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ssa抗原的克隆表达及其抗体检测方法的建立

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SSA抗原的克隆表达及其抗体检测方法的建立

作者：郑宗富福建医科大学

学位级别：硕士

【目的】构建pPIC9k-ssa重组质粒,采用巴斯德毕赤酵母SMD1168表达系统表达ssa蛋白,对表达的蛋白产物进行纯化,并对ssa的抗原性质进行研究,建立相关的方法学检测。【方法】 1.分离、培养人白血病淋巴细胞HL-60株,提取其RNA,以RNA为模板... 详细信息

【目的】构建pPIC9k-ssa重组质粒,采用巴斯德毕赤酵母SMD1168表达系统表达ssa蛋白,对表达的蛋白产物进行纯化,并对ssa的抗原性质进行研究,建立相关的方法学检测。【方法】 1.分离、培养人白血病淋巴细胞HL-60株,提取其RNA,以RNA为模板,通过反转录得到cDNA,再以cDNA为模板扩增出ssa基因。 2.将ssa基因转入pPIC9k质粒构建pPIC9k-ssa重组质粒,并将重组质粒电转化导入毕赤酵母菌SMD1168真核表达系统进行诱导表达,对产物进行初步纯化。 3.将获得的ssa蛋白作为抗原,建立免疫斑点金渗虑法检测抗ssa抗体,以期为临床提供常规检测项目。 4.对获得的ssa蛋白进行相关的抗原性研究。 5.收集经ENA抗体谱检测抗ssa抗体阳性的SS病人血清作为阳性对照,收集经ENA抗体谱检测全阴性的健康体检者血清作为阴性对照,用于验证所建立的斑点免疫金渗虑法的敏感性、特异性及稳定性等。【结果】 1.从人白血病cDNA文库中扩增出人ssa基因,成功构建pPIC9k-ssa重组质粒。 2.将pPIC9k-ssa重组质粒导入毕赤酵母菌SMD1168真核表达系统中,获得稳定整合目的基因的菌株。 3.重组菌株经诱导表达出产物相对分子量约为50 kDa的ssa蛋白,可与抗ssa抗体特异性结合。 4.建立检测ssa抗体的斑点免疫金渗虑法方法。【结论】本实验室通过分子克隆技术,从毕赤酵母菌SMD1168真核表达系统中获得了人ssa抗原,应用初步纯化的真核表达产物(抗原)建立DIGFA法检测抗ssa抗体,敏感性和特异性与IB法相近,由于受到抗原纯化技术、样本数量、时间等的限制,本法的特异性、试剂的稳定性等有待进一步研究,但本法具有简便、快速和经济等优点,待进一步完善后值得在临床上的推广应用。

关键词： ssa抗原真核表达 ssa抗体斑点免疫金渗滤法

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牛胸腺提取液中的ssa抗原及其临床应用

中国免疫学杂志 1989年第5期5卷 282-284页

作者：董怡陈培珍史艳萍张乃峥杜德顺甘燕军文竹箴北京协和医院口腔科北京100730 北京协和医院内科北京100730

抗ssa抗体是一个较常见的抗核抗体。有人提出它是诊断干燥综合征的指标之一,因此在鉴别结缔组织病的类别时有着重要的作用。在日常临床工作中测定抗ssa抗体所用的抗原都来自Wil-2细胞、人脾提出液,由于国内大部分医院提取这样的抗原有... 详细信息

抗ssa抗体是一个较常见的抗核抗体。有人提出它是诊断干燥综合征的指标之一,因此在鉴别结缔组织病的类别时有着重要的作用。在日常临床工作中测定抗ssa抗体所用的抗原都来自Wil-2细胞、人脾提出液,由于国内大部分医院提取这样的抗原有一定的困难.因此应用尚不普遍。我室经数年的工作实践和系列观察,证实不论在兔或牛胸腺的提取液中都含有ssa抗原,因此可利用此特性来简化临床的测定步骤。现将有关的结果报道如下。

关键词：牛胸腺 ssa抗原提取液

60 kD人ssa抗原表位免疫反应的特异性

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中华风湿病学杂志 1998年第1期2卷 5-9页

作者：张奉春 JohnB.Harley R.HalScofield 董怡中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院

目的：根据６０ｋＤＳＳＡ抗原分子不同表位的氨基酸序列，人工合成多倍体寡肽抗原表位（ｍｕｌｔｉｐｌｅａｎｔｉｇｅｎｉｃｐｅｐｔｉｄｅｓ，ＭＡＰｓ），以检测这些表位的免疫特性。方法：用ＭＡＰｓ做亲和层析柱，用抗ＳＳＡ抗体... 详细信息

目的：根据６０ｋＤＳＳＡ抗原分子不同表位的氨基酸序列，人工合成多倍体寡肽抗原表位（ｍｕｌｔｉｐｌｅａｎｔｉｇｅｎｉｃｐｅｐｔｉｄｅｓ，ＭＡＰｓ），以检测这些表位的免疫特性。方法：用ＭＡＰｓ做亲和层析柱，用抗ＳＳＡ抗体的病人血清过柱，纯化抗ＭＡＰｓ抗体。这些纯化后的抗ＭＡＰｓ抗体可与６０ｋＤＳＳＡ抗原及ＭＡＰｓ反应。这种反应能被６０ｋＤＳＳＡ抗原及相对应的ＭＡＰｓ抑制。以ＭＡＰｓ做抗原检测６７份具有抗ＳＳＡ抗体的血清。结果：６７份病人血清中，６３份阳性，阳性率９４％，这些血清结合的ＭＡＰｓ不同，可以从１至２０个ＭＡＰｓ不等。结论：研究表明，６０ｋＤＳＳＡＭＡＰｓ保留了６０ｋＤＳＳＡ抗原的抗原性。

关键词： ssa抗原抗原表位 60kD 免疫特性

不同表位60000ssa抗原免疫小鼠的反应

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中华风湿病学杂志 2007年第2期11卷 70-73页

作者：徐东刘莉佟胜全张奉春中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院风湿免疫科 100730 唐山工人医院风湿免疫科

目的了解不同表位60000ssa抗原免疫小鼠后的反应，能否产生相应的抗体及不同的组织损伤。方法用60000ssa的多倍体寡肽抗原（MAPs）免疫小鼠，利用酶联免疫吸附法（ELISA）检测其是否产生了相应的自身抗体。并取其心肝肾等组织器官行病... 详细信息

目的了解不同表位60000ssa抗原免疫小鼠后的反应，能否产生相应的抗体及不同的组织损伤。方法用60000ssa的多倍体寡肽抗原（MAPs）免疫小鼠，利用酶联免疫吸附法（ELISA）检测其是否产生了相应的自身抗体。并取其心肝肾等组织器官行病理学及免疫组织化学检查。结果各组小鼠均产生了抗多个表位的抗体．尤其是482～495组小鼠除产生抗482～495MAP抗体外，还对198-210组、212～219组、449～460组MAPs发生了免疫反应。但其余各组小鼠产生的抗体似无明显规律性。佐剂组小鼠及正常小鼠心、肝、肾脏免疫组织化学均呈阴性：482--495组、166～180组、401～411组小鼠心脏免疫组织化学均呈阴性，肝脏免疫组织化学80％呈阳性，部分小鼠肾脏免疫组织化学呈可疑阳性；各组小鼠心、肝、肾脏切片HE染色均未见明显形态学异常，与正常鼠无明显差异。结论MAPs具有免疫原性。经一种MAP免疫的小鼠可以产生对多种MAPs发生免疫反应的多克降抗体。并造成脏器损伤。

关键词：表位 ssa抗原抗体小鼠

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60000ssa抗原的提取及纯化

中华风湿病学杂志 2003年第1期7卷 10-13页

作者：徐东张奉春甘晓丹唐福林董怡中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院风湿免疫科 100730

目的　建立用于临床检验及研究的ssa 6 0 0 0 0抗原的提取及纯化方法。方法　利用牛脾组织提取粗抗原 ,采用阴离子交换层析法 (IEC)进行初纯化 ,再分别以分子筛及亲和层析法进一步提纯 ,并利用对流免疫电泳 (CIE)、免疫扩散 (ID)及免疫... 详细信息

目的　建立用于临床检验及研究的ssa 6 0 0 0 0抗原的提取及纯化方法。方法　利用牛脾组织提取粗抗原 ,采用阴离子交换层析法 (IEC)进行初纯化 ,再分别以分子筛及亲和层析法进一步提纯 ,并利用对流免疫电泳 (CIE)、免疫扩散 (ID)及免疫印迹 (IBT)法检测各纯化阶段提取液中的 6 0 0 0 0ssa抗原。结果　IEC(DE5 2 )初步提纯ssa抗原效佳。 0 15～ 0 35mol/LNaCl(溶于 0 0 1mol/L磷酸盐缓冲液pH 7 2中 )是最佳洗脱范围 ;分子筛方法 (SephadexG 10 0 )作为ssa抗原的进一步提纯方法不理想 ,杂蛋白存留较多。但可作为用于分析目的的初纯化方法 ;亲和层析方法可进一步纯化出 6 0 0 0 0ssa抗原。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)转膜后氨基黑染色见只有一条条带位于 6 70 0 0～ 4 30 0 0。进一步行IBT证实其为 6 0 0 0 0ssa抗原。结论　利用牛脾粗抗原经IEC、亲和层析的方法提纯 6 0 0 0 0ssa抗原操作简便 ,纯化效果好 ,价格不高 ,能够成功地制备6 0 0 0 0ssa抗原 ,为开展 6 0 0 0 0ssa抗原在疾病中作用的研究创造了条件。

关键词： ssa抗原提取纯化离子交换色谱法凝胶色谱法亲和色谱法

利用毕赤酵母菌SMD1168表达ssa重组抗原

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中国人兽共患病学报 2008年第10期24卷 956-959页

作者：郑宗富兰小鹏杨湘越苏东辉南京军区福州总院476临床部福州350002 南京军区福州总院福建医科大学

目的利用电穿孔法将pPIC9k-ssa重组质粒导入毕赤酵母菌SMD1168真核表达系统进行诱导表达,获得ssa重组抗原。方法以人白血病淋巴细胞HL-60株为模板扩增ssa基因,将其转入pPIC9k质粒构建pPIC9k-ssa重组质粒,采用电穿孔法将其导入毕赤酵母菌... 详细信息

目的利用电穿孔法将pPIC9k-ssa重组质粒导入毕赤酵母菌SMD1168真核表达系统进行诱导表达,获得ssa重组抗原。方法以人白血病淋巴细胞HL-60株为模板扩增ssa基因,将其转入pPIC9k质粒构建pPIC9k-ssa重组质粒,采用电穿孔法将其导入毕赤酵母菌SMD1168真核表达系统进行诱导表达,获取目的蛋白。结果成功构建pPIC9k-ssa重组质粒并导入毕赤酵母菌SMD1168真核表达系统中,获得稳定整合目的基因的菌株;重组菌株经诱导表达出产物相对分子量约为50kDa的ssa蛋白,具有抗原性可与ssa抗体特异性结合。结论本实验室通过分子克隆技术,从毕赤酵母菌SMD1168真核表达系统中获得了人ssa抗原,为今后建立斑点免疫金渗滤法(DIGFA)法检测抗ssa抗体奠定基础。

关键词： ssa抗原真核表达 ssa抗体斑点免疫金渗滤法

抗60000 ssa和52000 ssa抗体与系统性红斑狼疮和干燥综合征相关性的研究

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中华医学杂志 2007年第1期87卷 7-10页

作者：张奉春刘莉徐东中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院风湿免疫科 100730

目的了解抗60000 ssa(Sjogren syndrome Type A,ssa)抗体和抗52 000 ssa 抗体与系统性红斑狼疮(SLE)和干燥综合征(SS)的相关性。方法用免疫印迹(Western-blot)方法检测59例抗 ssa 抗体阳性患者血清,其中 SLE 44例,原发性 SS 15例。结果... 详细信息

目的了解抗60000 ssa(Sjogren syndrome Type A,ssa)抗体和抗52 000 ssa 抗体与系统性红斑狼疮(SLE)和干燥综合征(SS)的相关性。方法用免疫印迹(Western-blot)方法检测59例抗 ssa 抗体阳性患者血清,其中 SLE 44例,原发性 SS 15例。结果抗60000 ssa 抗体阳性率在SLE 及原发性 SS 间差异无统计学意义(P>0.05),但单独携带抗60000 ssa 抗体在 SLE 及原发性 SS间差异有统计学意义,SLE 患者单独抗60000 ssa 抗体阳性率为39.47%(15/38),原发性 SS 患者6.67%(1/15);抗52000 ssa 抗体阳性率在 SLE 及原发性 SS 间差异有统计学意义(Pssa 抗体阳性率为93.33%(14/15),SLE 患者为60.53%(23/38)。抗60000和抗52000 ssa 抗体阳性率在继发性 SS 及原发性 SS 间差异均无统计学意义。结论原发性 SS 患者以抗52000 ssa 抗体为主,单独出现抗60000 ssa 抗体的几率极小。单独抗52000 ssa 抗体阳性可能与原发性 SS 有关,而不利于继发性 SS 的诊断。单独携带抗60000ssa 抗体则以 SLE 为主。

关键词：红斑狼疮,系统性干燥综合征 ssa抗原

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重组抗原检测抗干燥综合征A抗原的自身抗体

中华检验医学杂志 2000年第2期23卷 106-108页

作者：邓安梅仲人前陈孙孝施笑梅孔宪涛第二军医大学长征医院全军临床免疫中心上海200003

目的　建立便捷的检测抗干燥综合征 (SS)A抗原 (分子量为 6 0 0 0 0的多肽成分 )的自身抗体 (抗ssa)的方法 ,以利于疾病的早期诊断和病程监控。方法　构建基因工程菌 ,表达ssa 6 0 0 0 0融合蛋白。经GST柱层析法纯化后 ,分别经免疫印迹 ... 详细信息

目的　建立便捷的检测抗干燥综合征 (SS)A抗原 (分子量为 6 0 0 0 0的多肽成分 )的自身抗体 (抗ssa)的方法 ,以利于疾病的早期诊断和病程监控。方法　构建基因工程菌 ,表达ssa 6 0 0 0 0融合蛋白。经GST柱层析法纯化后 ,分别经免疫印迹 (IBT)法和酶联免疫吸附法 (ELISA)检测 2 0份SS患者血清、6 0份系统性红斑狼疮 (SLE)患者血清和 30份正常人血清。结果　利用重组抗原检测抗ssa自身抗体敏感性较高 ,而且抗体滴度与SLE病程相关。用IBT法 ,SLE和SS患者的阳性率分别为43 3%和 10 % ;用ELISA法 ,SLE和SS患者的阳性率分别为 5 0 %和 2 5 %。结论　利用重组抗原对自身抗体进行定性、定量分析有助于对自身免疫病的诊断和监控。

关键词：干燥综合征 ssa抗原 ELISA 系统性红斑狼疮

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抗ssa/Ro抗体研究的新进展

江西医学检验 2006年第3期24卷 245-246页

作者：吴文冰兰小鹏福建医科大学福总临床医学院全军检验中心福州350025

1979年Alspaugh等[1]使用培养人淋巴细胞提取物与原发性Sjogren's综合征(pSS)患者的血清进行研究,发现该提取物中含有两种新的自身核抗原即ssa和SSB抗原,1979年Alspaugh[2]与Clark又证明ssa抗原与Clark1968年发现的Ro抗原是同一种物质,... 详细信息

1979年Alspaugh等[1]使用培养人淋巴细胞提取物与原发性Sjogren's综合征(pSS)患者的血清进行研究,发现该提取物中含有两种新的自身核抗原即ssa和SSB抗原,1979年Alspaugh[2]与Clark又证明ssa抗原与Clark1968年发现的Ro抗原是同一种物质,故命名为ssa/Ro抗原,针对ssa/Ro抗原的自身抗体是已知的核糖核蛋白(ribonucleoprotein complex,RNP)抗体中分布最广、最常见的自身抗体之一.

关键词：抗ssa/Ro抗体 ssa/Ro抗原自身抗体人淋巴细胞自身核抗原 ssa抗原核糖核蛋白综合征 B抗原提取物