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Accumulation of amino acids deriving from pyruvate in <i>Escherichia coli</i>W3110 during fed-batch cultivation in a two-compartment scale-down bioreactor

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Advances in Bioscience and Biotechnology 2011年第5期2卷 336-339页

作者： Jaakko Soini Kaisa Ukkonen Peter Neubauer 不详

Bioprocess scale-down simulators are used to investigate the phenomena occurring in industrial scale cultivations. The aim is to simulate the large-scale conditions, characterized by long mixing times introducing local gradients into the bioreactor, in laboratory scale bioreactor. We have expanded the current physiological knowledge about the consequences of such cultivation conditions from well-known mixed-acid fermentation to amino acid metabolism. Several interesting deviations were observed for amino acids derived from pyruvate when a STR-PFR scale-down simulator and a regular STR fed-batch cultivation were compared. In this article we show that the cultivation of Escherichia coli K-12 substrain W3110 in a scale-down two-compartment bioreactor has consequences on the free amino acid pools. Repeated occurrence of high glucose zones affects the biosynthesis of amino acids derived from pyruvate. This is interesting since the pyruvate based amino acids are precursors of the branched chain amino acid pathway, which is further disturbed by an unbalanced regulation caused by a frameshift mutation in the ilvG gene of E. coli K-12 strains. As a consequence the formation of non-typical amino acid norvaline was detected in the two compartment bioreactor cultivation.

关键词： E.coli Fermentation scale-down Amino Acid

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基于生物反应器内非均匀环境的流体动力学研究

基于生物反应器内非均匀环境的流体动力学研究

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作者：万勋华东理工大学

学位级别：硕士

现代生物技术应用需要大量低成本、高质量的产品。而产品的获得必须以实验室规模的生物过程准确放大到工业级规模为前提。但准确放大往往由于放大效应而难以实现,其中一个主要的表现就是反应器内环境的非均匀分布。因此本文的主要研究... 详细信息

现代生物技术应用需要大量低成本、高质量的产品。而产品的获得必须以实验室规模的生物过程准确放大到工业级规模为前提。但准确放大往往由于放大效应而难以实现,其中一个主要的表现就是反应器内环境的非均匀分布。因此本文的主要研究方向就是基于反应器内非均匀环境的流体动力学研究。为了消除反应器内的非均匀环境,本文采取了两种研究方式。在200L冷模反应器中,通过将计算流体力学（Computational Fluid Dynamics, CFD）模拟与实际测定相结合,优化得到了八种能够消除反应器内环境梯度,功率消耗较低、气液分散特性较好的气液两相搅拌系统。本文还采用了scale-down方法,通过构建scale-down反应器来模拟工业级反应器内的非均匀环境。实验中通过测定scale-down系统中的混合时间及停留时间分布等流体动力学参数,对系统的流体动力学特性有了初步了解。混合实验结果表明,混合时间受循环流量和PFR形式的影响较大。增大循环流量、PFR部分体积或者采用较小的管径均有利于保持PFR中平推流特性。在数据处理中,通过引入虚拟体积（Vvrit）本文对所得混合时间数据进行拟合,对混合时间特性进行了深入的分析。停留时间分布在验证了系统内存在死区或者返混情况的同时,表明PFR内的流体动力学特性受循环流量和管径的影响较大。但由于PFR体积与系统体积相比较小,所以在停留时间分布测定中表现出PFR部分差异对系统流体动力学特性影响较小的特点。在实验测定的基础上,本文对scale-down内的流场及流体动力参数进行了CFD模拟验证。模拟结果表明实验中所得数据及结论真实有效,为后期的发酵试验提供了坚实的理论基础。

关键词：流场非均匀环境搅拌系统优化 scale-down 计算流体力学

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深孔板高通量细胞筛选技术的建立及在普鲁兰酶定向改造中的应用研究

深孔板高通量细胞筛选技术的建立及在普鲁兰酶定向改造中的应用研...

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作者：聂简琪江南大学

学位级别：硕士

普鲁兰酶(pullulanase)通过水解α-1,6糖苷键从而将支链淀粉的分支结构切除获得直链淀粉,大大提高淀粉的利用率,在食品工业中的应用前景广阔。本研究从当前新兴的高通量筛选技术角度出发,对深孔板(Microtiter Plate,MTP)的基础参数进行... 详细信息

普鲁兰酶(pullulanase)通过水解α-1,6糖苷键从而将支链淀粉的分支结构切除获得直链淀粉,大大提高淀粉的利用率,在食品工业中的应用前景广阔。本研究从当前新兴的高通量筛选技术角度出发,对深孔板(Microtiter Plate,MTP)的基础参数进行了研究并建立了基于MTP的高通量培养技术以及高通量筛选技术。利用该高通量筛选技术对鲁兰酶文库快速高效筛选并获得了一株突变菌株。本研究的主要结论如下:1、从耐高温、隔绝杂菌、透气性、防止水分挥发等方面研究了PP、PTFE以及e PTFE三种材质透气膜的性能,综合考虑,PTFE以及e PTFE材质的防水透气膜更加适用于“三明治”盖子。对MTP的氧传递系数kLa、微生物培养的可行性、平行性进行了研究,发现24孔MTP与48孔MTP传氧性能好,可达到摇瓶规模,大肠杆菌在MTP中的生长状态要优于摇瓶。研究者需根据微生物对氧气的需求以及实验要求选择合适的MTP及培养体积。96孔板由于氧传递性能差,不适宜进行好氧微生物的培养。2、在大肠杆菌中实现了普鲁兰酶基因(Gen Bank Accession No:AX203843)的异源表达,并在摇瓶规模对发酵条件进行了初步探索。优化得到的培养条件为:采用TB/SB培养基作为发酵培养基,接种终OD595为0.025,37?C 230 r·min-1条件下进行发酵,发酵5.5 h后将温度降低至20?C并开始诱导,诱导剂IPTG终浓度0.1 mmol·L-1同时添加终浓度为0.16 mol·L-1甘氨酸和0.1 mol·L-1氯化钠。诱导20 h后上清中酶活为5.1 U·m L-1。3、将基于摇瓶的发酵参数成功的scale-down至MTP水平,建立了基于MTP的高通量培养技术。将常规的普鲁兰酶酶活测定方法移植于96孔MTP中,建立了普鲁兰酶酶活高通量检测方法,并与通量培养技术偶联建立了普鲁兰酶高通量筛选方法。4、利用易错PCR技术对普鲁兰酶基因进行扩增,扩增产物重组于表达载体p ET-28a(+)-pel B中,并导入*** BL21(DE3)感受态细胞构建文库,利用该高通量筛选方法实现了突变体文库的快速高效筛选并获得了一株突变菌株4A4,其分泌量提高了46.5%。该方法不仅适用于淀粉酶、纤维素酶等酶类的高通量筛选,同时为菌株文库的筛选以及蛋白质的定向进化提供了一种新思路。5、利用His-tag Protein Purification磁珠方法对普鲁兰酶进行纯化,并分析了纯化后的普鲁兰酶酶学性质。分析结果表明,定向进化前后的普鲁兰酶最适反应温度为60?C,最适反应p H为5.0,与野生型普鲁兰酶一致。本研究结果为普鲁兰酶的异源表达提供了理论基础,同时建立的普鲁兰酶高通量筛选方法为突变文库的快速筛选提供了指导,也为普鲁兰酶分泌提供了基础数据。

关键词：普鲁兰酶深孔细胞培养板高通量筛选 scale-down 突变文库

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