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中蜂囊状幼虫病毒sybr green Ⅰ实时荧光定量PCR方法的建立与应用

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中国兽医科学 2023年第5期53卷 559-565页

作者：王艺桦王红坤周云倩周丹银张炫云南农业大学动物科学技术学院云南昆明650201 云南农业大学东方蜜蜂研究所云南昆明650201 云南省蜜蜂资源可持续利用工程研究中心云南昆明650201

通过RT-PCR方法在云南中华蜜蜂体内检测中蜂囊状幼虫病毒(CSBV),该病毒主要以AmSBV-YN(GenBank ID:KX819276.1)病毒株的形式存在。为了精确鉴定、快速检测中蜂囊状幼虫病毒,根据AmSBV-YN的CDS保守区域,设计合成特异性引物并建立相对应的... 详细信息

通过RT-PCR方法在云南中华蜜蜂体内检测中蜂囊状幼虫病毒(CSBV),该病毒主要以AmSBV-YN(GenBank ID:KX819276.1)病毒株的形式存在。为了精确鉴定、快速检测中蜂囊状幼虫病毒,根据AmSBV-YN的CDS保守区域,设计合成特异性引物并建立相对应的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。结果显示,该方法的标准曲线循环域值(C_(t))与标准品模板浓度在2.34×10^(2)~2.34×10^(9)copies/μL间的线性关系良好,相关系数R~2为0.994,斜率为-3.118。该方法与蜜蜂残翅病毒、黑蜂王台病毒、蜜蜂以色列急性麻痹病毒不发生交叉反应,表明该方法特异性强;重复性评价结果显示,批内与批间的变异系数均小于3%。所建立的荧光定量PCR方法对中华蜜蜂样品的检测结果显示,阳性率达90.0%,高于常规PCR方法的检测阳性率73.3%,说明该方法具有良好的适用性。结果表明,该方法可应用于对中蜂囊状幼虫病毒的快速检测,为中蜂囊状幼虫病的及时防控提供了有力的技术支持。

关键词：中蜂囊状幼虫病毒中华蜜蜂 AmSBV-YN SYBR GreenⅠ 实时荧光定量PCR

甜瓜黄斑病毒sybr green Ⅰ实时荧光定量PCR方法

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植物病理学报 2023年第1期53卷 119-125页

作者：孙晓辉潘睿婧刘永光王丹石朝鹏乔宁孙作文竺晓平山东农业大学植物保护学院山东省果蔬优质高效生产协同创新中心泰安271018 潍坊科技学院山东省设施园艺生物工程研究中心寿光262700 山东省植物保护总站济南250100

为建立检测甜瓜黄斑病毒(melon yellow spot virus, MYSV)的sybr green Ⅰ实时荧光定量PCR(qPCR)方法。基于MYSV核衣壳蛋白基因保守序列设计qPCR特异性引物对,针对引物退火温度、引物浓度、特异性和敏感性进行系列优化。结果显示,优化后... 详细信息

为建立检测甜瓜黄斑病毒(melon yellow spot virus, MYSV)的sybr green Ⅰ实时荧光定量PCR(qPCR)方法。基于MYSV核衣壳蛋白基因保守序列设计qPCR特异性引物对,针对引物退火温度、引物浓度、特异性和敏感性进行系列优化。结果显示,优化后的qPCR方法最适退火温度为61.3℃,最适引物浓度为0.65μmol·L-1,特异性强,灵敏度高,比PCR高100倍。以携带目的基因片段的重组质粒为标准品,构建的qPCR标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,相关系数为0.999 7。实验样品验证表明建立的qPCR方法可用于MYSV的定量检测。

关键词：甜瓜黄斑病毒 SYBR GreenⅠ 实时荧光定量PCR 病毒检测

鹅出血性多瘤病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立

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中国兽医科学 2022年第3期52卷 278-284页

作者：罗灵芝杨鹏江丁彦彬勾明郗赵墩余兴龙杨磊湖南农业大学动物医学院湖南长沙410128

为了建立一种能快速、灵敏且准确检测鹅出血性多瘤病毒(goose hemorrhagic polyomavirus,GHPV)的诊断方法,将GHPV的VP1基因构建到载体pClone007 Blunt Simple Vector上,将获得的重组质粒作为标准阳性模板,以建立GHPV VP1基因的sybr Gree... 详细信息

为了建立一种能快速、灵敏且准确检测鹅出血性多瘤病毒(goose hemorrhagic polyomavirus,GHPV)的诊断方法,将GHPV的VP1基因构建到载体pClone007 Blunt Simple Vector上,将获得的重组质粒作为标准阳性模板,以建立GHPV VP1基因的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,并对该方法的特异性、敏感性、重复性和在临床检测中的应用进行验证。结果显示,所建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法的标准曲线呈良好的线性关系,其线性相关系数R^(2)=0.975,其扩增效率E=86.731%,熔解曲线呈现单峰;检测鹅细小病毒、鹅圆环病毒、鹅副黏病毒、鸭坦布苏病毒、鹅星状病毒时呈阴性,具有较好的特异性;最低检出浓度为(1.16×10^(1)copies/μL),比普通PCR方法灵敏100倍;其中组内变异系数在0.10%~1.48%之间,组间变异系数在1.07%~2.24%之间,具有较好的重复性和稳定性;对20份临床组织样品检测结果进行分析发现,与普通PCR检测结果相比阳性率高出20%,其中阳性符合率为100%,总符合率为80%。上述结果表明,本研究建立的检测GHPV的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,对GHPV的快速诊断和监测具有重要意义。

关键词：鹅出血性多瘤病毒 SYBR GreenⅠ 荧光定量PCR

塞内卡病毒A SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立

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中国兽医科学 2022年第2期52卷 162-167页

作者：王晨罗愿陈彦希周远成刘骁西南大学动物医学院重庆400000 四川省畜牧科学研究院四川成都610000

为深入研究塞内卡病毒A的病原学及流行病学,本研究分离获得了1株塞内卡病毒A的重庆地区毒株并将其命名为SVA-XN2021。针对VP1基因,设计了1对特异性引物,将SVA-XN2021株编码区克隆入载体pcDNA3.1(+),构建了以重组标准阳性质粒pcDNA3.1(+)... 详细信息

为深入研究塞内卡病毒A的病原学及流行病学,本研究分离获得了1株塞内卡病毒A的重庆地区毒株并将其命名为SVA-XN2021。针对VP1基因,设计了1对特异性引物,将SVA-XN2021株编码区克隆入载体pcDNA3.1(+),构建了以重组标准阳性质粒pcDNA3.1(+)-SVA为模板的SVA的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,并进行了特异性、敏感性和重复性试验。结果显示,本研究建立的荧光定量PCR检测方法的Ct值与标准品模板在1.0×10^(1)~1.0×10^(6)copies/μL的范围内线性关系良好,相关系数为0.9948。且用该方法对PEDV、TGEV、PDCoV等猪常见的腹泻病样品检测时无扩增,表明其特异性良好;该方法检测下限可达到1.0×10^(1)copies/μL,比常规RT-PCR敏感性高10倍;组内变异系数介于0.1%~0.29%之间,组间变异系数介于0.1%~0.81%之间,说明该检测方法重复性较好。上述结果表明,本研究建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法可以作为SVA的重要诊断技术,有利于SVA的防治。

关键词：塞内卡病毒A 荧光定量PCR SYBR GreenⅠ

牛匈爱病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法的建立及应用

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中国兽医科学 2022年第10期52卷 1252-1258页

作者：朱鑫玥董覃婷罗宇航张广欣乔成鹏黄稳妃邹延林陈樱欧阳康韦祖樟苏亚权潘艳黄伟坚广西大学动物科学技术学院广西南宁530005 广西农业职业技术大学广西南宁530007

水牛匈爱病毒(BufHuV)是2021年在广西水牛中新发现的一种小核糖核酸病毒,本研究旨在建立一种可用于临床快速且特异检测牛匈爱病毒的方法。基于GenBank上公布的bovine hunnivirus、ovine hunnivirus和BufHuV的5′UTR保守区设计了1对特异... 详细信息

水牛匈爱病毒(BufHuV)是2021年在广西水牛中新发现的一种小核糖核酸病毒,本研究旨在建立一种可用于临床快速且特异检测牛匈爱病毒的方法。基于GenBank上公布的bovine hunnivirus、ovine hunnivirus和BufHuV的5′UTR保守区设计了1对特异性引物,首次建立了检测牛匈爱病毒的sybrgreenⅠ实时荧光定量PCR方法。结果表明,标准曲线在1.1×10^(8)copies/μL~1.1×10^(3)copies/μL质粒标准品稀释浓度范围内呈线性关系,斜率为-3.2657,相关系数为0.9998,熔解曲线为单峰,检测下限为1.1×10^(1)copies/μL,比常规PCR敏感性高100倍;特异性高,与多种常见的牛病病毒均无交叉反应;重复性好,批内和批间变异系数均小于1.0%。收集了257份有腹泻迹象的牛粪样品,用于对所建立平台的性能评估,结果,建立的实时荧光定量PCR的阳性检出率为3.89%,高于普通PCR的阳性检出率(1.56%)。上述结果表明,该方法将为牛匈爱病毒的临床样品检测、流行病学监测提供一种快速、可靠、低成本的替代方案,也为后续研究奠定了基础。

关键词： hunnivirus SYBR GreenⅠ 实时荧光定量PCR 5′UTR 检测方法

鸭骨形态发生蛋白SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR检测方法的建立

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福建农业学报 2022年第12期37卷 1509-1518页

作者：刘鸿威林昶王劭肖世峰程晓霞郑敏陈少莺曾显成陈仕龙福建农林大学动物科学学院(蜂学学院) 福建福州350002 福建省农业科学院畜牧兽医研究所福建福州350013 福建省农业科学院莆田分院福建莆田351100

【目的】旨在建立一种检测鸭骨形态发生蛋白(BMPs)mRNA转录水平的SYBR GreenⅠ实时荧光定量RTPCR检测方法。【方法】根据GenBank中BMP1、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8a、BMP10和BMP15的核苷酸序列设计并合成特异性引物进行... 详细信息

【目的】旨在建立一种检测鸭骨形态发生蛋白(BMPs)mRNA转录水平的SYBR GreenⅠ实时荧光定量RTPCR检测方法。【方法】根据GenBank中BMP1、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8a、BMP10和BMP15的核苷酸序列设计并合成特异性引物进行PCR扩增,产物回收后克隆至pMD-18-T载体,构建阳性重组质粒作为标准品,优化SYBR GreenⅠ荧光定量PCR反应条件,建立其标准曲线,对建立的方法进行特异性、敏感性和重复性试验。【结果】建立的BMP1、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8a、BMP10和BMP15基因实时荧光定量检测方法特异性强,无引物二聚体及非特异性产物,熔解曲线为单峰,相关系数R2均大于0.998,组间和组内变异系数均小于1%。应用该方法检测BMPs基因在半番鸭组织中的表达水平,结果显示,BMP1、 BMP2、 BMP5和BMP7基因在心脏中表达量较高,分别为5.5×10^(4)、 1.1×10^(5)、 5.1×10^(5)和7.7×10^(5)拷贝·μL^(-1);BMP6和BMP10基因在肝脏中表达量较高,分别为7.5×10^(4)和7.6×10^(3)拷贝·μL^(-1);而BMP3、 BMP4、BMP8a和BMP15分别在法氏囊、胸腺、喙和脾脏中表达量最高,分别为1.5×10^(5)、2.1×10^(4)、1.8×10^(3)和3.3×10^(3)拷贝·μL^(-1)。【结论】本研究建立的实时荧光定量PCR方法特异性强、重复性好,为检测鸭BMPs表达水平提供了技术手段。

关键词：鸭骨形态发生蛋白(BMPs) 荧光定量PCR SYBR GreenⅠ

猪圆环病毒3型SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法的建立

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中国兽医学报 2022年第7期42卷 1315-1319,1334页

作者：王星李杰峰张宁王华健孙艳玲杨旭光马玉忠杨威翟向和河北农业大学动物医学院河北保定071001 河北省畜牧兽医研究所河北保定071001 衡水市动物疫病预防控制中心河北衡水05300

为建立针对猪圆环病毒3型(porcine circovirus type 3,PCV3)的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,使用DNAStar软件对GenBank中PCV3的ORF1基因进行保守区域分析,并使用Primer Premier 5软件对PCV3 ORF1基因的高度保守区域设计引物,经PCR扩增后构建了PCV3 ORF1基因的标准品质粒,以构建的标准品质粒为模板,分别从退火温度优化、标准曲线和熔解曲线的建立、特异性、灵敏性、重复性等方面对所建立的检测方法进行探究。特异性试验结果显示,建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR特异性良好,仅对PCV3存在特异性扩增,而对其他8种病毒均无扩增;灵敏度试验表明该方法最低检测量为6.55拷贝/μL,是常规PCR的100倍;以浓度为6.55×10^(2)~6.55×10^(8)拷贝/μL的标准品质粒构建的标准曲线相关系数为0.996,扩增效率可达99.7%;重复性试验结果显示,组内变异系数和组间变异系数均在2%以内。临床试验对100份猪血清进行PCV3检测,结果显示建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR的阳性率为16%(16/100),高于常规PCR的阳性率10%(10/100)。结果表明,建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR可为PCV3的快速诊断、流行病学调查及防控提供技术支持。

关键词：猪圆环病毒3型荧光定量PCR SYBR GreenⅠ

SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR检测水泡性口炎病毒方法的建立

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中国兽医科学 2022年第2期52卷 152-161页

作者：李嘉阳赵佳男秦彤季芳李刚王承民中国农业科学院北京畜牧兽医研究所农村农业部兽用药物与诊断技术北京科学观测试验站北京100193 广东省科学院动物研究所广东省动物保护与资源利用重点实验室广东省野生动物保护与利用公共实验室广东广州510260 中国农业大学动物医学院北京100193

本研究旨在建立一种快速、灵敏的用于诊断水泡性口炎的SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR检测方法。通过RT-PCR分别扩增印第安纳型水泡性口炎病毒(VSV-IN)和新泽西型水泡性口炎病毒(VSVNJ)的G基因,然后将其连接到克隆载体pMD19-T上,构建... 详细信息

本研究旨在建立一种快速、灵敏的用于诊断水泡性口炎的SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR检测方法。通过RT-PCR分别扩增印第安纳型水泡性口炎病毒(VSV-IN)和新泽西型水泡性口炎病毒(VSVNJ)的G基因,然后将其连接到克隆载体pMD19-T上,构建质粒标准品pMD-VSV-IN-G和pMD-VSV-NJG。根据GenBank中VSV-IN和VSV-NJ的G基因保守序列设计引物,利用SYBR GreenⅠ法进行实时荧光定量RT-PCR,建立标准曲线,并进行特异性、敏感性和重复性试验。结果,在拷贝数6.82~6.82×10^(8)copies/μL范围内,C;值与质粒拷贝数的对数值呈良好的线性关系,pMD-VSV-IN-G标准曲线的R;值为0.99812,p MD-VSV-NJ-G标准曲线的R^(2)值为0.99748;检测其他病毒均无特异性扩增曲线,特异性良好。pMD-VSVIN-G的检测灵敏度为6.82 copies/μL,pMD-VSV-NJ-G的检测灵敏度也为6.82 copies/μL,是普通RTPCR方法的10倍。用该方法对实验室保存的VSV-IN和VSV-NJ各5份攻毒小鼠样品进行检测,检测结果与普通RT-PCR检测一致。上述结果表明,本检测方法的建立对快速、灵敏鉴别诊断IN型和NJ型水泡性口炎病毒具有重要的应用价值。

关键词：印第安纳型水泡性口炎病毒(VSV-IN) 新泽西型水泡性口炎病毒(VSV-NJ) RT-PCR 实时荧光定量PCR SYBR GreenⅠ

鸭星状病毒3型SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

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农业生物技术学报 2022年第4期30卷 817-824页

作者：傅秋玲张蕊傅光华万春和程龙飞施少华陈红梅刘荣昌黄瑜福建省农业科学院畜牧兽医研究所福建省禽病防治重点实验室

鸭星状病毒3型(Duck astrovirus-3, DAstV-3)是近年来危害我国养鸭业的新发病原。本研究根据前期从樱桃谷鸭(Anas platyrhynchos domestica)胚中分离鉴定的DAstV-3分离株及已报道毒株的RNA依赖性的核糖核酸聚合酶基因(RNA-dependent RNA... 详细信息

鸭星状病毒3型(Duck astrovirus-3, DAstV-3)是近年来危害我国养鸭业的新发病原。本研究根据前期从樱桃谷鸭(Anas platyrhynchos domestica)胚中分离鉴定的DAstV-3分离株及已报道毒株的RNA依赖性的核糖核酸聚合酶基因(RNA-dependent RNA polymerase, RDRP)特征设计特异性引物，建立检测DAstV-3的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。结果表明，该方法的标准曲线循环域值(Ct)与标准品模板浓度在1.15×101～1.15×107拷贝/μL间线性关系良好，相关系数R2和扩增效率分别为0.999和2.08；该方法特异性强，仅可检出DAstV-3，而对鸭常见疫病病原(DAstV-1, DAstV-2,禽流感病毒H9 (H9 subtype Avian influenza virus),禽坦布苏病毒(Avian tambusu virus),鸭呼肠孤病毒(Duck reovirus),番鸭细小病毒(Muscovy parvovirus))检测均为阴性；灵敏度高，其最低检测下限为23拷贝；并且重复性好，批内和批间重复试验变异系数分别为0.14%～0.65%和0.53%～0.94%，均低于1%。利用该方法对2018年6月至2021年3月的209份疑似DAstV-3感染病例样品进行检测，DAstV-3的阳性检出率为56.5%(118/209)。综上结果表明，本研究所建立的方法特异性强、灵敏度高、稳定性好，为DAstV-3感染的快速诊断和流行病学监测提供了有力的技术支持。

关键词：鸭星状病毒3型(DAstV-3) RNA依赖性的核糖核酸聚合酶(RDRP) SYBR GreenⅠ 实时荧光定量PCR