检索结果-南通市图书馆

作者：赵宝磊河南农业大学

学位级别：硕士

猪圆环病毒2型(Porcine Circovirus 2,PCV2)能够引起断奶仔猪多系统衰竭综和症、猪皮炎肾病综合征、猪先天性震颤、猪呼吸道病综合征等多种传染性疾病。近年来,PCV2在国内和国外迅速传播,随着PCV2在各地广泛的传播并间歇式的爆发,PCV2... 详细信息

猪圆环病毒2型(Porcine Circovirus 2,PCV2)能够引起断奶仔猪多系统衰竭综和症、猪皮炎肾病综合征、猪先天性震颤、猪呼吸道病综合征等多种传染性疾病。近年来,PCV2在国内和国外迅速传播,随着PCV2在各地广泛的传播并间歇式的爆发,PCV2引起的传染病给畜牧养殖业带来了很大的损害。因此,PCV2的诊断和预防也成为各国学者的研究重点。为了筛选培育PCV2优良毒株,本研究对来自河南省不同地区猪场的11份疑似断奶仔猪多系统衰竭综和症的病料进行研磨处理,通过pcr检测将检测结果为阳性的病料研磨液接种PK-15细胞进行病毒的筛选,通过IPMA进一步确定病毒的增殖情况,将检测结果为阳性的PCV2全基因组进行克隆、测序,结果成功分离一株毒力较强的PCV2b。本研究成果为PCV2病毒株的筛选和全病毒灭活疫苗的制作及选择提供依据。为了建立一种快速、特异、精确的PCV2检测方法,本试验根据PCV2的核苷酸序列设计特异性引物,以阳性标准品为模板,建立了一种sybrgreen荧光定量pcr检测猪圆环病毒2型的诊断方法。结果表明该方法的灵敏度高,达到3.0×10拷贝/mL。从溶解曲线分析其引物的特异性好,无引物二聚体,没有交叉反应,可重复性好,适合猪圆环病毒2型临床样品的检测。基于PCV2结构蛋白(Capsid)能在体外自组装成病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs)的特性,我们采用原核表达系统的方法对重组的Cap蛋白进行了可溶性表达,通过对表达条件的优化,获得了Cap-His的最佳表达条件。通过Ni-NAT亲和层析纯化重组蛋白获得纯度较高的重组蛋白,为新型PCV2 VLPs亚单位疫苗的研制奠定了基础。

关键词：圆环病毒2型分离 sybrgreen荧光定量pcr Cap蛋白 Ni亲和层析

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Trizol RNA提取法在雪貂组织的流感病毒H3N2定量pcr检测中优于RNeasy mini kit(Qiagen)柱子法

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中国比较医学杂志 2012年第2期22卷 22-27页

作者：占玲俊鲍琳琳李枫棣吕琦许黎黎秦川中国医学科学院医学实验动物研究所卫生部人类疾病比较医学重点实验室国家中医药管理局人类疾病动物模型三级实验室北京100021

目的比较RNeasy mini kit(Qiagen)柱子法和Trizol法提取RNA在雪貂肺和肠组织H3N2 sybrgreen pcr定量中的去干扰作用,从而找到适合该定量体系的RNA提取方法。方法比较Trizol法,RNeasy minikit柱子法,改良RNeasy mini kit柱子法1和改良RNe... 详细信息

目的比较RNeasy mini kit(Qiagen)柱子法和Trizol法提取RNA在雪貂肺和肠组织H3N2 sybrgreen pcr定量中的去干扰作用,从而找到适合该定量体系的RNA提取方法。方法比较Trizol法,RNeasy minikit柱子法,改良RNeasy mini kit柱子法1和改良RNeasy mini kit柱子法2提取肺肠组织RNA的质量,RNA逆转录成cDNA后,利用SYBR Green pcr方法检测样品中H3N2的载量,比较产物的特异性,综合评价RNA提取方法。结果 4种方法提取的肺和肠组织的RNA质量不相同,紫外分光光度仪测得RNeasy mini kit柱子法提取的RNA的A260/280低于1.8,其余3种方法的A 260/280在1.8～2.1之间,A 260/230只有Trizol法能达到2.0左右,其余3种方法均远低于2.0。电泳可见Trizol法提取的RNA有3条带:28 s、18 s和5 s,而RNeasy mini kit柱子法的RNA除了有28 s、18 s外,还有基因组DNA,改良RNeasy mini kit柱子法1和2提取的RNA只有28 s和18 s带。RNA逆转录后进行荧光定量pcr,从溶解曲线看,不论是鼻甲刮取物还是肺肠组织的样品模板,4种方法获得的样品与标准品均为单一峰溶解曲线峰,并且波峰位置重叠。而鼻甲刮取物定量的产物跑琼脂糖凝胶电泳均为单一的特异性条带,而肺肠组织的产物电泳发现:Trizol法获得的模板定量产物与标准品一致,为单一的特异性条带,而其它3种方法获得的模板则均有非特异性条带。结论鼻甲刮取物的病毒定量选用RNeasy mini kit柱子法提取定量结果与Trizol法一样可靠,说明对于简单样品该体系及引物非常适用,结果可信。对于组织样品肺和肠,Trizol法获得的样品定量结果比其它3种方法可靠。

关键词：雪貂 H3N2 RNA提取 sybrgreen荧光定量pcr

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