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裂谷热病毒Real-time PCR检测方法的建立及其G2部分蛋白的原核表达

裂谷热病毒Real-time PCR检测方法的建立及其G2部分蛋白的原核表达

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作者：李林扬州大学

学位级别：硕士

裂谷热病毒(Rift Valley fever virus,RVFV)为白蛉热病毒属(Phlebovirus)布尼病毒科(Bunyaviridae)成员，是引起裂谷热(Rift Valley feve, RVF)的病原。RVF是一种最急性或急性传染病，主要经蚊子传播，可以引起怀孕母畜流产、出血热等... 详细信息

裂谷热病毒(Rift Valley fever virus,RVFV)为白蛉热病毒属(Phlebovirus)布尼病毒科(Bunyaviridae)成员，是引起裂谷热(Rift Valley feve, RVF)的病原。RVF是一种最急性或急性传染病，主要经蚊子传播，可以引起怀孕母畜流产、出血热等症状并导致幼畜较高的死亡率，因此被OiE列为A类疾病。虽然我国尚未有发现裂谷然的报道，但近年来该病分布范围有不断扩大的趋势，对我国构成潜在的威胁。到目前为止，我国还未见针对此病的研究报道，为了建立针对该病毒可靠的诊断技术，防止该病传入我国，本研究一方面建立了两种Real-time PCR技术快速检测裂谷热：另一方面使用大肠杆菌系统表达了裂谷热病毒G2蛋白部分序列，为其免疫学检测方法的建立奠定了基础。根据Genbank中注册的裂谷热病毒G2基因序列，通过进行比较分析在其保守区域分别设计了一对引物和一条TaqMan探针：引物和探针通过在PubMed上进行Blast和Real-time PCR特异性鉴定证实具有很高的特异性。用常规PCR方法从重组质粒pLSEG-RVFV模板中扩增出目的片断，PCR产物经过纯化后克隆到pMD18-T载体中构建成重组质粒pMD18-RG2。重组质粒pMD18-RG2经过纯化和定量后用作Real-time PCR的标准品。经过Real-time PCR主要的反应条件的优化，确定采用两步法进行Real-time PCR，最佳退火温度为60℃，Mg浓度为4mM。所建立的TaqMan探针Real-time PCR方法在DNA水平上最小检出量为3×10个拷贝的标准品模板，检测范围达到6个数量级，标准曲线在3×10至3×10cpr时线性关系良好，重复性高。通过对G2基因的序列分析，设计了一对用于sybr green Ⅰ荧光染料的PCR引物，重组质粒pLSEG-RVFV经测定浓度和纯度后，用作Real-time PCR的标准品。通过Blast和常规PCR鉴定引物的特异性，熔解曲线区分特异性片断和非特扬州大学硕士学位论文异性扩增，经过优化反应程序、M广浓度和退火温度等Real一time PcR反应条件，确定该PcR方法采用两步法，Mg2+的最佳浓度为3 .sm入i，最佳退火温度为60℃。该方法在DNA水平上的检测范围为3xl护至3xl夕c/r时，标准曲线的线性关系良好(扩=0.998)，并且具有良好的可重复性。另外，通过G2蛋白的结构分析，确定了其抗原性较高的部位，用常规PCR 扩增出目的片段，克隆到质粒载体pET32a中，通过菌落PCR和限制性内切酶法筛选出阳性重组质粒，最后通过测序确认，将重组质粒命名为pET32一RGZP:将 pET32·RGZP转化表达宿主菌BLZi(DE3)，目的蛋白经iPTG诱导表达后进行 SDS一PAGE和Westem一blot分析，结果显示目的蛋白获得了正确表达。通过对温度、诱导剂浓度和诱导时间等不同条件的优化后结果发现目的蛋白的表达量并未得到增加，要想提高目的蛋白的产量还需进一步优化其它条件。综上所述，本试验在DNA水平上成功建立了两种RVFV的Real·time PCR检测方法，二者均具有良好的敏感性、特异性和可重复性;并尝试使用原核表达系统表达出了RvFV GZ蛋白的部分抗原区，这为该病的诊断提供了一定的条件。

关键词：裂谷热病毒 Real-time PCR TaqMan探针 sybr green i染料 G2蛋白

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