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甘薯卷叶病毒LAMP快速检测技术的建立及应用

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农业生物技术学报 2019年第6期27卷 1133-1140页

作者：李华伟刘中华张鸿许泳清李国良林赵淼许国春邱永祥纪荣昌罗文彬汤浩邱思鑫福建省农业科学院作物研究所农业部南方薯类科学观测实验站

甘薯卷叶病毒(Sweet potato leaf curl virus, SPLCV)是甘薯(Ipomoea batatas)生产上重要的病毒病之一,建立SPLCV快速检测方法,对该病的诊断及技术防控至关重要。本研究以甘薯卷叶病毒基因组的外壳蛋白基因(coat protein, cp)为靶序列,... 详细信息

甘薯卷叶病毒(Sweet potato leaf curl virus, SPLCV)是甘薯(Ipomoea batatas)生产上重要的病毒病之一,建立SPLCV快速检测方法,对该病的诊断及技术防控至关重要。本研究以甘薯卷叶病毒基因组的外壳蛋白基因(coat protein, cp)为靶序列,设计了一组环介导恒温核酸扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)特异性引物,以sybr greenⅰ作检测指示剂,通过优化反应条件,建立了一种甘薯卷叶病毒的LAMP可视化快速检测方法,该方法在65℃的恒温条件下反应1 h完成检测。特异性检测结果表明,只有感染SPLCV的样品在指示剂的作用下呈现绿色,且扩增产物用2.0%琼脂糖凝胶电泳出现梯形条带,而与感染其他甘薯DNA病毒、番茄黄花曲叶病毒(Tomato yellow mosaic leaf curl virus, TYLCV)、烟草曲叶病毒(Tobacco leaf curl virus, TLCV) 3种DNA病毒均无交叉反应,表明该方法具有较高的特异性;灵敏度检测结果表明,该方法的最低检测限为1 pg/μL基因组DNA,是普通PCR的10倍,说明该方法灵敏度较高。因此本研究建立的甘薯卷叶病毒环介导等温扩增技术具有扩增快速、特异性高、简便、不需要特殊仪器,肉眼可视化观察结果,适合田间甘薯卷叶病毒样品及基层部门的快速检测。

关键词：甘薯甘薯卷叶病毒(SPLCV) 环介导等温扩增技术(LAMP) sybr greenⅰ

绵羊GDF9基因G1突变可视化检测方法的建立

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河南农业科学 2020年第8期49卷 136-142页

作者：刘莉姚瑞徐越仁李慧向张梦丹胡圣伟石河子大学生命科学学院新疆石河子832003

为了建立快速可视化检测绵羊生长分化因子9基因(Growth differentiation factor 9,GDF9)G1突变的方法,针对绵羊GDF9基因G1突变设计扩增阻滞突变系统(Amplification refractory mutation system,ARMS)特异性引物,并在其下游引物3′端的第2—4位碱基处设计额外的错配以筛选特异性最佳的引物对,将改良的ARMS与核酸染料sybr greenⅰ结合,可视化检测GDF9基因G1突变。结果显示,改良的ARMS特异性引物能够区分突变型和野生型,通过整合改良的ARMS与sybr greenⅰ可视化检测G1突变,发现已知突变型样本显示亮绿色,而已知野生型样本显示橙黄色,两者颜色变化明显。采用建立的可视化检测绵羊GDF9基因G1突变的方法检测25个小尾寒羊样本,结果表明,该方法能够准确区分绵羊GDF9基因G1突变的野生型和突变型,其检测结果与测序结果相符,准确度高达100%。可见,建立的可视化检测方法可用于检测绵羊GDF9基因G1突变。

关键词：绵羊 GDF9基因 G1突变可视化检测 ARMS sybr greenⅰ

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绵羊BMP15基因B2突变可视化检测技术的建立

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中国畜牧兽医 2021年第3期48卷 810-817页

作者：胡瑞瑞刘莉郭涛李雅心王小奎胡圣伟石河子大学生命科学学院石河子832000

骨形态发生蛋白15(bone morphogenetic protein 15,BMP15)基因突变对绵羊排卵率、产仔数以及繁殖力有很大影响,本研究旨在建立快速可视化检测BMP15基因B2突变的技术。将改良的扩增阻滞突变系统(amplification refractory mutation syste... 详细信息

骨形态发生蛋白15(bone morphogenetic protein 15,BMP15)基因突变对绵羊排卵率、产仔数以及繁殖力有很大影响,本研究旨在建立快速可视化检测BMP15基因B2突变的技术。将改良的扩增阻滞突变系统(amplification refractory mutation system,ARMS)与核酸染料sybr greenⅰ结合,针对BMP15基因B2突变设计ARMS特异性引物,使引物下游3′端的最后一个碱基为A,并在下游引物3′端的第3位碱基处设计额外的错配,以提高引物的特异性;经ARMS PCR扩增后,向产物中加入sybr greenⅰ,通过肉眼观察PCR管内的颜色变化来检测BMP15基因的B2突变。经测序发现所采集的样本均为野生型,因此,利用重叠延伸PCR构建BMP15基因B2突变型模板,测序结果显示BMP15基因B2突变型模板构建成功。ARMS PCR结果显示,ARMS特异性引物能够只扩增突变型模板,而不会扩增野生型模板,且扩增效果良好。ARMS PCR扩增后加入sybr greenⅰ发现已知野生型模板与阴性对照一致,呈sybr greenⅰ原始颜色橙黄色,而已知突变型模板呈亮绿色,且色差明显,肉眼可辨。用建立的可视化检测BMP15基因B2突变的技术检测50个小尾寒羊基因组DNA(随机向其中20个样本中加入构建的BMP15基因B2突变型模板),将可视化检测的突变型样本编号与混合样本时记录的编号对比,结果表明该技术能够准确检测绵羊BMP15基因的B2突变,且准确率高达100%。将构建的BMP15基因B2突变型的模板进行梯度稀释,对本试验可视化检测体系的灵敏度进行检测,发现ARMS可视化检测技术的灵敏度达到0.006 ng/μL。因此,本研究建立的技术能够可视化地检测绵羊BMP15基因B2突变,且准确率高,有望为高繁殖力绵羊的选育提供技术支持。

关键词：绵羊 BMP15基因 B2突变可视化检测 ARMS sybr greenⅰ

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Real-time PCR技术用于大菱鲆红体病虹彩病毒的组织敏感性检测及病毒流行情况调查

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农业生物技术学报 2008年第5期16卷 752-758页

作者：吴成龙史成银黄倢孔晓瑜中国水产科学研究院黄海水产研究所农业部海洋渔业资源可持续利用重点开放实验室中国海洋大学水产学院教育部海水养殖重点实验室

大菱鲆红体病虹彩病毒(Turbot reddish body iridovirus,TRBIV)可引起大菱鲆病毒性红体病(viral reddish body syn-drome,VRBS)并导致养殖大菱鲆(Scophthal musmaximus)大量死亡。研究利用TRBIV主要衣壳蛋白基因序列设计的1对引物,结合内嵌式核酸染料sybr greenⅰ,建立了TRBIV特异的Real-timePCR检测方法。以10倍梯度稀释的含有TRBIV目的扩增片段的质粒作为标准,进行Real-time PCR反应以确定检测灵敏度,制备标准曲线。结果表明,该对引物具有较高的灵敏度和较强的特异性,能够检测相当于102数量级的TRBIV基因组拷贝,而不与健康大菱鲆组织DNA、淋巴囊肿病毒DNA发生交叉反应。应用建立的Real-time PCR检测方法,对TRBIV的组织敏感性检测和病毒流行情况调查。结果发现,大菱鲆的脾脏、肾脏、脑、鳃、心脏、肝脏、消化道、血液等组织中均可检测到TRBIV的存在,其中脾和肾是TRBIV的最主要的靶器官,每毫克组织的病毒含量分别高达5.23×106和2.18×106个。分子流行病学调查结果显示,山东半岛的多个大菱鲆养殖场中均存在TRBIV的感染和流行,感染鱼每毫克脾组织的病毒含量在1.27×102～2.33×106之间。研究建立了TRBIV Real-time PCR检测方法,灵敏度高,特异性好,可以进行定量分析,TRBIV的快速检测具有应用前景。

关键词：大菱鲆红体病虹彩病毒实时定量PCR sybr greenⅰ 定量检测敏感组织

实时荧光PCR检测临床真菌方法的建立及其临床应用

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实时荧光PCR检测临床真菌方法的建立及其临床应用

作者：张海平苏州大学

学位级别：硕士

目的:建立临床病原真菌的实时荧光PCR检测方法,评价其检测临床标本真菌感染的应用价值。方法:酚-异硫酸氰胍法提取5例临床培养阳性病原真菌的DNA,利用与真菌核糖体的18SrDNA互补的一对通用引物,优化实验条件,建立sybr greenⅰ实时... 详细信息

目的:建立临床病原真菌的实时荧光PCR检测方法,评价其检测临床标本真菌感染的应用价值。方法:酚-异硫酸氰胍法提取5例临床培养阳性病原真菌的DNA,利用与真菌核糖体的18SrDNA互补的一对通用引物,优化实验条件,建立sybr greenⅰ实时荧光PCR检测病原真菌的方法,应用建立的提取真菌DNA和实时荧光PCR方法检测了37例临床标本,通过对比传统鉴定方法,评价其检出真菌感染的有效性。结果:通过酚-异硫酸氰胍法提取的病原真菌DNA在纯度和质量上都符合PCR的实验要求,且整个提取过程经优化后在1小时内完成;建立的实时荧光PCR方法扩增曲线形态良好,无非特异性扩增,标准曲线相关系数达到1.0,检测灵敏度达到20pg DNA,5例临床培养阳性真菌菌株均能被检出,且念珠菌和丝状真菌具有不同的Tm值,据此可以初步鉴别。37例临床标本直接镜检共有9例阳性,均为角膜标本,普通培养法共培养到12例阳性,包括镜检阳性的9例角膜标本,其余3例为深部真菌病患者组织,实时荧光PCR法检测阳性12例,与培养法检测结果完全一致,无一例假阳性。结论:采用的酚-异硫酸氰胍法提取病原真菌DNA简便快捷,成本低廉,效果良好,适合临床实验室常规使用。建立的实时荧光PCR方法能特异、灵敏的检测临床病原真菌,为临床真菌感染的诊断提供了一种快速、准确的方法。

关键词：酚-异硫酸氰胍法 sybr greenⅰ 实时荧光PCR 真菌

实时荧光环介导等温扩增技术快速检测变形杆菌

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实时荧光环介导等温扩增技术快速检测变形杆菌

作者：马桂芬河北农业大学

学位级别：硕士

变形杆菌是一种食源性条件致病菌,吃剩下的食物、食品沙拉和一些豆类制品,还有动物的内脏及肉、蛋类等一系列的动物性食品都很容易被变形杆菌污染,从而导致食物中毒。感染变形杆菌可以导致急性胃肠炎或者组胺中毒,致使身体的抵抗力变弱... 详细信息

变形杆菌是一种食源性条件致病菌,吃剩下的食物、食品沙拉和一些豆类制品,还有动物的内脏及肉、蛋类等一系列的动物性食品都很容易被变形杆菌污染,从而导致食物中毒。感染变形杆菌可以导致急性胃肠炎或者组胺中毒,致使身体的抵抗力变弱,身体的某些部位极易被感染和病变,如:败血症,呼吸道感染,尿路感染,此外还能引起脑膜炎,腹膜炎,类风湿关节炎等疾病。目前检测变形杆菌的方法有很多,有的方法操作过于复杂,检测过程耗时很长,无法实现食品中变形杆菌快速检测。还有些方法所需要的检测仪器相对比较昂贵,在一些中小企业难以推广。因此研究变形杆菌高效、灵敏,方便快捷的新型检测法极为重要。变形杆菌属现有5个种:普通变形杆菌、奇异变形杆菌、产黏变形杆菌、潘氏变形杆菌和豪氏变形杆菌,在变形杆菌食物中毒中最为常见的感染是由奇异变形杆菌引起的,普通变形杆菌次之,本文主要对普通变形杆菌和奇异变形杆菌进行研宄。2000年,日本荣研化学株式会Notomi等人研发出一种新型的能够在体外进行恒温扩增核酸片段的技术环介导等温扩增技术(Loop-mediated Isothermal Amplification,简称LAMP),这一技术的特点就是根据鞋1基因序列的6个位置区域,设计出4种具有特异性的引物,其中包含着外引物F3和B3及内引物FIP和BIP?然后在DNA聚合酶(5对DMA polymerase)催化作用下等温(65°C左右)持续数十分钟,就能够完成核酸的扩增。近年来出现了实时荧光监测仪?ESE Quant Tube Scanner)’它是可以对模板DNA进行等温扩增的装置。实时焚光LAMP(Real-time Fluorescence Loop-Mediated Isothermal Amplification Technology.Real Amp)技术,就是将实时突光监测仪与电脑相连,再向LAMP反应体系中加入荧光染料?sybr green I),sybr green I会和双链DNA发生结合,使荧光强度大大增强。当反应开始进行,DNA不断发生扩增,反应体系中的荧光信号也随之发生变化,通过电脑软件对整个LAMP反应进行实时监测,扩增曲线就会被显示出来,扩增曲线开始出峰的吋间越早、峰值越高,说明实时荧光LAMP反应的扩增效率也相对越高。将实时荧光监测仪与电脑相连,可实时监控并直观判定检测结果。本研究对Gen Bank中己公布的变形杆菌Mp D基因(普通变形杆菌AY134488?奇异变形杆菌AX109601)序列进行同源性对比分析,针对靶序列6个位点,运用LAMP引物设计软件(V3)进行在线引物设计。设计的4条引物包括:2条外引物(F3和B3)?2条内引物(FIP和BIP)。利用实时荧光监测仪对模板DNA进行等温扩增,通过与电脑进行相连,实时监测并直观判定检测结果。优化反应条件,对该检测方法的特异性、灵敏度等方面进行研究,将该检测方法与普通环介导等温扩增技术?LAMP)检测方法的灵敏度进行比较,并确定该方法检测变形杆菌人工污染猪肉的检出限。Real Amp产物使用限制性内切酶进行酶切,通过观察酶切片段大小来验证实时Real Amp反应的正确性。经实时荧光监测仪反复优化确定反应体系和程序。反应体系:2.5 mmol/L High Pure d NTPs 5μL,10×Thermo PolTM Reaction Buffer 3μL,50 m M Mg SO4 0.5μL,10μM F3和B3各1μL,10μM FIP和BIP各2.5μL,5 M甜菜碱0μL,8000 U/ml Bst DNA聚合酶大片段1.5μL,1.5μL sybr greenⅰ(1:500稀释),模板DNA 3μL,剩余为无菌蒸馏水,其可用来补足25μL反应体系。反应程序:温度为62℃,时间为60min,可以依照实际反应的情况进行终止。Real Amp检测法相比普通LAMP检测法更快速,25 min内即可判定结果;用于特异性试验的19株实验菌株中,6株变形杆菌现阳性结果,其他13株非变形杆菌,均呈阴性结果;检测纯菌的灵敏度是8.1 CFU/m L,是普通LAMP检测方法的10倍;人工污染猪肉的检出限为81 CFU/m L;通过限制性内切酶Hpa I酶切Real Amp扩增产物,测得酶切片段长度与理论值相符,验证了该反应的正确性。通过本试验而建立的Real Amp检测变形杆菌的方法可实时监测并直观判定检测结果,操作简单,耗时短,特异性强、灵敏度高,实现了变形杆菌的快速检测需要,非常有利于基层检验检疫机构应用到实际中。

关键词：实时荧光LAMP LAMP 变形杆菌检测 sybr greenⅰ

多重荧光PCR检测产vero毒素大肠杆菌（VTEC）方法的研究及初步应用

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多重荧光PCR检测产vero毒素大肠杆菌（VTEC）方法的研究及初步应用

作者：贝峰山东农业大学

学位级别：硕士

产Vero毒素大肠埃希氏菌(Verocytotoxin-producing Escherichia coli, VTEC),又称产类志贺氏菌毒素大肠杆菌(Shiga-like toxin-producing Escherichia coli,SLTEC),是指能够产生对Vero细胞和Hela细胞有毒性的VT1、VT2及VT1、VT2变异毒素的一群大肠埃希氏菌。该类菌主要通过食物传播,动物产品有可能是感染人类的主要来源。能引起任何动物的溶血性尿毒综合症(HUS)、出血性结肠炎(HC)和血栓性血小板减少性紫癜(TTP)等严重疾病。目前世界上许多发达国家和一部分发展中国家都发生过VTEC的暴发流行,成为全球性的公共卫生问题。新加坡官方已明确要求,所有对新进口的肉食品必须检测VTEC,因此建立快速准确的诊断方法已成为动物产品检疫的迫切要求。实时荧光PCR技术是一种新型的核酸检测技术,在临床诊断中已经用于细菌、病毒及遗传性疾病的检测,具有极大的应用价值。本研究中依据sybr greenⅰ能和双链DNA结合的特性,根据VT1和VT2毒素基因的保守性分别设计一对引物,进行多重荧光PCR反应,从而为出口肉食品检测和临床诊断提供有力的依据。本课题分两部分进行研究。试验一产vero毒素大肠杆菌(VTEC)多重荧光PCR检测方法的建立该研究的目的是通过比较Genbank中已发表的VT基因序列的同源性,设计特异性引物,利用该引物进行PCR扩增,结果只有以VTEC的DNA为模板可以扩增出95bp和108bp的特异条带。利用sybr greenⅰ能和双链DNA结合的特性,通过对试验条件的优化,实现了对VTEC的实时荧光PCR检测。试验中能够检出液体样品中的VTEC细菌数量可达10cfu/mL。试验结果表明建立的sybr greenⅰ实时荧光PCR方法的特异性、敏感性、重复性均达到试验设计要求。试验二VTEC多重荧光PCR法在VTEC快速检测中的应用应用试验一建立的方法检测样品,样品来源有两部分,一部分是模拟阳性样品,另一部分是实际采集样品。并且依此来验证该方法在实际检测中的灵敏度和适用性。结果表明,该方法采用6h的增菌培养后,进行荧光PCR检测,能够检测到原始样品中VTEC最低量可以达到10cfu/g,适合于出口肉食品检测和临床快速诊断。

关键词：产vero毒素大肠杆菌 VT 多重荧光PCR sybr greenⅰ

鸡传染性贫血病毒感染宿主后的基因表达谱分析及实时荧光定量PCR检测方法的建立

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鸡传染性贫血病毒感染宿主后的基因表达谱分析及实时荧光定量PCR...

作者：杨丽聪河北农业大学

学位级别：硕士

鸡传染性贫血病毒(chicken infectious anemia virus,CIAV)能够引起再生障碍性贫血以及胸腺和法氏囊等淋巴组织的萎缩,已成为造成养鸡业巨大经济损失的重要原因之一。基因表达谱芯片属于基因芯片的一种,近年来得到了广泛应用,它能够用... 详细信息

鸡传染性贫血病毒(chicken infectious anemia virus,CIAV)能够引起再生障碍性贫血以及胸腺和法氏囊等淋巴组织的萎缩,已成为造成养鸡业巨大经济损失的重要原因之一。基因表达谱芯片属于基因芯片的一种,近年来得到了广泛应用,它能够用来检测宿主的基因组,研究病毒在不同状态下的基因表达情况。实时荧光定量PCR的原理是通过PCR产物的累积,使荧光信号强度等比例增加来实时监控扩增产物。本文研究了两部分,第一部分为鸡感染鸡传染性贫血病毒后的表达谱分析,第二部分为实时荧光定量PCR检测方法的建立。1.鸡感染鸡传染性贫血病毒后的表达谱分析由于鸡传染性贫血病毒的主要感染对象是雏鸡,并且能够通过水平传播和垂直传播,从而造成鸡只大量死亡。为了深入了解其致病机制,本实验首先通过CIAV感染1日龄SPF雏鸡进行动物模型的建立,同时设立阴性对照,结果发现鸡只感染病毒后14日时发病最严重、症状最明显,于是采取14日龄鸡只胸腺,提取总RNA,反转录成c DNA,在体外合成c RNA,采用Affymetrix全基因组表达谱芯片与其杂交,从而得到基因表达谱的变化情况。利用SAM软件进行差异表达基因的筛选,同时将这些差异表达基因进行聚类分析,之后通过DAVID软件对我们得到的差异表达基因进行生物学功能分析,同时应用实时荧光定量PCR对基因表达谱芯片得到的结果进行验证。结果成功筛选出13708个差异表达基因,其中1759个上调基因,529个下调基因,其中与免疫相关的基因有38个,11420个基因未发生变化。GO和Pathway分析结果显示,这些差异表达基因主要与免疫应答、细胞周期、细胞凋亡、血小板凝集等重要的信号通路有关。我们采用实时荧光定量PCR技术随机验证其中的7个差异表达基因,得到的结果与基因表达谱芯片的结果具有一致性,表明这次的芯片实验结果具有可靠性。2、实时荧光定量PCR检测方法的建立实时荧光定量PCR对样品检测准确、灵敏,并且能够准确定量,弥补了病毒分离鉴定、血清学诊断、PCR诊断方法、电镜检查以及测量血细胞压积值等检测方法的不足。实时荧光定量PCR包括探针法和染料法,由于sybr greenⅰ染料操作简单,成本低廉,因此得到广泛应用。本试验根据CIAV基因组的保守区域设计了1对特异性引物,扩增后得到的片段大小为180bp,制备PGM-T-CIAV重组质粒,得到阳性质粒的标准品,绘制Q-RT PCR标准方程曲线,并做敏感性试验、特异性试验和重复性试验,最后对临床样品进行了检测。试验结果证实,在进行CIAV检测时,Q-RT PCR比普通PCR灵敏度要高、特异性要强、重复性要好,并且在对临床样品进行检验时,再一次证明其具有很高的灵敏度。

关键词：鸡传染性贫血病毒基因表达谱芯片差异表达基因荧光定量PCR sybr greenⅰ

鸭星状病毒3型流行株分子特征及荧光定量检测方法的建立

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鸭星状病毒3型流行株分子特征及荧光定量检测方法的建立

作者：张蕊福建农林大学

学位级别：硕士

鸭病毒性肝炎（Duck viral hepatitis,DVH）是一种对雏鸭造成急性、高度接触性的传染病,病原包括鸭甲肝病毒（Duck hepatitis A virus,DHAV）和鸭星状病毒（Duck astrovirus,DAstV）。现有研究表明鸭群中存在4种鸭星状病毒（DAstV）,即... 详细信息

鸭病毒性肝炎（Duck viral hepatitis,DVH）是一种对雏鸭造成急性、高度接触性的传染病,病原包括鸭甲肝病毒（Duck hepatitis A virus,DHAV）和鸭星状病毒（Duck astrovirus,DAstV）。现有研究表明鸭群中存在4种鸭星状病毒（DAstV）,即鸭星状病毒1型（DAstV-1）、DAstV-2、DAstV-3和DAstV-4,其中DAstV-3是近年来在我国鸭群中新发现的感染率和发病率均较高的星状病毒,流行的地区越来越广。目前关于DAstV-3的基因组分子特征及其快速检测方法报道较少,对其的检测方法主要为常规的RT-PCR方法,该方法仅能对DAstV-3进行定性诊断,但不能定量分析。本研究对1株新分离获得的DAstV-3（命名为GX1806株）进行全基因组序列分析,并建立了针对该病毒的sybr greenⅰ实时荧光定量PCR（real-time PCR）检测方法,为深入研究DAstV-3的遗传变异情况和该病的早期快速诊断提供有效的技术支撑。本研究从广西临床样品中分离获得1株DAstV-3（GX1806株）,应用RT-PCR方法对病毒GX1806株基因组进行分段扩增。对测序结果进行编辑、拼接后获得GX1806株基因组序列。基因组序列分析显示,GX1806株基因组全长7463nt,具有星状病毒基因组典型特征,包含ORF1a、ORF1b和ORF2三个开放阅读框。ORF1a和ORF1b的重合区域存在AAAAAAC的七碱基滑动序列,ORF1b中存在对单股正链RNA病毒复制中不可或缺的RNA依赖的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase,RDRP）基因。遗传进化分析表明,GX1806株与GenBank中CPH株的亲缘关系最近,全基因组序列同源性达到96.87%。为建立一种DAstV-3的实时荧光定量检测方法,本研究扩增出RDRP基因一段609 bp大小的保守区域,并将该扩增片段克隆至pMD18-T载体上。将该质粒进行10倍梯度稀释,作为标准品模板来进行实时荧光定量PCR扩增,建立了实时荧光定量PCR标准曲线。当RDRP基因含量在1.15×10～2拷贝/μL.15×10～8拷贝/μL时,循环阈值与模板浓度具有良好的线性关系,其扩增相关系数为0.997,扩增效率为99.9%。建立的DAstV-3实时荧光定量PCR检测方法敏感度高,最低检测限为1.15×10～2拷贝/μL,敏感性为常规RT-PCR检测方法的1000倍;特异性强,对常见病毒（如禽流感病毒、鸭呼肠孤病毒、坦布苏病毒、鸭甲肝病毒等以及鸭星状病毒1型和鸭星状病毒2型）的检测均呈阴性。重复性结果表示组内重复变异系数为0.14%.65%、组间重复变异系数为0.53%.20%,表明重复性良好。sybr greenⅰ实时荧光定量PCR检测方法的阳性率为59.5%（22/37）,常规PCR方法的阳性率为43.2%（16/37）,2种方法的符合率为100%。以上结果表明本研究首次建立的基于sybr greenⅰ的实时荧光定量PCR检测方法可用于临床中对DAstV-3引起疾病的早期诊断。

关键词：鸭星状病毒3型全基因组序列 sybr greenⅰ 实时荧光定量PCR