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基于sacb负筛选标记的Targetron质粒分析系统构建

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中国病原生物学杂志 2022年第9期17卷 1010-1014页

作者：崔古贞花登雄鲍江舰张馨月洪伟吴道艳向松谷俊莹陈峥宏贵州医科大学基础医学院微生物学教研室贵州贵阳550025 贵州省病原生物学特色重点实验室贵州医科大学医学检验学院省部共建地方病与少数民族性疾病重点实验室贵州医科大学附属医院

目的构建基于sacb负筛选标记的Targetron质粒分析系统。方法构建sacb毒蛋白诱导表达受体质粒pACYC-sacb(携带p15A复制子),分析sacb毒蛋白对大肠埃希菌的毒性。设计sacb基因打靶位点,构建脱水四环素诱导的Targetron供体质粒pSY11-sacb(携... 详细信息

目的构建基于sacb负筛选标记的Targetron质粒分析系统。方法构建sacb毒蛋白诱导表达受体质粒pACYC-sacb(携带p15A复制子),分析sacb毒蛋白对大肠埃希菌的毒性。设计sacb基因打靶位点,构建脱水四环素诱导的Targetron供体质粒pSY11-sacb(携带colE1复制子和sacb405a打靶位点)。双质粒共转化大肠埃希菌BL21(DE3),脱水四环素诱导Targetron表达并对sacb基因进行打靶。涂布含有5%蔗糖和0.1 mmol/L IPTG的选择培养基,筛选sacb基因失活的阳性菌落,利用菌落PCR进一步验证Ⅱ型内含子在靶位点的插入情况。结果sacb基因表达的大肠埃希菌不能在含有5%蔗糖的平板中生长;双质粒共转化后,脱水四环素诱导Targetron表达能够插入到sacb405a靶位点;sacb基因失活后,大肠埃希菌能够在含有5%蔗糖的平板上生长,菌落PCR验证内含子插入到DNA靶位点。结论建立了基于sacb负筛选标记的Targetron质粒分析系统,为Ⅱ型内含子功能鉴定、迁移规律分析等奠定了基础。

关键词： Targetron sacb Ⅱ型内含子打靶平台

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转sacb和KatE基因棉花抗旱性的研究

转SacB和KatE基因棉花抗旱性的研究

作者：王海霞石河子大学

学位级别：硕士

通过花粉管通道法，以导入大肠杆菌过氧化氢酶基因KatE(融合拟南芥定位叶绿体的转运肽STP)和枯草芽孢杆菌果聚糖合酶基因sacb(融合甘薯定位液泡的转运肽SP)棉花T3代为供试材料，经卡那霉素检测和PCR鉴定，筛选确定阳性的转基因植株。在... 详细信息

通过花粉管通道法，以导入大肠杆菌过氧化氢酶基因KatE(融合拟南芥定位叶绿体的转运肽STP)和枯草芽孢杆菌果聚糖合酶基因sacb(融合甘薯定位液泡的转运肽SP)棉花T3代为供试材料，经卡那霉素检测和PCR鉴定，筛选确定阳性的转基因植株。在田间，当转基因和对照棉花植株分别长至苗期、蕾期和花期三个关键生育期时，通过剪断膜下滴灌带进行持续水分胁迫处理，然后对水分胁迫后棉花的生理生化指标的进行测定，并在棉株吐絮后对农艺性状进行调查，初步分析转基因棉花的在田间的抗旱性。实验结果如下： (1)棉花滴水出苗后，对转基因和对照棉花进行苗期到吐絮期的持续干旱胁迫处理，当干旱胁迫至苗期、蕾期和花期时，分别测定各生育期转基因和对照棉花叶片相应的生理生化指标。结果表明，干旱胁迫至苗期，对照和转基因棉花在表型上没有明显的差别，其叶片相对含水量也没有显著差异，但转KatE棉花叶绿素含量极显著高于对照。随着干旱胁迫时间的延长，转基因棉花在干旱胁迫至蕾期和花期的叶片相对含水量、叶绿素含量、脯氨酸含量、SOD活性、Fv/Fm值、净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)及蒸腾速率(Tr)均不同程度的高于对照棉花，分别达到差异显著或极显著水平;对细胞膜离子渗漏及丙二醛含量测定结果表明，对照棉花明显高于转基因棉花，说明对照棉花在干旱胁迫条件下其生物膜损伤程度较大。转sacb棉花在干旱胁迫下保持了相对较高的可溶性糖含量，可能是由于果聚糖增加的缘故，有利于增加细胞的渗透调节功能，从而增加转基因棉花的抗旱性;转KatE棉花在干旱下保持了相对较高的CAT活性及叶绿素含量，可能是由于CAT及时有效的清除了叶绿体中积累的H2O2，以减轻干旱胁迫对棉花的伤害，从而增加转基因棉花的耐旱性。 (2)待棉花长至棉田约50%棉株开始现蕾时，剪断膜下滴灌带进行蕾期到吐絮期的持续干旱胁迫处理。蕾期和花期的同时水分胁迫使得这两个生育期的生理生化指标变化趋势与苗期断水基本一致。转基因棉花较高的叶片相对含水量、叶绿素含量及净光合速率等都说明了转基因棉花有较强的抗旱性。 (3)待棉田棉株开始现花时，剪断膜下滴灌带进行棉花花期到吐絮期持续干旱胁迫处理。花期干旱胁胁迫后转基因棉花叶片保持了相对较多的水分、叶绿素含量，较高的Pn、Gs、Ci及Tr，说明转基因棉花能产生更多的光合产物，及时输送营养物质至花蕾上，减少了落花落蕾。 (4)本试验，正常生长条件下，棉花整个生育期共滴水9次，滴水总量为15.12m3，转基因和对照棉花籽棉产量(十株)在64448g之间，无明显差异，其株高、果枝数、铃数及直径也没有明显的差别。苗期、蕾期和花期分别持续水分胁迫至吐絮期，其滴水总量分别为0、1.68和8.4m3，转基因棉花的株高、果枝数和铃数均明显高于对照棉花。苗期全生育期的干旱胁迫，严重影响了棉花的正常生长及其产量，其对照和转sacb、转KatE棉花籽棉产量分别为257.33、279.67和275.67g，转基因棉花的籽棉产量显著高于对照植株。蕾期持续水分胁迫至吐絮期，滴水1次，对照和转sacb、转KatE棉花籽棉产量分别为325.67、347.00和343.00g，转基因棉花籽棉产量显著高于对照。花期持续水分胁迫至吐絮期，共滴水5次，滴水总量比正常灌溉少6.72m3，对照和转sacb、转KatE棉花籽棉产量分别为457.00、497.67和496.33g，转基因棉花极显著高于对照植株。综上所述，干旱胁迫下，枯草芽孢杆菌sacb基因和大肠杆菌KatE基因在棉花中的过表达确实有效的提高了转基因棉花的抗旱性。

关键词：转基因棉花耐旱性 sacb KatE

同源重组法构建多功能农药降解基因工程菌研究

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生物工程学报 2005年第6期21卷 884-891页

作者：蒋建东顾立锋孙纪全代先祝文阳李顺鹏南京农业大学生命科学学院

构建遗传稳定的多功能农药降解基因工程菌可以为农药污染的生物修复提供良好的菌种资源,然而,构建遗传稳定且不带入外源抗性的基因工程菌是一个难点。通过以受体菌的16SrDNA为同源重组指导序列、sacb基因为双交换正筛选标记构建同源重... 详细信息

构建遗传稳定的多功能农药降解基因工程菌可以为农药污染的生物修复提供良好的菌种资源,然而,构建遗传稳定且不带入外源抗性的基因工程菌是一个难点。通过以受体菌的16SrDNA为同源重组指导序列、sacb基因为双交换正筛选标记构建同源重组载体,二亲结合的方法将甲基对硫磷水解酶基因(mpd)整合到呋喃丹降解菌***1染色体的16SrDNA位点,分别成功构建了含1个和2个mpd基因插入到rDNA位点且不带入外源抗性的基因工程菌株CDSmpd和CDS2mpd。同源重组单交换的效率为3.7×10-7～6.8×10-7。通过PCR和Southern杂交的方法验证了同源重组事件。基因工程菌遗传稳定,能同时降解甲基对硫磷和呋喃丹。甲基对硫磷水解酶(MPH)的比活在各生长时期均高于原始出发菌株,比活最高达6.22muμg。

关键词：同源重组 rDNA sacb 基因工程菌农药降解生物修复

布鲁氏菌分子标记、毒力缺失疫苗株△S19-2的构建

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中国兽医学报 2007年第5期27卷 690-694,699页

作者：闫广谋王兴龙任林柱刘锴高建勇王学理张辉李晓燕吉林大学畜牧兽医学院吉林长春130062 军事医学科学院军事兽医研究所吉林长春130062 内蒙古民族大学动物科技学院内蒙古通辽028000

通过构建自杀质粒,用定向同源重组的方法,把改造的萤火虫萤光素酶报告基因Luc NF+替换布鲁氏菌S19疫苗株Bp26基因部分片段,构建出布鲁氏菌Bp26基因缺失突变株△S19-1。在此基础上,用同样的方法,敲除△S19-1上的毒力基因Bmp18,构建成△S1... 详细信息

通过构建自杀质粒,用定向同源重组的方法,把改造的萤火虫萤光素酶报告基因Luc NF+替换布鲁氏菌S19疫苗株Bp26基因部分片段,构建出布鲁氏菌Bp26基因缺失突变株△S19-1。在此基础上,用同样的方法,敲除△S19-1上的毒力基因Bmp18,构建成△S19-2。用PCR与萤光素酶报告基因在布鲁氏菌中表达的方法进行验证,结果表明Bp26基因与Bmp18基因改造成功,△S19-2具有Bp26基因分子标记、Bmp18毒力基因缺失的特点。

关键词：布鲁氏菌 Bp26 分子标记 Bmp18 毒力缺失同源重组自杀质粒 LucNF+ sacb

中慢生华癸根瘤菌nodD-突变株的筛选及其对紫云英的促生作用

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土壤 2013年第3期45卷 529-532页

作者：杜寒春高轶静郑会明钟增涛朱军南京农业大学生命科学学院南京210095 广西区分析测试研究中心南宁530022

通过二亲接合的方式,将含有sacb基因和nodD基因部分片段的质粒与中慢生华癸根瘤菌(Mesorhizobium huakuii)93(Mh93)菌株进行同源重组,在含10%蔗糖的TY平板上成功地筛选到了nodD基因突变株Mh93-27。利用温室盆栽试验研究了紫云英单作及... 详细信息

通过二亲接合的方式,将含有sacb基因和nodD基因部分片段的质粒与中慢生华癸根瘤菌(Mesorhizobium huakuii)93(Mh93)菌株进行同源重组,在含10%蔗糖的TY平板上成功地筛选到了nodD基因突变株Mh93-27。利用温室盆栽试验研究了紫云英单作及紫云英-小麦间作体系Mh93-27对紫云英的促生作用,结果表明,接种Mh93-27后,紫云英的地上部生物量和全氮含量以及根部生长得到了不同程度的提高,但只有在小麦孕穗期和收获期时,根瘤菌才表现出显著的促生作用。

关键词：中慢生华癸根瘤菌 sacb nodD 紫云英促生氮素

少根根霉脂肪酶基因在枯草芽孢杆菌中的诱导表达

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生物技术通报 2010年第1期26卷 123-127页

作者：张欢王凤寰田平芳谭天伟李文进北京化工大学生命科学与技术学院北京市生物加工过程重点实验室北京100029

利用PCR技术从少根根霉基因组中扩增出脂肪酶成熟肽基因ral,并从枯草芽孢杆菌基因组中扩增出sacb基因的启动子-信号序列(sacb);通过搭桥PCR将sacb序列与ral基因融合,并将该基因表达盒连接到枯草杆菌分泌表达载体pGJ103中构建了脂肪酶基... 详细信息

利用PCR技术从少根根霉基因组中扩增出脂肪酶成熟肽基因ral,并从枯草芽孢杆菌基因组中扩增出sacb基因的启动子-信号序列(sacb);通过搭桥PCR将sacb序列与ral基因融合,并将该基因表达盒连接到枯草杆菌分泌表达载体pGJ103中构建了脂肪酶基因的诱导表达载体pGJ103-sacb-ral。将重组载体转化至枯草芽孢杆菌后,少根根霉脂肪酶成熟肽基因在sacb启动子-信号序列的调控和蔗糖的诱导下获得表达,产物分泌至胞外。

关键词：少根根霉脂肪酶成熟肽枯草芽孢杆菌 sacb 诱导表达

谷氨酸棒杆菌4-羟基异亮氨酸合成的CRISPR-Cpf1辅助编辑和代谢改造

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谷氨酸棒杆菌4-羟基异亮氨酸合成的CRISPR-Cpf1辅助编辑和代谢改造

作者：陈睿江南大学

学位级别：硕士

谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)是白色生物技术的产业支柱。为了提高其基因组遗传改造的效率,本论文建立了CRISPR-Cpf1辅助的基因编辑系统。4-羟基异亮氨酸(4-hydroxyisoleucine,4-HIL)是一种极具药用价值的氨基酸衍生物,课... 详细信息

谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)是白色生物技术的产业支柱。为了提高其基因组遗传改造的效率,本论文建立了CRISPR-Cpf1辅助的基因编辑系统。4-羟基异亮氨酸(4-hydroxyisoleucine,4-HIL)是一种极具药用价值的氨基酸衍生物,课题组前期在L-异亮氨酸(L-isoleucine,Ile)生产菌株中表达外源的异亮氨酸双加氧酶(isoleucine dioxygenase,IDO)实现了4-HIL的从头合成。本论文分析了敲除ddh和/或lysE后对4-HIL生产相关基因转录水平的影响,并根据转录组数据分析结果,使用新建立的基因编辑系统对4-HIL合成代谢路径进行改造。主要研究内容和结果如下:(1)为了提高编辑效率,基于CRISPR-Cpf1系统构建了能够杀死sacb系统中假阳性菌的pCS质粒,并测试其致死效能。pCS质粒对基因组上携带kan盒的***的致死率高达98.6%。建立了CRISPR-Cpf1辅助的基因编辑系统,并通过替换odh A启动子这一实例与传统的sacb编辑方法进行对比,最终将二轮交换菌株的筛选效率提高到95.0%以上,并得到菌株SC00。(2)为了降低L-赖氨酸(L-lysine,Lys)的积累,对Lys的合成进行代谢改造。我们对ddh和/或lysE敲除菌进行转录组分析,发现ddh的敲除增强了Ile的合成和Lys的琥珀酰化酶分支合成途径,导致ddh单敲除菌SL09的Lys积累不变而4-HIL产量增加;而lysE的敲除虽然也增强了Lys的合成,但Lys的输出被阻断,并且琥珀酰辅酶A过量消耗,使α-酮戊二酸(α-ketoglutarate,α-KG)供应不足,最终导致4-HIL和Lys产量都下降。在菌株SL09的dapD基因上游插入不同终止子来弱化Lys合成,结果显示通过终止子的弱化未能有效降低Lys的积累。使用启动子工程弱化lysE和gdh的表达,并在敲除cg2564的同时整合ido,然后在突变菌中转入携带PD5-ido的pIL-I质粒。lysE和gdh弱化菌株的Lys产量分别下降了30.3%、23.8%;4-HIL的产量分别降低了23.6%、7.9%。敲除cg2564未能减少Lys的积累,反而使4-HIL产量降低了26%。(3)为了获得ido稳定表达的4-HIL生产菌株,将ido整合在ldh A-pyk2位点和IScgl位点。首先对ido进行了Thr176Cys的突变得到ido,并用Ile诱导型启动子PN调控其表达,获得了携带PD5-ido表达组合的SC-I菌株,其4-HIL产量为140.9 mmol·L。接着,将PD5或P控制的ido整合在菌株SC00的ldh A-pyk2位点,整合PD5-ido的SC01菌株4-HIL产量最高,为14.8 mmol·L,且还剩余170.1 mmol·LIle。通过自杀质粒p BS介导的同源重组及不断提高的卡那霉素筛选压力将PD5-ido整合在具有多个拷贝的IScgl位点,最终的多拷贝整合菌株SCM12积累了43.7 mmol·L的4-HIL,是SC01产量的3倍。

关键词：谷氨酸棒杆菌基因编辑 sacb CRISPR-Cpf1 4-羟基异亮氨酸 L-赖氨酸

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果聚糖转移酶基因的克隆及功能分析

果聚糖转移酶基因的克隆及功能分析

作者：杨萍石河子大学

学位级别：硕士

果聚糖是高等植物的一种储藏性碳水化合物,定位于植物细胞的液泡中,其解聚释放可降低组织水分冰点的游离果糖,起到液泡渗透缓冲剂和低温防护剂的作用,可以增强植物的抗旱性和抗寒性。本研究克隆了枯草芽孢杆菌（Bacillus subti... 详细信息

果聚糖是高等植物的一种储藏性碳水化合物,定位于植物细胞的液泡中,其解聚释放可降低组织水分冰点的游离果糖,起到液泡渗透缓冲剂和低温防护剂的作用,可以增强植物的抗旱性和抗寒性。本研究克隆了枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）果聚糖合酶的sacb基因,序列分析与Ebskamp公布的果聚糖合酶基因氨基酸序列同源性为100%,以PBI121为载体,构建植物表达载体pBI-sacb,使sacb基因置于CaMV35s启动子调控下。用农杆菌介导的叶盘法转化烟草,获得转基因植株。转基因烟草试管苗长势良好,移栽室外,随着烟草的不断长大,叶片出现明显的黄斑及叶坏死现象。推测在细胞质表达的sacb基因产物,干扰了植物正常的生理功能,造成果聚糖的有害积累。鉴于植物原本在液泡合成和积累果聚糖,本研究将sacb基因与甘薯sporamin基因定位于液泡的引导肽序列融合,构建植物表达载体pBI-sp-sacb,使sacb基因的表达产物定向运输到液泡中。通过遗传转化,得到正常生长的转基因烟草植株。利用Trizol试剂盒提取洋葱RNA,通过RT-PCR的方法,获得洋葱SST基因的CDNA序列。测序结果与GenBank公布的洋葱SST基因氨基酸同源性为99%。利用组成型植物表达载体pBI121,构建植物表达载体pBI-SST。将pBI-SST通过农杆菌介导的方法转化烟草,对转化植株进行分子鉴定和果聚糖转移酶活性的测定。结果表明:转基因烟草葡萄糖的含量明显高于非转基因烟草,说明克隆的果聚糖转移酶的基因已经成功的整合到烟草基因组中,同时在转基因烟草中能正确表达。用PEG6000模拟干旱,胁迫转基因烟草叶片,测定细胞膜的透性。表明:转基因烟草相对电导率明显低于非转基因烟草,本研究只是初步结果,获得的转基因烟草能够增强植物对水分胁迫能力,显示了潜在的应用价值。另外,洋葱SST基因的功能分析还未见报道。因此,本研究为下一步对SST基因的功能分析打下了基础。

关键词：果聚糖转移酶 sacb SST 原核表达植物表达载体的构建转化烟草抗旱实验

鸭疫里默氏杆菌基因无痕缺失方法的构建及应用

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鸭疫里默氏杆菌基因无痕缺失方法的构建及应用

作者：田琇四川农业大学

学位级别：硕士

鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)为黄杆菌科的一种革兰氏阴性菌。虽然现已有多种基因编辑技术用于鸭疫里默氏杆菌毒力因子的鉴定,但仍不能满足现实所需。本研究成功构建了以rpsL及sacb为反向筛选标记的鸭疫里默氏杆菌基因... 详细信息

鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)为黄杆菌科的一种革兰氏阴性菌。虽然现已有多种基因编辑技术用于鸭疫里默氏杆菌毒力因子的鉴定,但仍不能满足现实所需。本研究成功构建了以rpsL及sacb为反向筛选标记的鸭疫里默氏杆菌基因缺失方法,并用此方法对相关基因功能进行了鉴定。主要结果如下:1.以rpsL为反向筛选标记的鸭疫里默氏杆菌ATCC11845s株基因缺失方法的建立将链霉素敏感的ATCC11845菌株培养于含有链霉素的培养基上,筛选出链霉素耐药的突变株-ATCC11845s。野生型的rpsL基因克隆至穿梭质粒pLMF02并转入ATCC11845s中,发现表达野生型rpsL基因的ATCC11845s菌株对链霉素敏感,证明rpsL作为ATCC11845s菌株基因编辑的反向筛选标记。随后构建表达rpsL基因的自杀载体pORS和质粒pBAD24-ermR-rpsL,在此基础上,建立了自杀载体介导的基因缺失法和自然转化介导的基因缺失法两种基因编辑方法。成功敲除鸭疫里默氏杆菌ATCC11845s RA0C＿1534基因,并对其进行了部分功能鉴定。2.以sacb为反向筛选标记的鸭疫里默氏杆菌基因缺失方法的建立将蔗糖致死基因sacb克隆至穿梭质粒pLMF02并转入鸭疫里默氏杆菌CH-1株中。表达sacb的菌株在含有蔗糖的培养基中生长受限,表明sacb可以作为鸭疫里默氏杆菌基因编辑的反向筛选基因。随后构建表达sacb基因的自杀质粒pOBS和质粒pBAD24-cfx-sacb。在此基础上建立自杀载体pOBS介导的基因缺失法和自然转化介导的基因缺失法两种基因编辑方法,并以该方法成功构建鸭疫里默氏杆菌CH-1 dps基因缺失株。3.鸭疫里默氏杆菌CH-1株dps基因功能的研究缺失dps后,CH-1在生长平台期对HO更敏感。同时Dps的抗氧化应激能力依赖于胞内铁离子水平,仅在铁离子丰富时发挥作用。凝胶迁移试验结果证实Dps通过结合DNA来保护细菌DNA免受氧化损伤。此外,在细菌对数生长期和平台生长期dps的转录均受HO调控并由OxyR介导。等量RA CH-1和RA CH-1Δdps经注射感染雏鸭,分别在感染后24、48、60 h检测多脏器组织的载菌量,发现仅在感染后60 h时缺失株定殖能力显著低于野生株,表明Dps参与鸭疫里默氏杆菌在宿主体内的定殖。

关键词：鸭疫里默氏杆菌无痕缺失 rpsL sacb Dps