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seahorse xf原位检测恶性疟原虫能量代谢新方法的建立及其应用

Seahorse XF原位检测恶性疟原虫能量代谢新方法的建立及其应用

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作者：马冀中国中医科学院

学位级别：硕士

作为世界三大传染病之一,疟疾仍是危害人类健康的重大疾病。2019年WHO发布的《世界疟疾报告》中显示,恶性疟原虫和间日疟原虫是世界范围内较为常见的疟原虫,在疟疾高发的非洲地区由恶性疟原虫引起的疟疾发病病例占病例总数的99.7%。可见... 详细信息

作为世界三大传染病之一,疟疾仍是危害人类健康的重大疾病。2019年WHO发布的《世界疟疾报告》中显示,恶性疟原虫和间日疟原虫是世界范围内较为常见的疟原虫,在疟疾高发的非洲地区由恶性疟原虫引起的疟疾发病病例占病例总数的99.7%。可见,合理的解决疟疾问题,仍是人类需要面临的重大挑战。疟原虫是疟疾的病原体,能够寄生于按蚊和脊椎动物中,寄生于人体红细胞内的阶段称作红内期。红内期疟原虫主要以糖酵解作为主要的供能方式,由氧化磷酸化途径的产能较少。红内期疟原虫通过增加自身糖酵解途径相关酶的蛋白表达以及改变红细胞膜的通透性来满足红内期阶段对葡萄糖的大量需求。疟原虫与肿瘤细胞相似,对能量的快速需求使其更偏向于反应过程较短且在胞浆中完成的糖酵解方式,糖酵解途径可以在短时间内提供能量。虽然氧化磷酸酸化途径供能较少,但是疟原虫的线粒体却在整个传播过程中发挥着至关重要的作用。对于目前的国际一线抗疟药物青蒿素类化合物而言,其抗疟机制仍是众说纷纭,但是众多假说中都提到了线粒体的参与作用,更有一种假说认为线粒体激活了青蒿素进而发挥抗疟作用。所以,线粒体作为抗疟药物可能作用的潜在靶点,本文旨在寻找一种能够测量疟原虫能量代谢途径的方法,用于考察红内期疟原虫有氧呼吸和糖酵解的作用。目前,细胞外通量分析已经成为检测细胞中生物能的一种主流方法,能够在不受外界环境干扰和不破坏细胞自身结构的前提下,实时监测细胞的能量代谢。seahorse xf分析仪能够同时对细胞的有氧呼吸和糖酵解进行检测,并将检测得到的氧浓度与pH值转化为相应的OCR和ECAR值。本文所选用的seahorse xfe96分析仪可以一次性测量多达96个样本的能量变化,其高通量的特点克服了传统使用Clark氧电极的局限性,使测量变得更高效,更灵活且便于重复。seahorse xf分析多用于肿瘤细胞、成纤维细胞、神经元细胞和T细胞等细胞的分析,对于红细胞和红内期疟原虫的分析较少,缺乏较为成熟的方法。因此,本文综合现有理论和方法并根据红细胞和疟原虫自身的特点,对多种影响因素进行筛选与确定,最终建立了一种可实时原位检测红内期疟原虫能量代谢的新方法。并利用所建立的方法对现有的国际一线抗疟药物、在研药物以及相关抑制剂化合物作用于疟原虫的能量代谢进行考察,分别评价各类化合物对红内期疟原虫线粒体有氧呼吸和糖酵解的影响,为后续红内期疟原虫的深入研究提供基础数据。1.基于seahorse xf分析仪——实时原位检测红内期恶性疟原虫能量代谢方法的建立体外培养*** 3D7,经多次同步化处理后培养出虫期较一致的滋养体期疟原虫,利用磁珠分选的磁性原理分离富集高纯度的滋养体期疟原虫,流式细胞仪检测富集纯度可达90.55%。富集的滋养体期疟原虫用于seahorsexf分析的上机检测。首先对4种粘附剂进行筛选,初步确定Poly、C1010和Rat-0.12共3种粘附剂进行后续同细胞密度的同步筛选。在粘附剂和细胞密度同步筛选的过程中,分别优化了检测程序和上机培养基成分。检测程序由原来初始的3个Cycle增加至4个Cycle并取消了仪器原有的Mix过程,为了保证检测数值能在仪器的最适检测范围20-160pmol/min,初步将仪器建议的上机检测培养基AM改为与疟原虫生长相关的UB培养基。上机结果显示,细胞密度过高(9-10M)会导致疟原虫自身营养不足,活性降低最后死亡,检测的OCR值小于20pmol/min;低密度下,因疟原虫单位个数较少而不能满足仪器的最适检测范围,OCR值仅为20pmol/min左右,故综合后两次实验结果最终确定疟原虫最适的细胞密度为5M。然后在5M的最适细胞密度下寻找最佳的粘附剂,通过上清细胞个数和OCR值双重指标最终确定Poly作为上机选用的粘附剂,此时OCR值最大可达到78.18 pmol/min。随后采用最佳粘附剂Poly和最适细胞密度5M进行后续指标的筛选。在筛选粘附剂和细胞密度条件时,对上机培养基进行了初步的优化,所以又对上机检测培养基进行了详细的筛选。将包括疟原虫生长培养基在内的4种培养基进行了成分的比较,发现AM与其他3种培养基相比,缺少了部分缓冲成分,不适合疟原虫生长。上机整个过程的pH值比较发现,UB和UBP均能够维持疟原虫上机过程的生长环境,表现为疟原虫的活性状态较好,OCR值也相应较高。上机OCR值比较可知,AM作为上机培养基时整个检测过程的OCR值均在20pmol/min以下,UB和UBP的初始OCR值均为40pmol/min左右,检测过程中的OCR值均有上升趋势,其中UBP作为上机检测培养基时OCR值的上升趋势更大。结合上机前后pH值和OCR值响应的两个因素,最终确定UBP作为疟原虫上机检测的培养基。确定了粘附剂、细胞密度和上机检测培养基等几个条件后,对线粒体压力测试试剂盒

关键词： seahorse xf 疟原虫能量代谢线粒体有氧呼吸糖酵解青蒿素类化合物抗疟药物

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