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耐盐基因senhx1提高拟南芥和小麦的耐盐性研究

耐盐基因SeNHX1提高拟南芥和小麦的耐盐性研究

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作者：耿冰月河南科技学院

学位级别：硕士

senhx1基因是从盐生植物盐角草中（Saliconia europaea L.）克隆得到的一种Na/H逆向转运蛋白基因,对于植物体内Na的转运,细胞p H值和渗透压的调控中起着关键作用。拟南芥作为模式植物被广泛应用于基因功能研究,小麦是全球最重要的粮食... 详细信息

senhx1基因是从盐生植物盐角草中（Saliconia europaea L.）克隆得到的一种Na/H逆向转运蛋白基因,对于植物体内Na的转运,细胞p H值和渗透压的调控中起着关键作用。拟南芥作为模式植物被广泛应用于基因功能研究,小麦是全球最重要的粮食作物之一,由于其基因组多倍性,遗传转化进展十分缓慢,严重制约了小麦功能基因组的研究和育种应用。本研究利用根癌农杆菌介导对野生型拟南芥和小麦百农607进行转耐盐senhx1基因研究,通过分子生物学鉴定获得转基因植株。以NaCl为胁迫因子,对转基因拟南芥和小麦进行盐胁迫处理后,通过表观形态的观测,植株耐盐性相关生理生化指标的测定,探讨senhx1基因的耐盐机制。主要研究结果如下:（1）以花序侵染法,借助根癌农杆菌介导成功将senhx1基因转入拟南芥,通过卡那霉素初步筛选获得转化植株,并对转化植株连续种植筛选,获得T代转senhx1基因拟南芥植株。（2）对T3代纯合拟南芥的总DNA提取并进行PCR鉴定,琼脂糖凝胶电泳结果显示出545 bp左右的目的条带,初步证明senhx1基因已成功导入到拟南芥基因组中。（3）提取T代纯合转senhx1基因拟南芥RNA,经反转录得到cDNA,以cDNA为模板进行PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳检测结果显示出545 bp左右的目的条带,进一步证明了senhx1基因已转入拟南芥中,并在拟南芥中成功表达。（4）在含0 mmol/L、50 mmol/L、100 mmol/L、150 mmol/L、200 mmol/L NaCl的MS培养基中进行转基因拟南芥种子萌发实验,1周后统计拟南芥发芽率。结果如下:0mmol/L的培养基中转基因拟南芥与对照组发芽率均大于90%,NaCl为75 mmol/L的培养基中,转基因组与对照组发芽率均降低,分别为85.51%,81.6%。150 mmol/L时对照组降至54%,而转基因拟南芥发芽率为72%,明显高于对照组。在200 mmol/L中,对照组拟南芥发芽率大幅度降低至20%以下,转基因型发芽率48.28%,远远大于对照组。（5）以NaCl为盐胁迫因子,对转基因组与对照组拟南芥进行盐胁迫后,对两组拟南芥的表观形态观测以及对叶绿素含量的测量结果表明,转基因组生长状况优于对照组,两组叶绿素含量均与NaCl浓度呈负相关,但转senhx1基因叶绿素含量下降趋势低于对照组,这与表观观测的结果一致。（6）NaCl处理后通过对两组拟南芥的电导率、以及与耐盐相关的生理生化指标SOD、POD、APX、CAT、MDA的测定结果表明,转senhx1基因拟南芥抗氧化酶活性均高于对照组,电导率大小及MDA含量低于对照组。（7）利用根癌农杆菌介导以真空辅助的遗传转化方法初步获得转senhx1基因小麦植株。通过设置不同侵染液浓度,不同真空辅助转化时间,优化了小麦遗传转化体系,最佳侵染液OD值为0.5,最佳真空侵染时间为30 s。（8）在NaCl处理下测量转基因组与对照组小麦的叶绿素含量,电导率大小和抗氧化酶SOD、POD的活性,结果显示两组小麦叶绿素含量均下降,转senhx1基因小麦叶绿素含量与电导率大小增加量均低于对照组,SOD、POD活性均高于对照组,与拟南芥组测量结果一致。盐胁迫会引起氧化反应,产生大量的自由基,对植物造成伤害。senhx1基因通过增强植物抗氧化系统的功能,减少自由基的积累,从而减轻盐胁迫对植物造成的伤害。正常生长条件下,转基因组拟南芥和小麦与对照组比较均没有明显差异。NaCl胁迫处理后,在表观形态观测中转senhx1基因拟南芥植株的生长状况明显优于对照组。随着NaCl浓度的增加,转基因组与对照组的差异逐渐显著。转基因组拟南芥SOD、POD、APX、CAT活性高于对照组,在转基因小麦中SOD、POD活性也高于对照组小麦。两组不同植物的实验结果说明转senhx1基因的表达增强植株中抗氧化酶的活性。并且在盐处理下,转基因组拟南芥和小麦的叶绿素含量下降趋势低于对照组,电导率的上升趋势也低于对照组。这些结果表明,senhx1基因的表达增强了植株中抗氧化酶活性,减轻了盐胁迫对植物的伤害,并且能够维持叶绿素含量,减轻盐害对细胞膜的受损程度。

关键词： senhx1 耐盐性拟南芥小麦

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大车前（Plantago major L. "Giant Turkish."）体外优化再生体系的建立及Na～+/H～+逆向转运蛋白基因senhx1和TtNHX1的功能鉴定

大车前（Plantago major L. "Giant Turkish."）体外优化再生体系...

引用

作者：李平中国科学院研究生院（植物研究所）

学位级别：硕士

大车前(Plantago major L. "Giant Turkish.")不仅有很高的药用价值,在生态学研究方面也是重要模式植物。大车前的组织培养工作,目前报道很少。对其组织培养体系的建立,为筛选大车前耐盐突变体和基因转化建立高效的体外再生系统和实验... 详细信息

大车前(Plantago major L. "Giant Turkish.")不仅有很高的药用价值,在生态学研究方面也是重要模式植物。大车前的组织培养工作,目前报道很少。对其组织培养体系的建立,为筛选大车前耐盐突变体和基因转化建立高效的体外再生系统和实验平台体系。通过愈伤组织诱导和直接不定芽再生途径,建立了大车前(Plantago major L. "Giant Turkish.")的快速高效再生系统。叶片外植体在含有1.0 mg/L NAA的MS培养基中培养3周后,形成愈伤组织,愈伤组织在含4.0 mg/L 6-BA的MS培养基中成功再生,得到完整植株。种子外植体在含0.2 mg/L IAA和1.0 mg/L TDZ的MS培养基中培养4周后产生大量的丛生芽,对9株再生植株进行RAPD检测表明,部分植株在DNA水平上发生了变异。植物抵御盐胁迫的一个重要机制是在液泡中积累Na+,从而使细胞质内Na保持在较低水平,并且降低细胞渗透势。Na+运输到液泡是由液泡Na+/H+逆向转运蛋白完成的。本实验室已从盐生植物盐角草(Salicornia europaea)和番杏(Tetragonia tetragonioides)中分别克隆得到senhx1和TtNHX1基因。本文研究了senhx1和TtNHX1基因在酵母突变体里的作用。TtNHX1和senhx1蛋白在缺陷型酵母菌株里的表达能够提高这些菌株对NaCl、LiCl和潮霉素的抗性,提高到与野生型相当的抗性水平。说明TtNHX1和senhx1有着与酵母ScNHX1相似的细胞定位和作用机制,是ScNHX1的功能类似蛋白。

关键词：大车前(Plantago major L.“Giant Turkish.”) 体外培养 TtNHX1 senhx1 酵母互补

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