α-淀粉酶的异源表达、调控元件优化和分泌瓶颈鉴定

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作者：陈景奇天津大学

学位级别：硕士

枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)具有强大的蛋白质分泌能力,是十分重要的工业酶制剂生产菌种。大量来源于不同生物的外源基因已经在***中实现了分泌表达,但分泌量低下这一瓶颈仍未得到解决。为了拓展***在异源蛋白分泌生产中的应用,本... 详细信息

枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)具有强大的蛋白质分泌能力,是十分重要的工业酶制剂生产菌种。大量来源于不同生物的外源基因已经在***中实现了分泌表达,但分泌量低下这一瓶颈仍未得到解决。为了拓展***在异源蛋白分泌生产中的应用,本论文从密码子优化、定点突变、启动子和信号肽优化以及sec分泌途径瓶颈鉴定等几个方面入手以期提高异源蛋白分泌效率。两种α-淀粉酶AmyL和AmyS的编码基因amyl和amys分别来自Bacillus licheniformis和Bacillus stearothermophilus,其中amys是经过密码子优化并全基因合成而得。通过构建表达质粒pMA5L和p MA5S实现了两种基因在***中的异源表达。以AmyL为例进行了定向进化研究,通过Leu134→Arg突变得到突变体AmyLM2,将AmyL最适反应p H由6.5降低为6.0,并在一定程度上提高了其热稳定性。启动子是影响基因转录的重要影响因子,选择比较了PHpaII、P43、P和Pamyl等四个较强的启动子来控制amyl M2的转录,结果显示P为最强的启动子。以一种半理性方法筛选比较了6种信号肽SP、SP、SP、SP、SP和SP,结果显示,与目的蛋白AmyLM2匹配最优的信号肽为SP。将以AmyLM2为目的蛋白筛选所得最强启动子P和最优信号肽SP在AmyS上进行了验证。在***中,sec分泌途径是最主要的蛋白分泌途径。通过单独过表达23个sec途经相关基因或基因操纵子,发现单独过表达prsA对α-淀粉酶分泌影响最大,AmyLM2和AmyS的α-淀粉酶活性分别提高了3.2倍和5.5倍。将PrsA在过表达水平和时间上进行优化,进一步提高了AmyLM2和AmyS的分泌量。此外,将prsA与9个筛选出的sec途径相关基因或基因操纵子分别进行了组合过表达,发现prsA与dnaK operon组合过表达对α-淀粉酶分泌促进作用最大,分别将AmyLM2和AmyS的分泌量提高了160%和173%。综合以上结果表明分子伴侣PrsA和Dnak系列蛋白的不足是异源蛋白在***中分泌表达的瓶颈之一。将出发菌株和工程菌株进行了详细的摇瓶发酵特性研究,工程菌株的AmyLM2和AmyS分泌量分别为出发菌株的9.1倍和11.7倍。最后,针对所得工程菌株1A237L和1A237S,在7.5L发酵罐(NBS,USA)中采用分批-补料的策略进行发酵,AmyLM2和AmyS的α-淀粉酶活性在84 h分别达到1352 U/m L和2300 U/mL。

关键词：枯草芽孢杆菌 α-淀粉酶启动子信号肽 sec途径过表达

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基因修饰增加枯草芽孢杆菌脂肪酶的分泌

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作者：白雷雷天津大学

学位级别：硕士

枯草芽孢杆菌(***)表达和分泌的胞外脂肪酶(LipA),是分子量最小的碱性脂肪酶,有重要的应用价值。本文以提高脂肪酶分泌水平为研究目的,考查了宿主菌及胞外蛋白缺失,TatAdCd转位酶过表达对脂肪酶发酵的影响。在*** 168中,通过缺失胞外中... 详细信息

枯草芽孢杆菌(***)表达和分泌的胞外脂肪酶(LipA),是分子量最小的碱性脂肪酶,有重要的应用价值。本文以提高脂肪酶分泌水平为研究目的,考查了宿主菌及胞外蛋白缺失,TatAdCd转位酶过表达对脂肪酶发酵的影响。在*** 168中,通过缺失胞外中性蛋白酶(NprE)和碱性蛋白酶(AprE),构建了*** BNA菌株。用脂肪酶表达质粒pHP13L,分别转化*** 168、BNA和DB104菌株,分别筛选出分泌脂肪酶的168/pHP13L、BNA/pHP13L和DB104/pHP13L菌株。摇瓶发酵显示,*** BNA发酵液中的脂肪酶活性是168菌株的1.5倍,168菌株是DB104菌株的2.5倍。168菌株发酵液中的脂肪酶活性极不稳定,达到最大值后迅速下降。结果表明,***168比DB104更适宜作为脂肪酶发酵的宿主菌;主要胞外蛋白酶的缺失,有利于维持分泌脂肪酶的稳定。在*** BNA和DB104菌株中,分别缺失胞外蛋白YolA、YolB、XynA、YncM和Csn,并进行质粒pHP13L转化,构建BNA和DB104系的衍生菌株BNAY2-5/pHP13L和BDY2-5/pHP13L。摇瓶发酵显示,这些衍生菌株胞外蛋白缺失的数量与其脂肪酶发酵单位,以及发酵液中脂肪酶的稳定性均呈正相关。缺失5个胞外蛋白的BNAY5/pHP13L和BDY5/pHP13L菌株,分别在同系菌株中,脂肪酶发酵单位最高,分别为230和170 U/mL;并且脂肪酶的最大活性可持续到发酵60 h。结果表明,在产脂肪酶的***中,缺失分泌量较大的依赖sec途径分泌的胞外蛋白,能够在一定程度上减少sec途径的分泌压力,有助于提高脂肪酶的分泌水平。分别在*** BNA和BNAY5菌株中,在染色体sacB基因位点,整合过表达tatAD-tatCD操纵子,构建了*** BNAT/pHP13L和BNAY5T/pHP13L菌株。摇瓶发酵显示,菌株BNAT/pHP13L的脂肪酶发酵单位达到290 U/mL,较出发菌提高1.35倍;而对菌株BNAY5T/pHP13L,脂肪酶发酵单位没有明显提高。结果表明,过表达TatAdCd转位酶,能够显著提高脂肪酶的分泌量或分泌速率,但是可能与5个胞外蛋白的缺失是等效的。

关键词：脂肪酶胞外蛋白 sec途径 Tat途径 tatAD-CD操纵子枯草芽孢杆菌

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大豆GmsecA基因克隆及表达特异性研究

大豆GmSecA基因克隆及表达特异性研究

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中国植物生理学会第十次会员代表大会暨全国学术年会

作者：李鹏丽党利洁诸锡莉王宁宁南开大学生命科学学院植物生物学与生态学系

＜正＞叶绿体自身可以编码100多个蛋白,其余大约有90%的叶绿体蛋白则是由核基因编码的。核基因编码的叶绿体蛋白在细胞质中合成后,通过叶绿体被膜转运到叶绿体中。secA是叶绿体蛋白转运sec途径中一个重要组

关键词：大豆 GmsecA基因 sec途径表达分析

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