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survivin-sirna敏感肿瘤株的筛选及其侵袭和迁移的作用机制研究

东南大学学报（医学版） 2018年第5期37卷 777-781页

作者：周伟华宜春学院化学与生物工程学院江西宜春336000

目的:筛选靶向survivin基因的抗肿瘤sirna前体药物,并且探讨其抑制肿瘤细胞侵袭和迁移的分子机制。方法:采用MTT法检测survivin sirna脂质体对非小细胞肺癌细胞株H1299、肝癌细胞株SMMC-7721、甲状腺癌细胞株8505C、乳腺癌细胞株MCF-7... 详细信息

目的:筛选靶向survivin基因的抗肿瘤sirna前体药物,并且探讨其抑制肿瘤细胞侵袭和迁移的分子机制。方法:采用MTT法检测survivin sirna脂质体对非小细胞肺癌细胞株H1299、肝癌细胞株SMMC-7721、甲状腺癌细胞株8505C、乳腺癌细胞株MCF-7、结肠腺癌细胞株HCT-116和食管癌细胞株EC109增殖的抑制作用,选择对survivin-sirna最敏感的8505C细胞株进行后续研究;分别采用划痕法和Transwell法测定survivin-sirna对8505C细胞株迁移和侵袭的影响,采用RT-PCR法和Western blotting测定survivin-sirna对8505C细胞株survivin、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)和粘着斑激酶(FAK) mRNA和蛋白水平表达的影响。结果:(1) survivin-sirna对H1299、SMMC-7721、8505C、MCF-7、HCT-116和EC109细胞株均有一定程度的抑制作用,其中对8505C细胞株抑制作用最强(IC50=5. 83μg·ml^(-1));(2)癌细胞迁移实验中,survivin-sirna可剂量依赖性增大划痕刻度(P survivin-sirna可剂量依赖性减少穿膜细胞数量;(4)在RT-PCR实验中,survivin-sirna可剂量依赖性降低8505C细胞株中survivin、MMP-9和FAK mRNA表达;(5)在Western blotting实验中,survivin-sirna可剂量依赖性降低8505C细胞株中survivin、MMP-9和FAK蛋白表达。结论:survivin-sirna作为新型的抗肿瘤药物对甲状腺癌8505C细胞增殖具有较强的抑制作用,并且可以抑制8505C细胞的迁移和侵袭,这可能与其抑制细胞survivin、MMP-9和FAK的表达有关。

关键词： survivin-sirna 抗肿瘤肿瘤迁移肿瘤侵袭 survivin MMP-9 FAK

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新的sirna递送系统：S-β-咔啉-3-酰基-RGDV的制备及survivin基因沉默效应研究

新的siRNA递送系统：S-β-咔啉-3-酰基-RGDV的制备及SURVIVIN基因...

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作者：咸颖首都医科大学

学位级别：硕士

survivin基因是近年来发现的凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein,IAP)家族中的一个新成员,具有抑制细胞凋亡和维持细胞有丝分裂的双重功能,在正常的终末分化组织中几乎不表达。在生理状态下,survivin仅表达于成人分泌期子宫... 详细信息

survivin基因是近年来发现的凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein,IAP)家族中的一个新成员,具有抑制细胞凋亡和维持细胞有丝分裂的双重功能,在正常的终末分化组织中几乎不表达。在生理状态下,survivin仅表达于成人分泌期子宫内膜、胎盘、睾丸、胸腺及胚胎中,但在病理状态下,survivin广泛表达于人类各种恶性肿瘤组织中。survivin表达增高可抑制肿瘤细胞凋亡而促进其增殖,而且其表达与病程进展明显相关,最大表达值在G/M期。基因治疗中,survivin-sirna可以通过RNA干扰导致survivin基因沉默。本课题中合成了一种新化合物S-β-咔啉-3-酰基-RGDV,为双亲性化合物,具有抗肿瘤的作用,可替代磷脂与胆固醇共同形成脂质体的外膜。通过鱼精蛋白修饰脂质体和小牛胸腺DNA压缩sirna,将survivin-sirna后载入至脂质体中,得到一种新型sirna递送系统:LPD(liposome-polycation-DNA,脂质体-多聚阳离子-DNA复合物),对其进行了以下研究:1.本课题合成了新化合物S-β-咔啉-3-酰基-RGDV(以下简称CRV),通过测定化合物核磁、质谱、紫外光谱、红外光谱、HPLC确定其性质及结构。2.用薄膜分散法制备以CRV为主要膜材的脂质体,通过鱼精蛋白修饰脂质体和小牛胸腺DNA压缩sirna,将survivin-sirna后载入至脂质体中,得到一种新的sirna递送系统:LPD(liposome-polycation-DNA,脂质体-多聚阳离子-DNA复合物)。共聚焦显微镜考察载sirna的成功;DSC考察载sirna的成功;体外释放研究解释其释药行为;透射电镜和扫描电镜下观察到该递送系统的外观呈类球形;激光粒度仪测定其粒径在100-200 nm之间,Zeta电位在0 mV左右。3.体外细胞毒试验,选取人类宫颈癌HeLa细胞株,3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5–diphenytetrazoliumromide(MTT)法分别测定不同比例CRV制备的空白脂质体载不同浓度的survivin基因的细胞毒作用,并与市售转染试剂进行比较。发现survivin-sirna/100%CRV liposomes具有较好转染效率。4.蛋白水平的基因沉默效率研究,选取人类宫颈癌HeLa细胞株,进行ELISA测定细胞内survivin蛋白的含量,结果表明survivin-sirna/100%CRV liposomes与市售转染试剂相比,基因沉默效率无明显差异。***水平的基因沉默效率研究,选取人类宫颈癌HeLa细胞株,通过RT-PCR测定细胞内产生的mRNA的含量,结果表明,survivin-sirna/100%CRV liposomes与市售转染试剂相比,基因沉默效率无明显差异。6.体内抗肿瘤活性评价,以S荷肉瘤小鼠为模型,尾静脉注射给药,连续给药五天,评价survivin-sirna/100%CRV liposomes的体内抗肿瘤活性,结果表明survivin-sirna/100%CRV liposomes有明显的抗肿瘤活性。7.急性毒性实验,以正常小鼠为模型,腹腔注射给药剂量100倍的CRV原料药,观察七天。结果表明,CRV具有肝脾毒性。血液生化指标的测定结果也同样证明了CRV具有肝脏毒性。8.细胞凋亡实验,选取宫颈癌HeLa细胞株,采用Annexin V-FITC/PI双染法定量survivin-sirna/100%CRV liposomes作用于HeLa细胞后对细胞凋亡率的影响,并与裸survivin-sirna为对比。结果表明,100%CRV liposomes可以有效携带survivin-sirna进入细胞,诱导细胞凋亡,而裸survivin-sirna基因则不能被细胞摄取。9.细胞周期实验,选取人类宫颈癌HeLa细胞株,采用流式细胞仪测定了survivin-sirna/100%CRV liposomes作用于HeLa细胞后,细胞周期各个时相的分布,分析DNA百分含量,并与裸survivin-sirna对比,研究survivin-sirna/100%CRV liposomes阻断细胞周期和抑制肿瘤细胞增长的机制。结果表明,100%CRV liposomes可以有效携带survivin-sirna进入细胞,可以抑制HeLa细胞进入S期进行DNA合成,并且伴有G/M期阻滞的作用,而裸survivin-sirna则不能被细胞摄取。结论:本课题成功制备了一个新的sirna递送系统,其自身具有抗肿瘤作用,体外实验表明其可运载SURVINVIN-sirna并成功递送进入细胞,实现基因沉默效应;体内实验表明其具有明显的抗

关键词： S-β-咔啉-3-酰基-RGDV survivin-sirna sirna递送系统抗肿瘤基因沉默

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EGFR受体介导肺肿瘤靶向sirna脂多胺修饰脂质体的制备与评价

EGFR受体介导肺肿瘤靶向siRNA脂多胺修饰脂质体的制备与评价

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作者：林莹苏州大学

学位级别：硕士

目的：旨在构建EGFR靶向负载survivin-sirna的Staramine修饰的阳离子脂质体(EGFR-PEG-SCLs-sirna)，对其进行制剂学评价，考察其细胞毒性、靶向性、体外摄取、摄取机制以及体外药效学评价，并筛选出沉默效率最高的sirna链等前期工作，... 详细信息

目的：旨在构建EGFR靶向负载survivin-sirna的Staramine修饰的阳离子脂质体(EGFR-PEG-SCLs-sirna)，对其进行制剂学评价，考察其细胞毒性、靶向性、体外摄取、摄取机制以及体外药效学评价，并筛选出沉默效率最高的sirna链等前期工作，为后续制成干粉吸入剂用于肺部给药、发挥药效提供实验依据。方法：本文通过油酰氯成酯后，发生酰胺反应得到类脂质载体Staramine。另外，在纳米载体外，进行PEG修饰，最后通过TLC、1H-NMR、 FT-IR等手段对各产物进行结构表征。Western blot法筛选出最高沉默效率的survivin-sirna链。采用乙醇注入法制备脂质体，静电吸附负载sirna。通过对其粒径、Zeta电位、包封率、抗RNase酶稳定性的评价对脂质体进行表征和评价。体外评价以高表达survivin的人源性肺腺癌耐顺铂株A549/DDP细胞为模型，以MTT法评价载体安全性，原子力显微镜观察细胞对脂质体的摄取作用。以市售制剂Lipofectamine-2000作为阳性对照，采用流式细胞仪考察脂质体的摄取，摄取机制，以及细胞凋亡实验用于评价体外药效。结果：类脂质载体Staramine经TLC、FT-IR、1H-NMR等手段验证产物合成，经1H-NMR计算纯度为87%，DSPE-PEG2000-Mal经TLC和1H-NMR手段验证产物合成，经1H-NMR计算纯度为86.2%。Western blot法筛选出最高沉默效率为38.40%的survivin-sirna链的。所制备的Staramine修饰的阳离子脂质体平均粒径为(172.7±6.6)nm、Zeta-电位为(+7.78±0.5) mV、包封率为（90.8±0.8）%，粒度均一，且对RNase酶有较好的保护作用。原子力显微镜观察A549/DDP细胞通过内吞作用摄取脂质体，流式细胞仪结果表明，EGFR靶向显著性（p＜0.05）提高细胞摄取，其平均荧光强度是EGFR未修饰的1.4倍。摄取机制结果表明，细胞摄取脂质体是一个能量依赖的过程，主要通过网格蛋白以及小窝蛋白介导的内吞。细胞凋亡的实验结果表明，EGFR-PEG-SCLs-sirna组的凋亡率为（41.19±1.83）%，明显高于Lipofectamine-2000组的（21.03±1.37）%。结论：本文制备的EGFR靶向负载survivin-sirna的Staramine修饰的阳离子脂质体(EGFR-PEG-SCLs-sirna)粒径均一稳定，EGFR靶向显著提高细胞摄取率。网格蛋白和小窝蛋白介导的内吞为主要内吞途径。它能很好地转运sirna,发挥survivin-sirna的体外促凋亡作用。

关键词： survivin-sirna 阳离子脂质体细胞摄取

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EGFR受体介导肺肿瘤靶向sirna脂多胺修饰脂质体的体内动态与药效学评价

EGFR受体介导肺肿瘤靶向siRNA脂多胺修饰脂质体的体内动态与药效...

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作者：沈盼苏州大学

学位级别：硕士

目的：构建EGFR受体介导肺肿瘤靶向survivin sirna和MRP1 sirna共负载脂多胺修饰脂质体（EGFR-PEG-NCLs-sirna）,评价其制剂学性质、细胞内动态、体内组织分布以及与顺铂联合用药的抗肿瘤效果。方法：首先,通过置换和酰胺化反应合成类... 详细信息

目的：构建EGFR受体介导肺肿瘤靶向survivin sirna和MRP1 sirna共负载脂多胺修饰脂质体（EGFR-PEG-NCLs-sirna）,评价其制剂学性质、细胞内动态、体内组织分布以及与顺铂联合用药的抗肿瘤效果。方法：首先,通过置换和酰胺化反应合成类脂质阳离子载体材料N,N’-二油酰三羟甲基氨基甲烷（2-氨基乙基）胺（N,N’-dioleoyl tris （2-aminoethyl） amine, NDOA）,并合成聚乙二醇（PEG）马来酸嫁接二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（DEPE）。通过硅胶薄层色谱法（TLC）、傅里叶红外光谱法（FT-IR）和核磁共振法（1H-NMR）等对上述合成产物进行结构验证。采用乙醇注入法制备阳离子脂质体,并测定其粒径,Zeta电位和FAM-sirna的包封率。以人源非小细胞肺腺癌A549细胞和耐顺铂株A549/DDP细胞为模型,以MTT法考察空白长循环阳离子脂质体（PEG-NCLs）对A549与A549/DDP细胞的安全性。采用流式细胞仪（Flow Cytometry, FCM）和激光共聚焦显微镜（Confocal laser scanning microscope, CLSM）考察A549/DDP细胞对EGFR-PEG-NCLs的摄取及其从A549/DDP细胞溶酶体中的逃逸。采用FCM考察EGFR-PEG-NCLs-survivin sirna对A549/DDP细胞的凋亡。采用荧光实时定量PCR（RT-PCR）考察EGFR-PEG-NCLs-survivin/MRP1 sirna对A549细胞的基因沉默。喷雾冷冻干燥法将脂质体制成微粉供肺部干粉吸入给药。以带绿色荧光的人源性肺腺癌细胞株Luc-A549建立裸鼠原位肺癌模型,用小动物活体成像仪考察负载sirna的脂质体通过肺部吸入与尾静脉注射给药时在体内各组织器官分布情况;并考察负载survivin sirna和MRP1 sirna的脂质体与顺铂联用时抑制肿瘤生长的效果。最后,通过苏木精-伊红染色法（Hematoxylin-eosin staining, H＆E）考察给药对各组织器官的影响。结果：经TLC,1H-NMR和FT-IR法验证了阳离子载体材料NDOA的成功制备,其纯度为87%;DSPE-PEG2000-Mal经TLC和1H-NMR法验证产物合成,其纯度为86.2%。PEG-NCLs的粒径为（193.2±3.4）nm,Zeta-电位为（7.9 ± 0.1）mV, FAM-sirna的包封率为（91.9±0.8）%。TEM图结果显示,所制得脂质体粒度均匀,颗粒圆整,分散性良好。摄取结果表明,EGFR靶向可以明显提高A549/DDP细胞对PEG-NCLs的摄取能力,其摄取能力是未经EGFR修饰的1.4倍。CLSM结果显示,EGFR-PEG-NCLs-sirna可从A549/DDP细胞的溶酶体中成功逃逸EGFR-PEG-NCLs-survivin sirna组的凋亡率为（41.14±1.68）%,约为Lipofectamine-2000组（19.86±1.30）%的2倍。EGFR-PEG-NCLs-survivin sirna的基因沉默率为（96.7±1.2）%,EGFR-PEG-NCLs-MRP1 sirna的基因沉默率为（50.0±16.1）%,均有良好的基因沉默效果。此外,EGFR-PEG-NCLs-survivin sirna和EGFR-PEG-NCLs-MRP1 sirna转染进A549细胞后,A549细胞对顺铂的敏感性提高。体内组织分布结果显示,脂质体通过肺部吸入相对于尾静脉注射在肺部停留时间久,并且靶向性较好。抑瘤实验结果表明,顺铂（DDP）与EGFR-PEG-NCLs-survivin sirna与EGFR-PEG-NCLs-MRP1 sirna联合给药具有明显的抑制肿瘤生长的作用。H＆E染色结果表明,DDP与EGFR-PEG-NCLs-survivin sirna与EGFR-PEG-NCLs-MRP1 sirna联合给药对肿瘤的杀伤能力最强,且不会对各组织器官造成损伤,安全性较好。结论：本文制备的EGFR受体介导肺肿瘤靶向sirna脂多修饰脂质体（EGFR-PEG-NCLs-sirna）粒径均一,颗粒圆整,分散性和稳定性较好,EGFR靶向显著提高细胞摄取率,并且可以成功的从溶酶体中逃逸出来。它能很好地转运sirna,与顺铂联合用药可以发挥良好的体内外杀伤非小细胞肺癌A549细胞作用。

关键词： EGFR受体 survivin-sirna MRP1-sirna 荷正电类脂质肺部吸入

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