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微生物学报 2022年第3期62卷 1150-1165页

作者：邵文举鲁尚昆张爱利河北工业大学化工学院天津300130

【目的】本论文研究酿酒酵母srp40^(39)突变基因对酵母细胞异丁醇耐受性的影响。【方法】首先,以酿酒酵母野生型W303-1A和突变株EMS39染色体DNA为模板克隆野生型srp40基因和srp40^(39)突变基因;然后,将野生型srp40基因和srp40^(39)突变... 详细信息

【目的】本论文研究酿酒酵母srp40^(39)突变基因对酵母细胞异丁醇耐受性的影响。【方法】首先,以酿酒酵母野生型W303-1A和突变株EMS39染色体DNA为模板克隆野生型srp40基因和srp40^(39)突变基因;然后,将野生型srp40基因和srp40^(39)突变基因分别连接到质粒YCplac22上,构建质粒YCplac22-srp40和YCplac22-srp40^(39)。将质粒YCplac22-srp40、YCplac22-srp40^(39)以及YCplac22空质粒分别转化入野生型酿酒酵母W303-1A中,分别得到W303-1A-srp40工程菌、W303-1A-srp40^(39)工程菌和W303-1A-control工程菌。将3株工程菌分别置于含1.0%异丁醇、1.3%异丁醇、8.0%乙醇和0.5%异戊醇的CM培养基中进行发酵,测定细胞密度(OD_(600))和生长情况,并计算2–10 h的比生长速率(μ)。将3株工程菌于55°C热激4 min后做稀释实验(dilution),观察它们在平板上的生长情况。最后,对野生型srp40基因、srp40^(39)突变基因的氨基酸序列进行生物信息学分析。【结果】在不含异丁醇(0%异丁醇)的培养基中,3株工程菌无明显差异。在含1.0%异丁醇和1.3%异丁醇的CM培养基中,发酵24 h工程菌W303-1A-srp40^(39)的细胞密度分别是工程菌W303-1A-srp40的1.12倍和1.06倍,是工程菌W303-1A-control的1.10倍和1.10倍;工程菌W303-1A-srp40^(39)的比生长速率(μ)分别是工程菌W303-1A-srp40的1.07倍和1.10倍,是对照菌W303-1A-control的1.10倍和1.10倍。在含8.0%乙醇和0.5%异戊醇的CM培养基中,发酵24h工程菌W303-1A-srp40^(39)的细胞密度分别是工程菌W303-1A-srp40的1.12倍和1.01倍,是对照菌W303-1A-control的1.17倍和1.07倍;工程菌W303-1A-srp40^(39)的比生长速率(μ)分别是工程菌W303-1A-srp40的1.37倍和1.07倍,是对照菌W303-1A-control的1.31倍和1.09倍。工程菌W303-1A-srp40^(39)在热激后生长仍优于其他2株菌。生物信息学分析发现,srp40^(39)蛋白与硅藻的胸膜蛋白-1具有相似的结构。【结论】本研究发现酿酒酵母srp40^(39)突变基因能够提升细胞的异丁醇耐受性,此外对提升细胞的乙醇耐受性、异戊醇耐受性和耐热性也有一定的作用。同时,我们发现srp40^(39)蛋白与硅藻的胸膜蛋白-1具有相似的结构,说明其可能具有胸膜蛋白-1的功能,推测该蛋白在细胞壁维持方面有作用。这些研究将为提高酿酒酵母对乙醇、异丁醇、异戊醇和高温等的抗逆性提供新思路。

关键词：酿酒酵母 srp40 异丁醇乙醇耐受性

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酿酒酵母srp4039基因的克隆与功能研究

酿酒酵母srp4039基因的克隆与功能研究

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作者：邵文举河北工业大学

学位级别：硕士

异丁醇对酿酒酵母的毒害作用限制了酿酒酵母产异丁醇所能达到的最高产量,因此构建耐异丁醇的酿酒酵母菌株对异丁醇生产有重要意义。本工作以实验室前期诱变的酿酒酵母突变株EMS39和野生型酿酒酵母W303-1A为出发菌株,从突变株EMS39中克隆... 详细信息

异丁醇对酿酒酵母的毒害作用限制了酿酒酵母产异丁醇所能达到的最高产量,因此构建耐异丁醇的酿酒酵母菌株对异丁醇生产有重要意义。本工作以实验室前期诱变的酿酒酵母突变株EMS39和野生型酿酒酵母W303-1A为出发菌株,从突变株EMS39中克隆出srp40、wsc2和spt6突变基因,从野生型菌株W303-1A中克隆出srp40、WSC2、SPT6、AQY1、OLE1、CWP1和CWP2基因,探究以上基因对酵母细胞异丁醇耐受性的影响。首先,通过在野生型酿酒酵母W303-1A中过表达各基因,将过表达各基因的菌株在异丁醇半致死浓度1%（V/V）下进行耐受性测试,结果表明,过表达AQY1、OLE1、CWP1、wsc2基因对异丁醇耐受性有负面影响,过表达srp40、SPT6、spt6基因对异丁醇耐受性影响较小,过表达srp40、WSC2、CWP2基因能够提高异丁醇耐受性,其中过表达突变基因srp40的菌株W303-1A-srp40对异丁醇耐受性最优。为研究突变基因srp40影响异丁醇耐受性的机制,我们对突变基因srp40进行测序,结果表明突变基因srp40开放阅读框含5个突变,其中570 bp、711 bp处2个碱基替换突变为同义突变,442 bp处1个碱基替换（T→C）突变造成相应的氨基酸突变为S148P,1018 bp处的1个碱基缺失造成移码突变,1050 bp处的1个碱基替换突变位于移码突变中。随后,对srp40蛋白质性质和结构进行了分析和模拟,我们发现srp40蛋白与硅藻的胸膜蛋白-1（pleural-1）具有相似的结构。其次,为了进一步探究突变基因srp40对酵母细胞耐受性的影响和耐受机制,将菌株W303-1A-srp40分别置于含1%异丁醇、1.3%异丁醇、8%乙醇和0.5%异戊醇的CM培养基中进行发酵,测定细胞密度(OD)和生长情况,并计算2 h—10 h的比生长速率（μ）。将菌株W303-1A-srp40于55℃热激4 min后做稀释实验（Dilution）,观察它们在平板上的生长情况。将菌株W303-1A-srp40分别于38℃下进行发酵,进一步确定其耐热性。在含有1%异丁醇的CM培养基中,发酵24 h时菌株W303-1A-srp40的细胞密度是菌株W303-1A-srp40的1.12倍,是对照菌W303-1A-22的1.10倍,菌株W303-1A-srp40的比生长速率是对照菌的1.1倍,是菌株W303-1A-srp40的1.07倍。在含有1.3%异丁醇的CM培养基中,菌株W303-1A-srp40的细胞密度是菌株W303-1A-srp40的1.06倍,是对照菌W303-1A-22的1.10倍,菌株W303-1A-srp40的比生长速率是对照菌和菌株W303-1A-srp40的1.1倍。在含有8%乙醇和0.5%异戊醇的CM培养基中,发酵24 h时菌株W303-1A-srp40的细胞密度分别是菌株W303-1A-srp40的1.12倍和1.01倍,是菌株W303-1A-22的1.17倍和1.07倍。菌株W303-1A-srp40的比生长速率分别是菌株W303-1A-srp40的1.37倍和1.07倍,是对照菌W303-1A-22的1.31倍和1.09倍。菌株W303-1A-srp40在55℃热激后生长仍优于其它两株菌,并且在38℃下发酵,发酵48 h时,菌株W303-1A-srp40的细胞密度是菌株W303-1A-srp40的1.16倍,是菌株W303-1A-22的1.23倍,菌株W303-1A-srp40的比生长速率是对照菌W303-1A-22的1.07倍,与菌株W303-1A-srp40无明显差异。通过转录组分析发现色氨酸合成代谢和呼吸活动的降低可能是造成菌株W303-1A-srp40高异丁醇耐受性的主要因素。最后,在异丁醇和异戊醇代谢通路优化的菌株中过表达突变基因srp40,探究突变基因srp40对异丁醇和异戊醇产量的影响。结果表明,过表达突变基因srp40能够提升菌株的异丁醇产量,但对乙醇和异戊醇产量影响不大。菌株W303-1A-V2-V3-ARO10-srp40的最高异丁醇产量为0.38 g/L,相较对照菌株W303-1A-V2-V3-ARO10-22提升50%,相较菌株W303-1A-V2-V3-ARO10-srp40提升42%,通过转录组分析发现,菌株异丁醇产量提高主要与异丁醇代谢途径中色氨酸分解代谢、苯丙氨酸分解代谢和酪氨酸分解代谢减少有关。

关键词：酿酒酵母异丁醇乙醇耐受性 srp40

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流感病毒A/Brevig Mission/1918/1(H1N1)片段7和8 mRNAs的低效拼接提高NS1蛋白表达量的研究

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中国畜牧兽医 2012年第4期39卷 157-157页

作者： Ellenor B W 刘丹

A型流感病毒编码的2个片段(7和8)产生的mRNAs拼接后,可潜在地改变NS1蛋白和NS2蛋白及M1蛋白和蛋白M2的比例。本试验研究了A型流感病毒自然发生的序列多态性对其mRNAs拼接的影响,通过对A/Brevig Mission/1918/1(H1N1)和A/Netherlands/178... 详细信息

A型流感病毒编码的2个片段(7和8)产生的mRNAs拼接后,可潜在地改变NS1蛋白和NS2蛋白及M1蛋白和蛋白M2的比例。本试验研究了A型流感病毒自然发生的序列多态性对其mRNAs拼接的影响,通过对A/Brevig Mission/1918/1(H1N1)和A/Netherlands/178/95(H3N2)及多个H5N1禽流感病毒株片段7和8mRNAs拼接效率进行比较,发现与其他毒株的片段7和8mRNAs相比,A/Brevig Mission/1918/1(H1N1)片段7和8 mRNAs拼接效率低,导致更高水平的NS1功能蛋白的产生,可能有利于A/Brevig Mission/1918/1(H1N1)的致病性。结果还显示,A/Brevig Mission/1918/1(H1N1)片段8 mRNAs对SR蛋白过表达的应答与A/Netherlands/178/95(H3N2)不同。

关键词：流感西班牙流感 NS1 剪接聚腺苷酸化 SR蛋白 ASF/SF2 srp30c srp40

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