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基于Hsp90与LRP-1的srl-pfac方法建立及多肽筛选

基于Hsp90与LRP-1的SRL-PFAC方法建立及多肽筛选

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作者：张淑荣吉林大学

学位级别：硕士

皮肤是人体防御外界的有效屏障,在抵御细菌侵入,异物入侵以及防止脱水等方面起着重要作用,因此其完整性对于人体来说至关重要。众所周知,伤口愈合是一个复杂的生理过程,而糖尿病,血管疾病,高龄等因素会影响伤口愈合,最终形成慢性伤口。... 详细信息

皮肤是人体防御外界的有效屏障,在抵御细菌侵入,异物入侵以及防止脱水等方面起着重要作用,因此其完整性对于人体来说至关重要。众所周知,伤口愈合是一个复杂的生理过程,而糖尿病,血管疾病,高龄等因素会影响伤口愈合,最终形成慢性伤口。传统观念认为生长因子是促进伤口愈合的主要驱动力,但最终FDA只批准了人重组血小板衍生生长因子BB(PDGF-BB)(becaplermin凝胶)来治疗糖尿病足溃疡,但其疗效不佳,成本高昂,具有致癌风险等弊端逐渐显露。现今全球患有慢性伤口的人口在不断增加,所以我们急需开发出新型效果良好且价格低廉的促进伤口愈合的药物。热休克蛋白90(90 kDa heat shock protein,Hsp90)是一种普遍存在于几乎所有细胞中的分子伴侣,它在进化上高度保守,主要作用是维持细胞内蛋白质稳定。最近众多研究表明当组织受到创伤时,细胞会通过分泌Hsp90α到胞外来影响细胞的迁移,促进伤口愈合。低密度脂蛋白受体相关蛋白1(LRP-1),也称为CD91,是I型跨膜蛋白,主要介导胞吞以及信号通路的传导,近年来越来越多研究证明胞外Hsp90α(eHsp90α)通过LRP-1来传递细胞迁移信号。海肾荧光素酶双分子互补(split renilla luciferase protein fragment-assisted complementation,srl-pfac)技术是一种用于研究蛋白质间相互作用的新方法。在实验室前期工作中,我们构建了基于Hsp90与Cdc37的srl-pfac方法,并用来监测Hsp90/Cdc37之间的相互作用,结果证明srl-pfac技术具有特异性且能够敏感地定量反映结合水平差异,所以可以用来筛选Hsp90/Cdc37抑制剂。基于此,我们计划构建基于Hsp90和LRP-1的srl-pfac方法,验证其特异性并运用该方法筛选具有促细胞迁移作用的多肽。我们首先构建了pcDNA3.1(+)-S1-LRP-1 II与pcDNA3.1(+)-S1-LRP-1两种质粒,Luciferase结果表明NRL-Hsp90与S1-LRP-1 II以及NRL-Hsp90与S1-LRP-1无论是在细胞膜上还是在细胞内均有显著的互补作用。Western blot结果表明转染的Hsp90与LRP-1在膜上以及胞内表达,但未分泌到DMEM中。因为LRP-1为跨膜蛋白且NRL-Hsp90与S1-LRP-1 II在细胞膜上有更好的互补性,所以我们选择pcDNA3.1(+)-S1-LRP-1 II进行下一步的实验。Luciferase结果表明实验室前期已经验证的具有促进细胞迁移作用的多肽KR-9(KPHAEVVLR),LR-6(LYAEER),IL-6(INFEKL),LN-6(LRDILN)其细胞膜上以及细胞胞内的荧光值均大于control,而没有促进细胞迁移作用的多肽VK-7(VNAIVFK)其在细胞膜上和细胞内的荧光值均低于control,表明我们构建的srl-pfac方法能够准确反映出多肽是否具有促迁移作用,所以能够用来筛选多肽。接下来我们用srl-pfac方法筛选了两条多肽RE-7(RYPILPE),ES-9(EAGREVVGS)。Transwell结果显示这两条多肽确实能够促进有效促进HSF细胞的迁移,MTS结果表明这两条多肽均不能促进HSF细胞的增殖,但对HSF细胞并没有毒害作用。

关键词： Hsp90 LRP-1 srl-pfac 细胞迁移伤口愈合多肽

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基于Hsp90与LRP-1结构的促细胞迁移活性肽筛选和作用机制研究

基于Hsp90与LRP-1结构的促细胞迁移活性肽筛选和作用机制研究

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作者：闫昕睿吉林大学

学位级别：硕士

伤口愈合是生长因子、细胞因子以及相关组织细胞等多方面参与的生理修复过程。异常的伤口愈合如过度愈合形成瘢痕或慢性伤口形成溃疡,均会对机体造成较大伤害。细胞迁移是伤口愈合中的限速事件,在伤口愈合过程中发挥重要作用。当组织受... 详细信息

伤口愈合是生长因子、细胞因子以及相关组织细胞等多方面参与的生理修复过程。异常的伤口愈合如过度愈合形成瘢痕或慢性伤口形成溃疡,均会对机体造成较大伤害。细胞迁移是伤口愈合中的限速事件,在伤口愈合过程中发挥重要作用。当组织受损时,细胞可释放热休克蛋白90α（Hsp90α）促进细胞迁移,通过跨膜蛋白低密度脂蛋白受体相关蛋白1（LRP-1）传导细胞运动信号,加速伤口修复。胃溃疡是常见的消化系统疾病,它的修复是一个复杂的伤口愈合过程。目前针对消化性溃疡的治疗,主要集中于质子泵抑制类（PPIs）药物,但存在过度使用的情况,并且会产生严重的副作用,且停药后复发率较高。基于此现状,开发一种新型的疗效好且毒性小的促伤口愈合药物变得十分迫切。食源性小分子多肽来源广泛且具有独特的优势,如更易被机体吸收,几乎无毒副反应等。不仅具有营养价值,还具有生物活性。蛋清多肽是从蛋清粉中制备的一种食源性多肽,它的多种功能已被研究,但关于细胞迁移和伤口修复的报道却很少,因而探究可加速伤口修复的蛋清多肽具有重要意义。实验室前期工作已经证明蛋清肽KR-9（KPHAEVVLR）、LN-6（LRDILN）、IL-6（INFEKL）可以促进皮肤的伤口愈合,在此基础上,我们进一步研究蛋清肽对其他组织或器官的伤口修复作用。首先,我们运用海肾荧光素酶双分子互补（srl-pfac）技术,以Hsp90/LRP-1复合物为靶点,同时运用小室迁移实验同步筛选促细胞迁移的多肽序列,筛选出效果较好的多肽SE-6（srlYAE）、SS-8（SAESLKIS）、LR-（6 LYAEER）和RE-7（RYPILPE）后,进一步用梯度浓度的多肽做细胞小室迁移和划痕创伤愈合实验去验证多肽的促迁移效果。接下来,我们用相应细胞株,做MTS细胞活力实验,验证药物安全性的同时,也确认药物是否会引起细胞的过度增殖,造成过度的伤口愈合。之后,我们运用免疫印迹实验来研究多肽促细胞迁移和增殖的作用机制。体外实验初步完成后,为了验证多肽是否会对胃溃疡小鼠的溃疡修复具有促进作用,我们选择其中促迁移能力较强的多肽SS-8,通过体内实验进一步证明它的效果。通过造胃溃疡小鼠模型,并对其进行给药治疗,通过小鼠体重变化、胃组织形态学观察、HE染色病理分析和血清IL-6水平的测定,比较各组小鼠之间的差异,从不同维度来分析小鼠胃溃疡的愈合情况,评估SS-8对溃疡愈合的作用。基于以上研究,本文筛选出能够促细胞迁移的4种蛋清多肽,分别为SS-8、SE-6、LR-6和RE-7,为今后研发治疗伤口愈合的药物提供了科学的理论支持;也为未来蛋清粉多肽作为功能性保健品的开发利用,开辟了一条全新的道路。

关键词： Hsp90 LRP-1 srl-pfac 细胞迁移伤口愈合多肽

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白杨素通过阻断Hsp90/Cdc37抑制胰腺癌细胞生长作用研究

白杨素通过阻断Hsp90/Cdc37抑制胰腺癌细胞生长作用研究

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作者：罗赫然吉林大学

学位级别：硕士

胰腺癌是一种五年生存率只有4%的致死性消化系统癌症,其潜在机理非常复杂。关于胰腺癌的治疗方案在过去的几十年里并无实质性的突破。因此,人们亟盼能够治疗胰腺癌的新药出现。由于分子伴侣Hsp90(90 kDa heat shock protein)参与调控其... 详细信息

胰腺癌是一种五年生存率只有4%的致死性消化系统癌症,其潜在机理非常复杂。关于胰腺癌的治疗方案在过去的几十年里并无实质性的突破。因此,人们亟盼能够治疗胰腺癌的新药出现。由于分子伴侣Hsp90(90 kDa heat shock protein)参与调控其客户蛋白之稳定、活化和分选等环节,并且这些客户蛋白涉及许多癌症发展进程,抑制Hsp90活性成为了一种前景广大的抗癌方案。Cdc37(cell division cycle protein 37)是Hsp90的一种重要的共分子伴侣,它协助参与蛋白激酶调控等分子伴侣活动,这些蛋白激酶中有许多都是癌细胞中的癌蛋白。Hsp90/Cdc37复合物因其在蛋白激酶调控过程中充当的重要角色而成为一个新的抗癌靶标。因此,筛选以Hsp90/Cdc37复合物为靶标的小分子抑制剂或可成为一种新的癌症治疗策略。在前期的研究中,我们利用一种新开发的海肾荧光素酶双分子互补(split synthetic Renilla luciferase protein-fragment-assisted complementation,srl-pfac)技术,在HEK293T细胞中研究Hsp90与Cdc37之间的相互作用,并且我们证明该srl-pfac方法可以敏感而专一地定量考察Hsp90/Cdc37相互作用,因而用于Hsp90/Cdc37抑制剂的筛选。在本研究中,我们依据Hsp90/Cdc37结合位点的空间结构,选择了9种黄酮类化合物,然后用srl-pfac生物发光方法对这些候选化合物进行筛选。我们假设在这些候选化合物中存在Hsp90/Cdc37的特异性抑制剂。为验证我们的假设,我们将等物质的量的质粒pcDNA3.1(+)-NRL-Hsp90α和pcDNA3.1(+)-Cdc37-CRL共转染于HEK293T细胞,然后用9种黄酮类化合物分别处理转染后的细胞24 h。我们发现天然黄酮类化合物白杨素能够以浓度依赖的方式降低互补NRL-Hsp90α/Cdc37-CRL活性,并且假阳性分析结果表明,白杨素对海肾荧光素酶全蛋白的催化活性不显示任何抑制作用,暗示白杨素能够导致Hsp90/Cdc37复合物瓦解。接下来我们利用srl-pfac生物发光方法进一步验证是否白杨素确实是一种以Hsp90/Cdc37复合物为靶标的特异性抑制剂。为研究白杨素对胰腺癌细胞株的影响,我们用白杨素分别处理AsPc-1、Bx Pc-3、CFPAC-1、HPAC、MIAPaCa-2和PANC-1 72 h。MTS分析结果表明白杨素能够抑制这些胰腺癌细胞株的生长。综上,我们基于srl-pfac方法验证了9种黄酮类化合物作为潜在Hsp90/Cdc37抑制剂的活性,并最终发现白杨素能够阻断Hsp90/Cdc37相互作用。我们接下来证实了白杨素能够抑制6种胰腺癌细胞株的生长作用。本研究或为未来开发以Hsp90/Cdc37为靶标的新型抑制剂提供证据。

关键词：胰腺癌 Hsp90/Cdc37复合物 srl-pfac 抑制剂筛选白杨素

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