检索结果-南通市图书馆

作者：孙嘉遥江苏大学

学位级别：硕士

目的:小RNA sbfr是本课题组通过Solexa高通量测序技术首次在伤寒沙门菌中发现的一个非编码RNA,相关分子特性分析结果显示,sbfr可能是一反式编码RNA。本论文旨在初步探索sbfr在伤寒沙门菌中发挥的调节作用和机制,为后续研究sbfr靶基因及... 详细信息

目的:小RNA sbfr是本课题组通过Solexa高通量测序技术首次在伤寒沙门菌中发现的一个非编码RNA,相关分子特性分析结果显示,sbfr可能是一反式编码RNA。本论文旨在初步探索sbfr在伤寒沙门菌中发挥的调节作用和机制,为后续研究sbfr靶基因及作用机制奠定基础。方法:1.伤寒沙门菌转录组分析:将sbfr缺陷株(Δsbfr+p BAD)和sbfr回补株(Δsbfr+p BAD-sbfr)培养至对数期(OD600≈0.4),加入L-阿拉伯糖诱导后提取细菌总RNA,加入荧光素进行逆转录,标记后的c DNA与全基因组芯片杂交,扫描并进行数据分析,比较sbfr缺陷株和回补株基因表达谱差异。选择部分差异表达基因进行q RT-PCR,验证基因芯片结果。2.q RT-PCR分析基因表达:分别提取各菌株总RNA并逆转录为c DNA,进行q RT-PCR实验,检测基因的m RNA水平。3.细菌在不同温度下的生长曲线测定:分别在37°C和42°C培养sbfr缺陷株和回补株,每隔1h检测OD600值,以OD600数值作纵坐标,以时间作横坐标,绘制sbfr缺陷株和回补株的生长曲线,比较sbfr对细菌在两种温度下生长情况的影响。***片段分部回补株构建:分别构建连有sbfr前69nt和后69nt片段的重组载体,所用质粒为p BAD/Myc-His A,并将重组载体电转入Δsbfr,制备前69nt和后69nt sbfr片段回补株。5.细菌动力实验:将空载体株(WT+p BAD)、sbfr缺陷株、sbfr回补株及sbfr片段分部回补株分别培养至对数期,用接种针蘸取菌液点种于LB半固体动力板,置于37°C孵箱过夜,测量细菌圈直径,分析sbfr对细菌动力的影响。***-blot检测Flj B表达水平:将空载体株、sbfr缺陷株和sbfr回补株培养至对数期,收集全菌蛋白,用兔抗Flj B抗血清进行Western-blot实验,检测各菌株Flj B表达水平。*** La细胞侵袭实验:将空载体株、sbfr缺陷株和sbfr回补株培养至对数期,与He La细胞共孵育90min,弃去培养液。一半细胞孔中加入Triton裂解细胞,涂板培养,计数菌落数为粘附水平;一半细胞孔中加入庆大霉素培养90min后,加入Triton裂解细胞,涂板培养,计数菌落数为侵袭水平。8.生物膜形成实验:在TSB培养基中分别培养空载体株、sbfr缺陷株、sbfr回补株及sbfr片段分部回补株至对数期,转种至96孔板,30°C静置4天,洗去浮游细菌并用结晶紫对生物膜染色,30%冰醋酸洗脱后595nm比色测定。结果:1.基因芯片分析结果显示,sbfr缺陷株与回补株之间共99个基因表达水平存在差异;q RT-PCR结果与基因芯片分析数据相比,基因变化趋势一致。2.生长曲线测定结果表明,在37°C条件下sbfr缺陷株与回补株的生长情况一致,而在42°C条件下回补株的生长明显慢于缺陷株。3.成功构建sbfr前69nt片段和后69nt片段的回补株(Δsbfr+p BAD-F69,Δsbfr+p BAD-L69)。4.动力实验结果表明,与空载体株相比,sbfr缺陷株动力下降,回补株动力恢复;两部分sbfr片段回补株动力均恢复到空载体株水平,且与sbfr全长回补株动力水平一致。5.与空载体株相比,sbfr缺陷株Flj B表达水平下降,回补株Flj B表达水平恢复。6.与空载体株相比,sbfr缺陷株对He La细胞的侵袭能力下降,回补株的侵袭能力恢复。7.与空载体株相比,sbfr缺陷株的生物膜形成能力下降,回补株的形成能力恢复。两部分sbfr片段回补株生物膜形成能力均部分恢复,与空载体株水平一致,但比sbfr全长回补株弱。***缺陷株hsl S、hsl T、htp G、fli A、flj B、sop E等基因的转录水平低于sbfr回补株;flh D的转录水平高于sbfr回补株;prg J、fim A、csg A、yih P、rfa D、bcs A、wca A、bap A等基因的转录水平与sbfr回补株的差异无统计学意义。结论:sRNA sbfr参与伤寒沙门菌热应激条件下生长、动力、侵袭、生物膜形成等方面的调节,抑制热应激条件下细菌生长,促进细菌动力、侵袭和生物膜形成能力。sbfr前69nt和后69nt回补株均可独立完成全长sbfr对细菌动力的促进作用,但在形成生物膜能力方面两种部分回补株分别发挥全长sbfr的部分调控作用。

关键词：伤寒沙门菌小RNA sbfr 生长动力侵袭生物膜形成

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小RNA sbfr增强伤寒沙门菌动力和侵袭力

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江苏大学学报（医学版） 2018年第1期28卷 47-50页

作者：孙嘉遥陆仁飞赵昕黄新祥江苏大学医学院江苏镇江212013

目的:探究小RNA sbfr对伤寒沙门菌动力和侵袭力的影响及其潜在机制。方法:用前期构建的sbfr缺陷株(△sbfr+pBAD/Myc-HisA)、sbfr回补株(△sbfr+pBAD/Myc-HisA-sbfr)和空载体株(WT+pBAD/Myc-HisA)进行细菌动力实验和HeLa细胞侵袭实验,观察sbfr对伤寒沙门菌的动力和对HeLa细胞侵袭力的影响。通过基因芯片分析sbfr缺陷株与回补株全基因组表达的差异,并进一步用qRT-PCR分析sbfr对2个鞭毛和2个侵袭相关基因的调控作用。结果:与空载体株、sbfr回补株比较,sbfr缺陷株动力和侵袭力均明显下降(Psbfr通过促进鞭毛和侵袭相关基因的表达,增强伤寒沙门菌的动力和侵袭力。

关键词：伤寒沙门菌小RNA sbfr 侵袭力

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