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stub1介导谷氨酸脱氢酶（GLUD1）泛素化在非小细胞肺癌中的功能及分子机制研究

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STUB1介导谷氨酸脱氢酶（GLUD1）泛素化在非小细胞肺癌中的功能及...

作者：雷嘉鹏南昌大学

学位级别：硕士

肺癌是我国发病率与死亡率最高的恶性肿瘤,非小细胞肺癌（NSCLC）作为主要的肺癌亚型,约占肺癌总体比例85%,对我国人民身体健康造成了巨大威胁。谷氨酸脱氢酶1（Glutamate dehydrogenase 1,GLUD1）是谷氨酰胺代谢中的关键酶之一,已有研... 详细信息

肺癌是我国发病率与死亡率最高的恶性肿瘤,非小细胞肺癌（NSCLC）作为主要的肺癌亚型,约占肺癌总体比例85%,对我国人民身体健康造成了巨大威胁。谷氨酸脱氢酶1（Glutamate dehydrogenase 1,GLUD1）是谷氨酰胺代谢中的关键酶之一,已有研究表明GLUD1促进了肿瘤的发生发展,但对于GLUD1在肿瘤中维持蛋白稳态的分子机制目前知之甚少。我们的研究显示,与癌旁组织相比,GLUD1的蛋白水平在肺癌组织中呈高表达。在非小细胞肺癌细胞中,敲低GLUD1的表达能够显著抑制肺癌细胞的增殖与迁移。进一步的研究结果显示,GLUD1在非小细胞肺癌中可通过泛素-蛋白酶体途径发生降解,我们发现E3泛素连接酶stub1可以与GLUD1相互结合并促使其发生K48形式的泛素化,继而导致GLUD1蛋白的降解,并且我们确定了第503位赖氨酸（K503）为stub1调控GLUD1的关键泛素化位点。因此,我们的研究明确了GLUD1在非小细胞肺癌增殖及迁移过程中的作用,阐明了stub1调控GLUD1蛋白稳态的分子机制,为以GLUD1为靶点开发肺癌治疗药物提供了理论依据。

关键词：谷氨酸脱氢酶1 stub1 泛素化非小细胞肺癌

CMTM6、stub1调控胃癌细胞PD-L1表达的相关性研究

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CMTM6、STUB1调控胃癌细胞PD-L1表达的相关性研究

作者：袁萌钰内蒙古医科大学

学位级别：硕士

目的:研究程序性死亡配体1(Programmed cell death 1 ligand 1,PD-L1)、CKLF样MARVEL跨膜域6(CKLF-like MARVEL Transmembrane Domain Containing 6,CMTM6)和STIP1同源和UBox含蛋白1(Recombinant STIP1 Homology and U-Box Containing Protein,stub1)在胃癌(Gastric cancer,GC)组织的表达,并分析PD-L1、CMTM6、stub1表达是否可以作为GC预后独立危险因素,验证CMTM6、stub1在GC中作为肿瘤分子标记物的潜在价值。阐明CMTM6、stub1对于GC细胞PD-L1表达的影响及其潜在的作用机制。方法:(1)通过R语言和在线数据库TIMER分析GC患者CMTM6、stub1、PD-L1的表达差异以及与肿瘤相关免疫细胞、MSI、TMB的相关性。(2)收集61例符合条件的GC患者临床病理资料,免疫组化染色方法(EnVision)检测PD-L1、stub1和CMTM6在GC组织以及癌旁组织的表达情况。统计学分析PD-L1、stub1及CMTM6的表达与GC临床病理特征的关系,以及三种蛋白之间的相关性,并分析CMTM6、stub1、PD-L1是否为GC预后独立危险因素。(3)培养胃粘膜上皮细胞系GES-1和GC细胞系MKN-45、SGC-7901。RT-qPCR和WB法检测CMTM6、stub1、PD-L1在GC细胞系和胃正常细胞系中的表达。将GC细胞系SGC-7901、MKN-45转染慢病毒CMTM6沉默载体(shCMTM6组),以转染阴性对照慢病毒的SGC-7901、MKN-45细胞为对照组(NC组),分别用RT-qPCR和WB法检测对照组与实验组CMTM6、PD-L1mRNA和蛋白表达量。在CMTM6慢病毒稳转株上构建以质粒为载体的stub1瞬转GC细胞株(pcDNAstub1组),质粒空载体为对照组(NC组),RT-qPCR和WB法检测对照组与实验组stub1、PD-L1mRNA和蛋白表达量。通过体外CCK-8实验探究CMTM6和stub1对GC细胞增殖的影响。结果:(1)生物信息学分析发现:在胃正常组织向GC进展的过程中,CMTM6、PD-L1的表达呈升高趋势,stub1则相反,差异均具有统计学意义(P1与CMTM6的表达呈正相关(r=0.42,P1);PD-L1与stub1的表达无相关性(r=-0.084,P=0.023)。分析CMTM6、stub1、PD-L1的表达与B Lym、CD8+T Lym、CD4+T Lym、M(?)的相关性可知,CMTM6的表达与M(?)(r=0.477,P1)一般相关;PD-L1的表达与CD8+T Lym(r=0.443,P1)、B Lym(r=-0.287,P1)一般相关。生物信息学显示,G C中CMTM6的表达与MSI、TMB均有关(P1、CMTM6及stub1的阳性表达分别是:78.69%(48/61)、77.05%(47/61)、45.90%(28/61),在正常胃组织中PD-L1、CMTM6及stub1的阳性表达分别是:32.79%(20/61)、32.79%(20/61)、77.05%(47/61)。在胃正常组织向GC进展的过程中,PD-L1、CMTM6的表达呈升高趋势,stub1蛋白则相反(Pstub1蛋白的表达与各临床特征均无关(P>0.05);GC组织中PD-L1蛋白的表达与患者的年龄、肿瘤直径、浸润程度、淋巴结转移、肿瘤相关免疫细胞及微卫星状态显著相关(Pstub1、PD-L1在GC组织的表达进行Spearman相关性分析,认为PD-L1和CMTM6的表达呈正相关(r=0.348,P=0.006);stub1与PD-L1的表达呈负相关(r=-0.255,P=0.048)。Kaplan-Meier法结果显示:GC中CMTM6高表达、PD-L1高表达、stub1低表达患者与OS缩短有关(P1mRNA和蛋白在SGC-7901、MKN-45中的表达量明显高于GES-1的表达量(P1);stub1mRNA和蛋白在SGC-7901、MKN-45中的表达量明显低于GES-1的表达量(P1)。敲减目的基因CMTM6后,SGC-7901和MKN-45中shCMTM6组PD-L1mRNA和蛋白的表达量与NC组相比均显著降低(P1);上调ST

关键词：胃癌 stub1 CMTM6 PD-L1 免疫机制

DAB2IP促进stub1泛素化HIF-1α调控肿瘤糖代谢的研究

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DAB2IP促进STUB1泛素化HIF-1α调控肿瘤糖代谢的研究

作者：贾唯艺华中科技大学

学位级别：硕士

目的:研究DAB2IP在调控肿瘤细胞葡萄糖代谢中的功能及相关机制。方法:(1)收集人乳腺癌组织切片及对应病人的F-FDG PET/CT检查结果,应用免疫组化实验对石蜡切片中DAB2IP的表达情况进行检测,分析DAB2IP免疫组化评分与F-FDG最大标准摄取值... 详细信息

目的:研究DAB2IP在调控肿瘤细胞葡萄糖代谢中的功能及相关机制。方法:(1)收集人乳腺癌组织切片及对应病人的F-FDG PET/CT检查结果,应用免疫组化实验对石蜡切片中DAB2IP的表达情况进行检测,分析DAB2IP免疫组化评分与F-FDG最大标准摄取值的相关性。(2)利用慢病毒系统,建立DAB2IP敲减、过表达乳腺癌细胞系及各自的阴性对照;通过裸鼠移植瘤模型,观察DAB2IP对肿瘤生长的影响;使用micro-PET/CT成像检测各组移植瘤对F-FDG的摄取能力;RT-q PCR及免疫组化实验分析移植瘤组织切片中DAB2IP表达改变对糖代谢相关蛋白的影响。(3)应用葡萄糖摄取实验、乳酸生成实验、ATP检测实验以及Seahorse XF糖酵解压力检测实验阐释DAB2IP在肿瘤细胞糖代谢中的作用;CCK8实验检测细胞增殖能力;RT-q PCR及Western blot实验分析DAB2IP表达改变对糖代谢相关蛋白的影响。(4)质谱分析寻找与DAB2IP结合的蛋白,免疫共沉淀实验证明DAB2IP与HIF-1α结合。RT-q PCR及Western blot实验检测DAB2IP表达水平对HIF-1αm RNA和蛋白水平的影响。Seahorse XF糖酵解压力检测实验、葡萄糖摄取实验、ATP检测实验验证HIF-1α在介导DAB2IP调控细胞糖代谢过程中的作用。(5)环己酰亚胺追踪实验、蛋白酶体抑制实验、泛素化实验阐释DAB2IP对HIF-1α的调控机制;蛋白质谱分析联合免疫共沉淀实验,确定介导DAB2IP促进HIF-1α泛素化降解的泛素连接酶;利用临近连接实验阐释DAB2IP对泛素连接酶与HIF-1α的调控作用。结果:(1)病例资料的分析表明,DAB2IP的免疫组化评分与乳腺癌SUV值呈负相关关系。(2)动物实验表明,DAB2IP敲减的乳腺癌细胞形成的移植瘤对F-FDG的摄取增加,生长更快;移植瘤组织切片中GLUT1、PGK1的m RNA和蛋白表达水平升高。DAB2IP过表达的乳腺癌细胞形成的移植瘤对F-FDG的摄取减少,生长变慢;移植瘤组织切片中GLUT1、PGK1的m RNA和蛋白表达水平下降。(3)细胞实验表明,乏氧条件下DAB2IP缺失不仅增强了细胞的糖摄取能力,上调了GLUT1、PGK1的表达水平;而且提高了细胞的糖酵解能力,增加了细胞内ATP的含量,促进了细胞增殖;而过表达DAB2IP则具有相反的调控作用。(4)乏氧条件下DAB2IP可以与HIF-1α结合,下调HIF-1α的蛋白水平;并且干扰HIF-1α可以逆转DAB2IP缺失对糖酵解、ATP含量及增殖的促进。(5)乏氧条件下,DAB2IP促进stub1与HIF-1α结合从而加速HIF-1α的泛素化降解。结论:DAB2IP促进stub1泛素化降解HIF-1α,抑制了乳腺癌细胞的葡萄糖摄取、糖酵解和增殖能力。

关键词：糖代谢糖酵解乏氧 DAB2IP HIF-1α stub1

stub1与幽门螺旋杆菌感染的肥胖儿童并发非酒精性脂肪性肝病的关系

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四川医学 2022年第7期43卷 637-641页

作者：白青山宋鹏于艳高慧唐山市妇幼保健院消化内科儿内科内科河北唐山063000

目的探究STIP1同源性和包含U-box蛋白1(stub1)与幽门螺旋杆菌(Hp)感染的肥胖儿童并发非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的关系。方法选择2019年2月至2020年7月就诊的387例Hp感染的肥胖儿童作为研究对象,根据是否合并NAFLD分为肥胖组(n=118)和NA... 详细信息

目的探究STIP1同源性和包含U-box蛋白1(stub1)与幽门螺旋杆菌(Hp)感染的肥胖儿童并发非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的关系。方法选择2019年2月至2020年7月就诊的387例Hp感染的肥胖儿童作为研究对象,根据是否合并NAFLD分为肥胖组(n=118)和NAFLD组(n=269)。收集年龄、性别、体质指数(BMI)、糖脂代谢和肝酶指标等;用Ficoll密度梯度离心法分离出外周血中单个核细胞;用蛋白质免疫印迹法检测单个核细胞中stub1表达水平。用受试者工作特征(ROC)曲线评价stub1判断Hp感染的肥胖儿童并发NAFLD的效能;用限制性立方样条拟合Logistic回归分析stub1与Hp感染的肥胖儿童并发NAFLD的关系;用Lasso回归分析Hp感染的肥胖儿童并发NAFLD的风险因素;构建列线图回归模型判断Hp感染的肥胖儿童是否并发NAFLD,用一致性指数(C-index)、校准曲线和决策树分析(DCA)评估模型的临床价值。结果肥胖组儿童BMI、空腹血糖(FBG)、胰岛素(FINS)、胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)水平均低于NAFLD组(Pstub1水平高于NAFLD组(Pstub1判断Hp感染的肥胖儿童并发NAFLD的受试者工作特征(ROC)曲线下面积、敏感度和特异度分别为0.813,83.64%和66.95%。stub1与Hp感染的肥胖儿童并发NAFLD呈线性关系。FBG、TC、TG和LDL-C均是Hp感染的肥胖儿童并发NAFLD的独立危险因素,stub1是Hp感染的肥胖儿童并发NAFLD的独立保护因素。由FBG、TC、TG、LDL-C和stub1构建的列线图回归模型的C-index和平均绝对误差值分别为0.975和0.014,该模型判断Hp感染的肥胖儿童并发NAFLD的净收益较高。结论stub1水平低提示Hp感染的肥胖儿童并发NAFLD的风险高。基于stub1构建的列线图回归模型有很高的区分度、精准度及临床应用价值,可辅助判断Hp感染的肥胖儿童并发NAFLD。

关键词：非酒精性脂肪性肝病儿童 stub1 幽门螺旋杆菌肥胖

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辅助伴侣蛋白stub1及其功能研究进展

中国药理学通报 2011年第10期27卷 1345-1348页

作者：吕涛张癸荣总后卫生部药品仪器检验所生物制品实验室北京100071

stub 1分子是一类新型的辅助性伴侣蛋白,在蛋白质折叠、组装、转运和降解中起着重要的调节作用,属于泛素连接酶。stub 1具有E3泛素连接酶活性,能与Hsp70、Hsp90或者其它分子伴侣结合,促进底物的连接和链的延伸。stub 1具有调控阿尔采末... 详细信息

stub 1分子是一类新型的辅助性伴侣蛋白,在蛋白质折叠、组装、转运和降解中起着重要的调节作用,属于泛素连接酶。stub 1具有E3泛素连接酶活性,能与Hsp70、Hsp90或者其它分子伴侣结合,促进底物的连接和链的延伸。stub 1具有调控阿尔采末病、帕金森病、麦-考二氏综合征等神经退行性疾病相关的tau蛋白、Aβ、α-突触核蛋白、MKKS突变体等降解的作用;同时stub1还受辅助伴侣蛋白HspBP1及细胞激酶Akt的调控。现将辅助伴侣蛋白stub 1及其在不同疾病中的调节功能研究进展综述如下。

关键词： stub1 泛素连接酶神经退行性疾病辅助伴侣蛋白降解分子开关

stub1、TFEB和LC3-Ⅱ在IMN患者中的表达及其意义

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STUB1、TFEB和LC3-Ⅱ在IMN患者中的表达及其意义

作者：田梦蕾河北医科大学

学位级别：硕士

目的:分子伴侣蛋白stub1(STIP1 homologous and U box containing protein1,stub1)又名CHIP(carboxy terminus of Hsp70 interacting protein,CHIP),是一种新型的辅助伴侣蛋白,与泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system,UPS)中泛素连接酶E3指环结构(RING finger)相似,也具有泛素连接酶的功能,可泛素化修饰底物蛋白,调节后者的生物学功能。转录因子EB(transcription factor EB,TFEB)是Mi TF/TFE(microphthalmia-transcription factor E)家族中的一员,主要通过影响其磷酸化水平实现转录活性的调控,其结构变化和调控功能被一系列蛋白分子严格调控。TFEB可通过磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,PKB)通路、ROS通路、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,m TOR)通路、核因子-κB(NF-κB)通路等多种信号通路参与调控自噬。自噬作为真核细胞高度保守的一种天然防御机制,在多种肾脏疾病的发生发展中发挥重要“纠错”作用。微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)是自噬体形成的标志,主要包含:胞浆型LC3(LC3-Ⅰ)和膜型LC3(LC3-Ⅱ)两种类型。当自噬发生时,LC3-Ⅰ发生酶解反应,分解掉一段多肽后转化成LC3-Ⅱ,检测LC3-Ⅱ可估计自噬水平的高低。本文旨在通过观察stub1、TFEB及LC3-Ⅱ在特发性膜性肾病(idiopathic membranous nephropathy,IMN)患者肾组织中的表达水平,探讨自噬与IMN发生发展的关系及stub1、TFEB参与自噬调控的可能机制。方法:收集于2018.12-2019.06河北医科大学第三医院肾内科首次行肾穿刺活检且病理诊断为特发性膜性肾病的患者52例为观察组,其中IMN-Ⅰ、IMN-Ⅱ、IMN-Ⅲ分别有25例、17例、10例(n=25、n=17、n=10);泌尿外科行肾脏切除术患者6例(n=6)的瘤旁组织为对照组。采用PASM+MASSON观察肾组织切片的形态学变化,采用免疫组织化学染色方法观察各组肾组织石蜡切片中stub1、TFEB和LC3-Ⅱ的表达水平,半定量测定分析三者之间的联系。结果:1.一般临床资料(见表1):观察组与对照组性别比约为1:1,年龄和24小时尿蛋白定量差异有统计学意义(P0.05)。2.免疫组织化学染色:stub1在对照组和观察组肾组织中于肾小球系膜细胞核与胞浆均表达,观察组较对照组表达增强(P1)。TFEB在对照组肾组织中仅在肾小管上皮细胞少量散在表达;其在观察组的肾小球系膜细胞和肾小管上皮细胞胞浆表达,以肾小管上皮细胞表达为主,较对照组表达增强(P1)。LC3-Ⅱ在对照组肾组织中于肾小球系膜细胞和肾小管上皮细胞均有较少量表达,以肾小管上皮细胞表达为主;其在观察组肾组织的肾小球上皮细胞和肾小管上皮细胞表达增强(P1)。三个因子分别在IMN-Ⅰ、IMN-Ⅱ与IMN-Ⅲ中的表达量均逐渐增多(P1)。观察组与对照组相比,stub1和TFEB与TFEB和LC3-Ⅱ的表达量均成正相关。结论:自噬参与成人IMN的发生发展;其可能机制为stub1作为TFEB的独立修饰蛋白,可能通过泛素化修饰底物蛋白TFEB,进而调控自噬水平。

关键词： stub1 TFEB LC3-Ⅱ 自噬泛素-蛋白酶体系统原发性膜性肾病

泛素连接酶stub1对TFEB降解作用机制的研究

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泛素连接酶Stub1对TFEB降解作用机制的研究

作者：胡启婧大连医科大学

学位级别：硕士

目的:TFEB是MiTF/TFE家族重要的转录组成因子之一,它是PI3k-Akt-mTOR信号通路上的一个下游因子,其功能活性受mTOR受体蛋白的调控,参与很多的病理生理过程,与很多疾病的发生发展密切相关,它在溶酶体功能、细胞自噬以及脂质代谢和能量代... 详细信息

目的:TFEB是MiTF/TFE家族重要的转录组成因子之一,它是PI3k-Akt-mTOR信号通路上的一个下游因子,其功能活性受mTOR受体蛋白的调控,参与很多的病理生理过程,与很多疾病的发生发展密切相关,它在溶酶体功能、细胞自噬以及脂质代谢和能量代谢中有着重要作用,同时也参与细胞应激、免疫应答、细胞内清除、线粒体生物功能等过程。正常情况下,TFEB位于细胞质中,功能处于抑制状态。因为在正常功能状态下,溶酶体功能正常,溶酶体表面的Rag蛋白、GTP酶等一些小分子物质可招募mTORC1蛋白于溶酶体表面并激活mTORC1,同时这些小分子物质也会招募TFEB蛋白于溶酶体表面,在这里,具有活性的mTORC1可以使TFEB磷酸化并且失活,功能处于抑制状态,并与惰性蛋白14-3-3结合,存留于细胞质中。而在饥饿、应激、压力、溶酶体功能障碍、线粒体损伤、细菌感染等异常情况下,TFEB的功能会被激活,此时的mTORC1从溶酶体膜上释放并变的不活跃,失去对TFEB的磷酸化作用,而TFEB在相关钙离子的作用下去磷酸化并具有活性,自由进入细胞核,进行相应基因的转录,发挥相应的功能。通过追踪大量对TFEB的研究发现,TFEB有可能是泛素连接酶stub1的一个底物(stub1,STIP1同源和包含U-Box区域的蛋白1,由于其C端含有与HSC70相互作用的蛋白,故又称CHIP)。E3泛素连接酶stub1,它在底物识别和催化泛素转移以及决定泛素化底物的多样性和选择性方面具有重要作用。有文献表明,stub1可以调节TFEB的活性,stub1优先与磷酸化的TFEB结合并通过泛素化蛋白酶体途径使其降解,使磷酸化的TFEB与非磷酸化的TFEB之间形成的异源二聚体减少,从而使有活性的TFEB的数量和核易位增加,调节自噬转录和溶酶体的基因水平。也就是说,E3泛素连接酶stub1可以通过调节TFEB的活性来调节细胞自噬、线粒体功能、溶酶体生物合成等其它相应的功能。但由于stub1对TFEB的作用和降解机制还不清楚,我们为此进行深入的研究和探索,这是本课题主要的研究目的和内容。VCP(Valosin-containing protein,含缬酪肽蛋白)是一种重要的II型三磷酸腺苷(ATP)酶,一种分布很广泛的ATP酶,N端和C端主要与衔接蛋白或辅助蛋白相互作用,能结合多泛素链,负责识别底物。细胞内含量丰富且结构保守,它在内质网相关蛋白降解、自噬等途径中起着重要作用,它可将蛋白分子从蛋白质组件、内质网、细胞器膜和染色质等大细胞结构中分离出来,通过蛋白水解酶促进其降解,是蛋白质泛素化降解所必需的一种酶,存在于所有真核生物和原始细菌中。在泛素连接酶stub1对底物TFEB降解的过程中,连接酶stub1与结合泛素的结合酶E2结合并将泛素连接到靶蛋白TFEB上,其次stub1需要与VCP蛋白进行结合,进而识别结合底物TFEB并转运至26s蛋白酶体上,26s蛋白酶体可特异性地识别这个带有泛素标签的底物蛋白,并将其降解。VCP蛋白目前已被证明参与多种细胞活动,包括有丝分裂、同型膜融合、内质网相关降解机制的核转录调控,并参与泛素依赖的蛋白质降解。有报道,VCP与细胞凋亡、癌症的侵袭和转移密切相关。SVIP(small VCP/p97-interacting protein),是一种能与VCP/p97蛋白相互作用并结合的一种小分子蛋白,与极低密度脂蛋白的分泌和转运有关。有研究发现,SVIP含有能与VCP/p97蛋白结合的结构域VIM,stub1含有可与VCP/p97蛋白结合的结构域VBM,但结构域VIM与VCP/p97蛋白的结合作用强于结构域VBM,也就是说结构域VIM可以优先与VCP/p97蛋白结合并对结构域VBM形成竞争性抑制。从理论上讲,SVIP可以竞争性抑制stub1与VCP/p97蛋白的结合,抑制stub1对TFEB蛋白的降解作用,但具体结果还需要进行研究与验证。因此,如果能阐明stub1对TFEB的作用和降解机制以及SVIP是否可以抑制这种作用,那么就可以从多方面对TFEB的活性与功能、合成与降解进行调控,从而实现相应的目的。于是对stub1与它的其它一些底物作用和降解的机制进行研究,发现了与这些底物作用的功能结合域,进而分析可能与TFEB结合和作用的功能结构域,并构建缺失这些功能域的TFEB突变体,观察stub1对TFEB野生体和突变体的作用,探讨stub1对TFEB的作用和降解机制,为TFEB的调控提供新的理论基础,为疾病的治疗和科学研究提供新的思路和方法。方法:(1)通过序列比对及分子生物学软件查找出TFEB上可能与stub1结合的氨基酸序列。(2)运用定点突变技术构建TFEB的突变体TFEB-Mutation,通过RT-PCR技术对突变结果进行筛选和鉴定。(3)利用Western blot技术和免疫荧光显微共聚焦技术观察TFEB野生体和突变体在细胞中的表达情况。

关键词： stub1 TFEB SVIP 泛素蛋白酶体途径(UPP) 自噬

家族性FSGS初筛致病基因stub1、TCF7L1、ADCK1在小鼠阿霉素肾病模型中的表达

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家族性FSGS初筛致病基因STUB1、TCF7L1、ADCK1在小鼠阿霉素肾病模...

作者：赵嘉懿河北医科大学

学位级别：硕士

目的:基因突变在局灶节段性肾小球硬化(focal segmental glomerulosclerosis,FSGS)发病中起关键作用,前期研究推断19个基因可能与家族性局灶节段性肾小球硬化(familial focal segmental glomerulosclerosis,FFSGS)发病相关。本研究通过检测阿霉素小鼠肾组织中stub1、TCF7L1、ADCK1的mRNA及编码蛋白水平,证实三个基因的致病性。方法:1.健康SPF级8周龄雄性Balb/c小鼠21只,适应性喂养7天后随机分为对照组9只、模型组12只,并于两组随机各取3只留取24小时尿液。随后将模型组小鼠给予单次尾静脉注射阿霉素(Adriamycin,ADR)10.5mg/kg制作FSGS肾病模型,对照组小鼠给予单次尾静脉注射等量生理盐水。2.于造模后第7天末、21天末各组分别随机取3只,第35天末取剩余小鼠留取24小时尿液,通过眼眶采血方式收集血标本后处死小鼠,取出一侧肾脏甲醛固定,另一侧肾脏液氮冻存。3.将每个时间点的24小时尿液标本用于检测24小时尿蛋白定量;血标本用于检测血肌酐、尿素氮水平;肾组织行过碘酸希夫(PAS)染色,光镜下观察病理变化。4.取第35天模型组与对照组小鼠肾组织提取RNA,反转录后行RT-PCR观察stub1、TCF7L1、ADCK1表达量的改变。5.利用免疫组织化学和免疫印迹(Western blot)试验方法检测肾组织stub1、TCF7L1、ADCK1蛋白的表达变化。6.采用SPSS 23.0软件对结果进行统计分析。P1.FSGS小鼠模型构建:模型组显示在第7天24小时尿蛋白定量开始上升,第21天仍持续升高,且明显高于对照组(P1),于第35天达到高峰,仍明显高于对照组(P1天可见肾小球系膜细胞和系膜基质增生,肾小管可见蛋白管型,第35天出现肾小球系膜细胞和系膜基质中、重度增生,节段加重,肾小球出现节段性硬化,同时可见大量蛋白管型,对照组肾小球及肾小管无变化,提示小鼠FSGS肾病模型构建成功。2.stub1、TCF7L1、ADCK1的m RNA水平:模型组小鼠肾组织在注射阿霉素35天后,stub1的mRNA表达量较对照组明显下降(P1);TCF7L1、ADCK1的m RNA表达量较对照组无显著差异。3.stub1、TCF7L1、ADCK1的蛋白水平(1)免疫组织化学染色:stub1在模型组中的表达以肾小球上皮细胞和肾小管为主,系膜区几乎未见表达,对照组在肾小球上皮细胞和系膜区存在少量散在表达而在肾小管上皮细胞中强表达,与对照组相比,模型组stub1表达量明显减少,差异有统计学意义(P1);TCF7L1于模型组与对照组均未见阳性表达;ADCK1在模型组中以肾小球上皮细胞、系膜区及基底膜表达较强,肾小管上较弱,与对照组表达位置基本一致,表达量与对照组相比亦无明显差异。(2)免疫印迹:注射阿霉素35天后模型组小鼠肾组织stub1蛋白表达明显减少(P1),而TCF7L1及ADCK1蛋白表达量与对照组相比无明显差异。结论:1.stub1参与了阿霉素诱导的小鼠FSGS的发病,其于肾小球上皮细胞和肾小管表达量的下调,提示其可能参与足细胞的病变过程及水肿的发生发展,其突变的致病性后期仍需在大量患有FSGS的人群的家系中进行进一步验证;2.TCF7L1和ADCK1与FSGS发病无直接相关关系,是否通过调控其他基因致FSGS的机制仍有待进一步研究。

关键词：局灶节段肾小球硬化家族性FSGS stub1 TCF7L1 ADCK1

MLL5 suppresses antiviral innate immune response by facilitating stub1-mediated RIG-I degradation

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MLL5 suppresses antiviral innate immune response by facilita...