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山东大学学报（医学版） 2022年第7期60卷 66-73页

作者：袁孟绮霍凤蕾任会萍郭秋爽蓝菁山东大学齐鲁医学院口腔医学院·口腔医院修复科山东省口腔组织再生重点实验室山东省口腔生物材料与组织再生工程实验室山东济南250012

目的探讨sdccag3在高脂环境中通过Wnt信号通路影响骨髓间充质干细胞(BMSCs)成脂成骨分化以及高脂血症大鼠种植体周围骨结合的能力。方法构建高脂血症大鼠模型以及高脂环境培养BMSCs并进行成骨诱导,慢病毒载体过表达/沉默结肠癌抗原3(Sdc... 详细信息

目的探讨sdccag3在高脂环境中通过Wnt信号通路影响骨髓间充质干细胞(BMSCs)成脂成骨分化以及高脂血症大鼠种植体周围骨结合的能力。方法构建高脂血症大鼠模型以及高脂环境培养BMSCs并进行成骨诱导,慢病毒载体过表达/沉默结肠癌抗原3(sdccag3)的表达,采用RT-PCR、Western blotting、Micro-CT以及硬组织切片HE染色、油红O染色、免疫荧光染色等方法检测高脂环境中sdccag3对大鼠骨代谢以及BMSCs分化平衡的影响。结果高脂成骨诱导BMSCs后过表达sdccag3,下调成脂分化指标脂肪酸结合蛋白4(FABP4)、过氧化物酶体增殖剂激活受体γ(PPAR-γ),并上调Wnt信号通路标志基因低密度脂蛋白受体相关蛋白5(LRP5)、LRP6、β-catenin及Wnt5a、Wnt5b,上调成骨分化指标碱性磷酸酶(ALP)、Runt相关的转录因子2(Runx2);在高脂血症大鼠种植体周围骨组织中,过表达sdccag3可上调Wnt信号通路标志基因并抑制周围脂形成,沉默LRP5会下调sdccag3、成骨分化指标,上调成脂分化指标,与沉默sdccag3表达一致。结论高脂血症促进种植体周围脂肪形成并抑制sdccag3表达;过表达sdccag3抑制BMSCs成脂分化并降低高脂血症大鼠种植体周围的成脂,促进成骨,促进Wnt信号通路标志基因表达。

关键词：高脂血症 sdccag3 成脂分化 Wnt通路低密度脂蛋白受体相关蛋白5

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sdccag3促进高脂血症实验大鼠种植体骨结合实验研究

Sdccag3促进高脂血症实验大鼠种植体骨结合实验研究

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作者：任会萍山东大学

学位级别：硕士

实验目的血清学定义的结肠癌抗原3（Serologically defined colon cancer antigen-3,sdccag3）作为一种内体蛋白,在细胞骨架重塑、纤毛发生、蛋白转运、有丝分裂、细胞凋亡等生物学行为中发挥重要作用,但其在种植体骨结合的作用尚不明... 详细信息

实验目的血清学定义的结肠癌抗原3（Serologically defined colon cancer antigen-3,sdccag3）作为一种内体蛋白,在细胞骨架重塑、纤毛发生、蛋白转运、有丝分裂、细胞凋亡等生物学行为中发挥重要作用,但其在种植体骨结合的作用尚不明确。高脂血症,一种以血清中脂质代谢水平升高为特征的代谢性疾病,其升高的血脂水平抑制成骨分化,导致骨改建不良,而成为影响骨结合的危险因素,影响高脂血症缺牙患者种植治疗的成功率和远期疗效。近年来一些研究表明,单纯的控制感染和炎症并不能解决种植术后种植体骨结合失败的问题,种植体周围基因调控网络亦发挥重要作用。围绕以上问题,本课题组前期实验通过对高脂血症大鼠及正常大鼠种植体周围骨组织进行RNA测序分析,发现了与sdccag3明显相关的非编码RNA（noncoding ribonucleic acids,ncRNAs）,即长链非编码 RNA（long non-coding RNA,lncRNA）lncRNA-MSTRG.97162.4、非编码小 RNA（MicroRNA,miRNA）miR-193a-3p。因此,本实验旨在通过构建sdccag3、lncRNA-MSTRG.97162.4、miR-193a-3p过表达/抑制表达慢病毒载体,应用micro-CT及骨小梁相对体积（Percent trabecular area,BV/TV）分析、HE染色及骨-种植体结合率（bone-implant combination ratio,BIC%）分析、实时定量聚合酶链式反应（quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR）、Western blotting等实验技术,从体内实验水平进一步阐明sdccag3及其相关lncRNA-MSTRG.97162.4、miR-193a-3p对高脂血症大鼠种植体骨结合的作用机制,以期为治疗高脂血症引发的骨质疏松、骨结合不良等临床问题提供新方法。实验方法（1）80只4周龄成年雄性Wistar大鼠,其中24只随机均分为高脂组和正常组,分别给予高脂饮食和普通饮食;56只给予高脂饮食。8周后,所有高脂喂养的大鼠内眦静脉取血,检测血脂水平,以确认高脂血症实验大鼠模型成功建立。（2）12只高脂组和12只正常组大鼠于距双侧股骨干骺端远心端5mm处植入长度2.5mm、直径1.5mm的纯钛种植体各一枚,并于术后2周、4周获取种植体周围约1mm的骨组织。（3）分别构建 sdccag3-enhancer、sdccag3-inhibitor、lncRNA-MSTRG.97162.4-enhancer、miR-193a-3p-enhancer、miR-193a-3p-inhibitor 及 LV17-nc、LV16-nc 慢病毒载体。（其中 LV17-nc 为sdccag3-enhancer、1ncRNA-MSTRG.97162.4-enhancer 的阴性对照组;LV16-nc为 sdccag3-inhibitor、miR-193a-3p-enhancer、miR-193a-3p-inhibitor 的阴性对照组。）（4）56 只高脂血症实验大鼠分组随机分为 sdccag3-enhancer组、lncRNA-MSTRG.97162.4-enhancer 组、LV17-nc 组,sdccag3-inhibitor 组、miR-193a-3p-enhancer 组、miR-193a-3p-inhibitor 组、LV16-nc 组,每组各 8只;于种植术前3、0天于种植体植入部位肌肉注射相应慢病毒载体;术后2周获取种植体周围约1mm的骨组织。（5）Micro-CT对所取部分样本进行扫描,并行BV/TV分析及三维重建,观察种植体周围0.5mm新骨形成情况。对扫描后的样本固定包埋,制作硬组织切片并行苏木素-伊红染液染色,观察种植体-骨界面新骨形成及骨小梁排列情况;Image-Pro Plus 软件行 BIC%分析。（6）qRT-PCR 检测 sdccag3、lncRNA-MSTRG.97162.4、miR-193a-3p 及成骨基因Runx2的表达水平;Western blotting检测sdccag3、Runx2蛋白的表达水平。（7）采用GraphPad Prism 6.0软件对数据进行处理,行统计学分析。具体实验流程如下:#12实验结果（1）高脂血症实验大鼠血清中的脂质水平明显高于正常组（P＜0.05）,高脂血症大鼠模型成功建立。（2）与正常组大鼠相比,高脂血症实验大鼠BIC%、BV/TV降低（P＜0.05）,骨小梁排列稀疏,新骨生成减少。（3）与 LV17-nc 组相比,sdccag3-enhancer

关键词： sdccag3 高脂血症骨结合 lncRNA-MSTRG.97162.4 miR-193a-3p

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Sdccag3及相关非编码RNA对高脂血症大鼠种植体骨整合的影响机制研...

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作者：刘飞山东大学

学位级别：硕士

实验目的伴有高脂血症的大鼠植入种植体后,种植体周围的骨整合率明显下降,骨组织的丧失率显著增加,同时伴随骨形成数量明显减少,但是其中的具体调节机制不详。通过测序分析,预测 sdccag3-miR-193a-3p-lncMSTRG.97162.4/lnc MSTRG.78883... 详细信息

实验目的伴有高脂血症的大鼠植入种植体后,种植体周围的骨整合率明显下降,骨组织的丧失率显著增加,同时伴随骨形成数量明显减少,但是其中的具体调节机制不详。通过测序分析,预测 sdccag3-miR-193a-3p-lncMSTRG.97162.4/lnc MSTRG.78883.18这两条与成骨相关的调控网络可能参与成骨分化的调控,但是还需后续实验来进一步证明。在本实验研究中,我们将验证sdccag3及其相关非编码RNAs对成骨分化的影响及作用机制、验证筛选出的两条ceRNA网络是否成立,并计划进一步深入研究该网络调控伴有高脂血症的大鼠在成骨分化中的具体机制。实验方法(1)构建并检测高脂血症大鼠模型,检测动物模型中sdccag3及其共表达网络中非编码RNA、成骨相关基因的表达;之后在高脂血症大鼠动物模型中抑制miR-193a-3p的表达,检测对高脂血症大鼠种植体周围骨整合的影响及sdccag3、lnc MSTRG.97162.4、lnc MSTRG.78883.18及成骨相关基因的表达变化。(2)在分子生物学与形态学水平协同检测高脂、普通成骨诱导大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨方向的分化,Runx2、ALP、sdccag3、miR-193a-3p、lnc MSTRG.97162.4及lnc MSTRG.78883.18的表达变化。过表达或抑制表达miR-193a-3p、沉默lnc MSTRG.97162.4后,结合多种形态学水平观察手段检测BMSCs成骨方向分化能力,并检测BMSCs成骨分化过程中 sdccag3、lnc MSTRG.97162.4、lnc MSTRG.78883.18、ALP及Runx2基因表达量的变化。(3)通过生物信息学软件预测lnc MSTRG.97162.4和sdccag3蛋白的靶结合区域,根据筛选结果设计相应探针,并使用RNApull down、Western Blot实验对结合区域进行筛选验证。实验结果(1)高脂组大鼠血清中的脂质水平要明显高于普通组大鼠(P3)用慢病毒载体减低miR-193a-3p表达,种植体周围1mm内的骨组织内lnc MSTRG.78883.18表达无统计学上的差异(P>0.05)miR-193a-3p表达水平明显降低,而Runx2、ALP、sdccag3、lnc MSTRG.97162.4表达量皆明显升高(Psdccag3、lnc MSTRG.97162.4表达量减少、miR-193a-3p表达量升高,lnc MSTRG.78883.18的表达无明显差异,提示sdccag3、miR-193a-3p和lnc MSTRG.97162.4表达量会受到高脂环境的影响。(5)miR-193a-3p mimics转染BMSCs后,细胞成骨分化受到抑制,sdccag3、lnc MSTRG.97162.4表达下调明显,lnc MSTRG.78883.18的表达无明显差异;而miR-193a-3p inhibitor转染 BMSCs 后,细胞成骨分化增强,sdccag3、lnc MSTRG.97162.4表达上调明显,lnc MSTRG.78883.18的表达无显著差异。说明miR-193a-3p的表达与sdccag3、lnc MSTRG.97162.4的表达呈负相关。(6)沉默lnc MSTRG.97162.4后,细胞向成骨方向分化受到抑制,sdccag3表达下降,miR-193a-3p表达上调,而lnc MSTRG.78883.18表达无显著差异。(7)通过RNA pull-down、Western Blot结果综合分析,证实lnc MSTRG.97162.4在361-389序列区可以特异性结合sdccag3蛋白,从翻译后水平影响sdccag3蛋白的表达。结论(1)高脂血症可以抑制大鼠纯钛种植体周围的骨形成。(2)MiR-193a-3p可以抑制伴高脂血症的大鼠种植体周围的骨整合。(3)lnc MSTRG.97162.4、sdccag3可以促进高脂血症大鼠骨整合。(4)lnc MSTRG.97162.4-miR-193a-3p-sdccag3共表达网络成立,该网络在伴有高脂血症大鼠种植体周围的骨整合中发挥调控的作用。(5)ln

关键词：高脂血症种植体骨整合 ceRNAs sdccag3 lnc MSTRG.97162.4

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