检索结果-南通市图书馆

转录因子srf/miR-29b-3p轴通过调控骨髓间充质干细胞成骨分化对大鼠脊髓损伤后骨质疏松的影响

维普期刊数据库评论

在线全文

维普期刊数据库

学校读者我要写书评

暂无评论

转录因子SRF/miR-29b-3p轴通过调控骨髓间充质干细胞成骨分化对大...

作者：陈森相中国医科大学

学位级别：硕士

目的:脊髓损伤是一种严重的中枢神经系统疾病,伤后引起的快速大量的骨丢失是其常见的并发症之一。但目前关于脊髓损伤后骨质疏松发生发展机制的报道很少,单一的废用性骨质疏松理论无法解释如此严重的骨流失。研究证明,miR-29b-3p在成骨... 详细信息

目的:脊髓损伤是一种严重的中枢神经系统疾病,伤后引起的快速大量的骨丢失是其常见的并发症之一。但目前关于脊髓损伤后骨质疏松发生发展机制的报道很少,单一的废用性骨质疏松理论无法解释如此严重的骨流失。研究证明,miR-29b-3p在成骨分化中有作用,能促进脊髓损伤神经的修复,并且其上游分子srf可与miR-29b-3p启动子结合,srf是一种参与多种生物过程的转录因子,但两个分子在脊髓损伤后骨质疏松中的作用不明朗。为此,我们观察srf和miR-29b-3p在脊髓损伤后骨质疏松大鼠中的表达变化,并从影响成骨分化的角度研究srf/miR-29b-3p轴对脊髓损伤后骨质疏松大鼠间充质干细胞的影响,探讨srf/miR-29b-3p在脊髓损伤后骨质疏松中的作用。研究方法:构建大鼠脊髓损伤后骨质疏松模型,qRT-PCR测定srf和miR-29b-3p的表达水平,进行Western blot评估骨特异性标志物OPN和RUNX2的表达,使用碱性磷酸酶染色和茜素红染色检测成骨分化能力的变化。使用siRNA敲除srf以及敲除或过表达miR-29b-3p检测骨特异性标志物OPN和RUNX2蛋白表达水平,碱性磷酸酶染色和茜素红染色检测成骨分化的变化。使用siRNA敲除srf与敲除miR-29b-3p共转染,检测骨特异性标志物OPN和RUNX2蛋白表达水平,碱性磷酸酶染色和茜素红染色检测成骨分化的变化。结果:脊髓损伤后骨质疏松模型中骨髓间充质干细胞的成骨分化能力降低,srf表达上调,miR-29b-3p表达下调。用siRNA沉默srf后,骨特异性标志物表达上调,碱性磷酸酶染色和茜素红染色均表明srf抑制成骨分化。转染miR-29b-3p抑制剂后,相应的骨特异性标志物的表达下调,染色结果减弱,而过表达miR-29b-3p后成骨能力上调。此外,用siRNA沉默srf与miR-29b-3p抑制剂共转染后,与对照组相比,骨髓间充质干细胞的成骨能力得到恢复。结论:***可以抑制脊髓损伤后骨质疏松大鼠的成骨分化。***-29b-3p促进脊髓损伤后骨质疏松大鼠的成骨分化。***能调节miR-29b-3p促进成骨分化的过程进一步证明靶向miR-29b-3p的srf参与了脊髓损伤后骨质疏松症的发展,这可能为脊髓损伤后骨质疏松症提供新的治疗靶点。

关键词：脊髓损伤骨质疏松成骨分化 srf miR-29b-3p

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

牙鲆srf基因的克隆及真核表达载体的构建

海洋渔业 2015年第4期37卷 331-340页

作者：苏艳芳付元帅施志仪张红梅高丽娜上海海洋大学农业部淡水水产种质资源重点实验室上海201306

采用RACE-PCR技术,从牙鲆(Paralichthys olivaceus)组织中克隆了血清应答因子(srf)基因全长序列,该序列全长2 477 bp,开放阅读框1 503 bp,编码500个氨基酸。通过氨基酸同源序列比对,牙鲆srf与其它物种的同源性较高,在氨基酸序列的N端具... 详细信息

采用RACE-PCR技术,从牙鲆(Paralichthys olivaceus)组织中克隆了血清应答因子(srf)基因全长序列,该序列全长2 477 bp,开放阅读框1 503 bp,编码500个氨基酸。通过氨基酸同源序列比对,牙鲆srf与其它物种的同源性较高,在氨基酸序列的N端具有NLS结构域和高度保守的MADS结构域。用PCR方法扩增srf基因的编码区片段,克隆到p EGFP-N1载体中,构建真核表达载体p EGFP-N1-srf,将重组质粒转染牙鲆胚胎细胞,在荧光显微镜下观察转染细胞有绿色荧光蛋白表达。荧光定量PCR和Western blot实验进一步证实,srf在转染细胞中高表达。说明真核表达载体p EGFP-N1-srf构建成功,为进一步研究srf在牙鲆变态发育中的作用奠定了实验基础。

关键词： srf 牙鲆克隆真核表达

马氏珠母贝srf基因的分子特征及组织特异性表达

维普期刊数据库

同方期刊数据库评论

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

基因组学与应用生物学 2015年第2期34卷 272-278页

作者：田荣荣田群莉杜晓东焦钰黄荣莲王庆恒邓岳文广东海洋大学水产学院湛江524025

血清反应因子(srf)是一个高度保守的转录因子,在细胞增殖、细胞凋亡以及免疫反应中发挥重要作用。为了探究血清反应因子在马氏珠母贝中的生物学功能,本研究运用c DNA末端快速扩增(RACE)技术克隆得到马氏珠母贝srf基因(Pm srf)c DNA的全... 详细信息

血清反应因子(srf)是一个高度保守的转录因子,在细胞增殖、细胞凋亡以及免疫反应中发挥重要作用。为了探究血清反应因子在马氏珠母贝中的生物学功能,本研究运用c DNA末端快速扩增(RACE)技术克隆得到马氏珠母贝srf基因(Pm srf)c DNA的全长序列,并且应用实时荧光定量PCR技术对Pm srf基因在马氏珠母贝不同组织中的表达进行检测。结果显示,Pm srf基因序列全长1 758 bp,其中开放阅读框(ORF)为1 440 bp,编码479个氨基酸,5'UTR为65 bp,3'UTR为253 bp,包含29 bp的poly A。预测其相对分子量为50 534.6 Da,理论等电点为7.71。多序列比对结果发现物种间srf具有较高的保守性。SMART软件分析显示Pm srf具有典型的MADS结构域。荧光定量PCR数据分析表明,Pm srf基因在马氏珠母贝闭壳肌、肝胰腺、血细胞、外套膜、性腺、鳃六种组织中均有表达,其中在鳃中表达量最高。本研究可为进一步探究Pm srf在贝类中的生物学功能提供重要的理论基础和参考价值。

关键词：马氏珠母贝 srf 基因克隆荧光定量PCR

srf–microRNA–143/145–TPM4通路在高糖诱导的腹膜间皮细胞表型转换中的作用研究

维普期刊数据库

同方期刊数据库评论

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

SRF–microRNA–143/145–TPM4通路在高糖诱导的腹膜间皮细胞表型...

作者：车明文第四军医大学

学位级别：硕士

腹膜在高糖透析液的长期刺激下,可以引起结构和功能发生改变,导致超滤失败,使尿毒症病人不得不放弃腹膜透析治疗,转向其他肾脏替代治疗。腹膜纤维化是超滤失败的主要原因之一。课题组前期研究发现转录因子,血清反应因子(serum response ... 详细信息

腹膜在高糖透析液的长期刺激下,可以引起结构和功能发生改变,导致超滤失败,使尿毒症病人不得不放弃腹膜透析治疗,转向其他肾脏替代治疗。腹膜纤维化是超滤失败的主要原因之一。课题组前期研究发现转录因子,血清反应因子(serum response factor,srf)在高糖刺激后的HPMCs中表达增加,并且具有促进高糖刺激所诱导的人腹膜间皮细胞表型转换的作用。但是,其究竟是通过何种机制调控人腹膜间皮细胞的表型转换,目前未见相关研究报道。mi RN A是一种小的、非编码RNA,主要是通过抑制其靶基因,而发挥其生物学作用。很早以前科学家们就发现了mi RNA的存在,但是一直认为其是伴随基因转录过程中,生成的“垃圾”产物,并无任何实质性的功能。自从1993年哈佛大学的Lee RC教授,首次报道了mi RNA具有转录后调控作用后,越来越多的研究表明,其在胚胎发育、组织修复、细胞增殖及凋亡,以及肿瘤的发生和发展过程中,发挥着重要的作用。文献报道,miRNA-143/145在多种肿瘤组织中的表达降低,并且与其侵袭和转移有一定的关系。我们课题组预实验发现在高糖刺激后的人腹膜间皮细胞中,其表达量明显增加。那么,它们是否参与了人腹膜间皮细胞的表型转换呢?迄今为止,并不是很清楚。TPM4是原肌球蛋白家族中的一员,目前对其研究甚少。我们发现,在高糖刺激后腹膜间皮细胞中,TPM4蛋白的表达明显降低。这提示TPM4可能在腹膜间皮细胞的表型转换过程中,发挥一定的作用。生物信息学预测,发现TPM4是mi RNA-143/145下游靶基因之一,并且在细胞系中,它们的表达呈负性相关关系。那么,mi RNA-143/145和TPM4是否参与了高糖刺激所诱导的细胞表型转换?他们二者是否能够结合,又是如何结合?这些问题将是本课题的研究重点。【目的】1.观察mi RNA-143/145和TPM4在高糖刺激后的腹膜间皮细胞中的表达情况及其功能;2.验证miRNA-143/145和TPM4之间的关系;3.验证srf和mi RNA-143/145之间的关系;【方法】1.利用D型葡萄糖刺激人腹膜间皮细胞,通过western blot和qRT-PCR技术,检测mi RNA-143/145和TPM4的表达情况;2.利用mi RN A-143/145 mimic和inhibitor进行瞬时转染,建立过表达和功能抑制细胞系,观察其在细胞表型转换中的作用;***4慢病毒转染细胞,建立过表达和干扰细胞系,观察其在细胞表型转换中的作用;4.联合多个数据库,预测mi RN A-143/145的靶基因,并通过双荧光素酶报告基因验证;***慢病毒转染细胞,建立过表达和功能缺失细胞系,观察mi RN A-143/145的表达变化;【结果】*** RN A-143/145在高糖刺激后的HPMCs中的表达增加,并且其具有促进细胞表型转换的作用利用50mmol/L D-型葡萄糖刺激HPMCs,通过q RT-PCR检测mi RNA-143/145的表达情况,结果发现mi RNA-143/145的表达增加,并且具有时间依赖性;随后,通过转染mi RNA-143/145 mimic和inhibitor,证明了mi RNA-143/145具有促进细胞表型转换的作用。***4蛋白在高糖刺激后的HPMCs中的表达降低,并且其具有抑制细胞表型转换的作用Western blot和q RT-PCR结果显示,高糖刺激可以降低其蛋白的表达,但不影响其m RNA的表达,通过慢病毒转染,分别建立了过表达和干扰细胞模型,发现其具有抑制细胞表型转换的作用。*** RN A-143/145和TPM4蛋白在高糖刺激后的HPMCs中表达负相关,并且二者可以结合综合上述1和2的western blot和q RT-PCR结果表明,高糖刺激后,mi RN A-143/145和TPM4蛋白的表达负性相关,但是其m RNA的表达无明显变化;联合Targetscan、Micro Cosm和mi Rbase三个mi RNA靶基因数据库预测,发现,TPM4为mi RN A-143/145下游靶基因之一,利用了双荧光素酶报告基因,证实mi RNA-143/145可以与TPM4 3?-UTR相结合***可以正向调控mi RNA-143/145的表达通过慢病毒转染,我们建立了srf过表达和干扰细胞模型,利用q RT-PCR技术检测mi RN A-143/145的表达,结果提示,srf可以调控mi RNA-143/145的表达,表明细胞体内存在srf-mi RNA-143/145-TPM4信号轴。【结论】通过对高糖刺激后的HPMCs中srf、mi RNA-143/145和TPM4表达的研究,我们证实了高糖刺激后,HPMCs中mi RNA-143/14

关键词：细胞表型转换 microRNA-143/145 TPM4 srf

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

srf在腹膜间皮细胞转分化中的作用

SRF在腹膜间皮细胞转分化中的作用

作者：娄未娟第四军医大学

学位级别：硕士

腹膜纤维化是腹膜透析(peritoneal dialysis, PD)的主要并发症，很大程度上影响着腹膜透析作为长期肾脏替代治疗的效果[1]，而腹膜间皮细胞(Human peritoneal mesothelial cells, HPMCs)发生的上皮-间充质转分化（Epithelial-to-mesench... 详细信息

腹膜纤维化是腹膜透析(peritoneal dialysis, PD)的主要并发症，很大程度上影响着腹膜透析作为长期肾脏替代治疗的效果[1]，而腹膜间皮细胞(Human peritoneal mesothelial cells, HPMCs)发生的上皮-间充质转分化（Epithelial-to-mesenchymal transition, EMT）被认为是腹膜纤维化的最初反应，也是腹膜透析早期相关性损害的一个关键环节[2]。发生腹膜纤维化时，间皮细胞下出现肌成纤维细胞以及细胞外基质(ECM)的积聚[3]。腹膜的EMT和纤维化与其他器官和组织如肺、心、肾、胸膜有类似的病理改变[4-5]。在EMT的过程中，可发现上皮细胞标志分子逐渐下调并消失，而间皮细胞标志分子逐渐上调[6]。研究发现转录因子Snail, Zeb和HLH家族在E-cadherin以及参与EMT过程的基因转录下调过程中起着重要的作用[7]，但是目前研究发现的转录因子尚不能完全解释腹膜EMT的分子机制，还有待于进一步发现新的更重要的转录因子。有研究报道，血清反应因子（Serumresponse factor, srf)在肿瘤进展过程中起着重要的作用，特别是在上皮性肿瘤EMT中呈现高表达并且有很高的活性[8]，但是srf在腹膜间皮细胞的EMT过程中发挥着怎样的作用尚不清楚。本课题对此问题进行了一系列研究。【目的】 1. srf在原代以及高糖刺激永生化的腹膜间皮细胞发生EMT后的表达及其作用。 2. srf在腹膜透析动物模型中的表达及其作用。【方法】 1.将腹膜透析液离心后进行HPMCs培养，观察不同透析时间（透龄）原代HPMCs细胞的形态学变化;应用免疫细胞荧光化学的方法检测上皮标志分子E-cadherinh、间质标志分子α-SMA、Snail以及srf的表达和细胞定位情况。 2.通过高糖刺激永生化的HPMCs，建立腹膜间皮细胞间充质转分化的细胞模型，观察细胞的形态学变化，并采用Western-blot方法和免疫细胞化学荧光的方法检测上皮标志分子E-cadherin和间质标志分子α-SMA、Snail的表达。 3.应用Western blot方法和免疫细胞荧光化学的方法检测srf在未发生转分化和已发生转分化的细胞中的表达差异和细胞定位，同时检测srf的活性形式即磷酸化srf的表达。 4.将srf特异性上调质粒和对照质粒（由Dr. Eric Olson, Department ofMolecular Biology, UT Southwestern Medical Center at Dallas, USA馈赠）转染腹膜间皮细胞，检测在srf上调时上皮标志分子E-cadherin和间质标志分子α-SMA、Snail的表达。 5.将srf特异性下调病毒转染到高糖刺激发生了转分化的细胞中，分别采用Western blot方法和免疫细胞荧光化学的方法检测在srf下调时上皮标志分子E-cadherin和间质标志分子α-SMA、Snail的表达。 6. SD大鼠腹腔内注射高糖透析液，建立高糖诱导大鼠腹膜纤维化模型，HE染色检测大鼠腹膜的厚度;采用免疫组织化学的方法检测上皮标志分子E-cadherin和间质标志分子α-SMA、Snail的表达以及srf的表达及细胞定位情况。 7. srf特异性的抑制剂（CCG-1423）溶入高糖透析液中进行大鼠腹腔灌注，HE染色检测大鼠腹膜的厚度;采用免疫组织化学的方法检测上皮标志分子E-cadherin、间质标志分子α-SMA、Snail以及srf的表达。【结果】 ***在人腹膜透析液HPMCs原代细胞中高表达，以及在高糖刺激永生化HPMCs发生转分化后高表达收集40例PD患者无菌夜间留腹PD液标本，离心后进行HPMCs原代培养，随着透龄的延长，细胞由鹅卵石样逐渐转变为成纤维样;免疫细胞化学荧光显示srf由胞膜、胞质表达逐渐定位至胞核，并且srf的表达也显著增强，与上皮标志分子E-cadherin表达呈负相关，与间质标志α-SMA、Snail的表达呈正相关。利用60mmol/L高糖在不同时间（0d、1d、2d、4d、7d）刺激人腹膜间皮细胞，与对照组5.6mmol/L相比,应用Western-blot显示srf蛋白水平明显增高，并且呈现时间依赖性，与上皮标志分子E-cadherin表达呈负相关，与间质标志分子α-SMA、Snail的表达呈正相关;免疫细胞化学荧光显示srf的表达也是逐渐增强的，并且出现核转位现象。 2．体外实验证实srf可以促进人腹膜间皮细胞间充质转分化永生化的HPMCs转染srf上调质粒和对照质粒后，与对照组相比，Western-blot显示srf的蛋白水平增高，上皮标志分子E-cadherin表达下降，而间质标

关键词：腹膜纤维化上皮细胞向间充质细胞转分化 srf E-钙粘素 α-平滑肌肌动蛋白 Snail

srf介导pol-miR-133a调控牙鲆肌肉发育的分子基础研究

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

SRF介导pol-miR-133a调控牙鲆肌肉发育的分子基础研究

作者：苏艳芳上海海洋大学

学位级别：硕士

牙鲆是我国重要的海水养殖经济鱼类,其典型的胚后变态发育使之成为变态发育机制的良好模型,其中肌肉发育是牙鲆变态发育中一个极其重要和复杂的生物学过程。血清应答因子(srf)是MADS(MCM1,AGAMOUS,DEFICIENS和srf)框基因家族的成员之一... 详细信息

牙鲆是我国重要的海水养殖经济鱼类,其典型的胚后变态发育使之成为变态发育机制的良好模型,其中肌肉发育是牙鲆变态发育中一个极其重要和复杂的生物学过程。血清应答因子(srf)是MADS(MCM1,AGAMOUS,DEFICIENS和srf)框基因家族的成员之一。在真核生物中高度保守,在各组织器官中广泛表达,是生物体内重要的多功能转录因子,在细胞中以同源二聚体的形式与DNA序列CC(A/T)6GG(CAr G元件)结合后,通过MAPK或Rho A途径调节下游基因的表达,它能够激活肌相关因子(Myogenin、Myo D、SM22、MLC)调控肌细胞的生长、增殖及分化等,从而影响肌肉发育及收缩功能。Micro RNA(mi RNA)是一类由185个碱基组成的内源性非编码小单链RNA分子,通常在转录后水平上抑制靶基因的m RNA翻译或降解靶基因m RNA来发挥作用。mi R-133a在肌肉组织中特异存在参与调控肌肉发育,可促进成肌细胞增殖,而抑制成肌细胞的分化。本课题组已分析了pol-mi R-133a和MRFs(Myo D、Myf5、Myogenin)在牙鲆变态过程中的表达。本论文主要从srf基因出发,克隆了牙鲆srf基因c DNA全长,检测了其在牙鲆不同组织、胚胎和仔鱼各发育时期以及甲状腺激素和硫脲对其表达的影响;另外通过生物信息学方法和靶基因验证实验分析pol-mi R-133的靶基因;然后还构建了牙鲆srf基因的真核表达载体p EGFP-N1-srf,检测其在牙鲆胚胎细胞中的表达以及对牙鲆肌相关因子MRFs表达的影响。以期揭示mi R-133a、srf和MRFs三者在牙鲆肌肉发育中的关系,为进一步研究牙鲆变态机理提供理论基础。本研究首先通过RACE-PCR技术,从牙鲆组织总RNA中克隆了牙鲆srf基因全长序列,该序列全长为2477bp,包括574bp的5’非编码区(UTR)和400bp的3’UTR区,开放阅读框1503bp,编码500个氨基酸。在蛋白质同源序列比对中,牙鲆srf的氨基酸序列与其他物种的同源性在55%-75%之间,并具有核定位信号NLS结构域和高度保守的MADS框。srf基因的进化树分析显示牙鲆与红鳍东方鲀和青斑河鲀的进化关系较近,位于鱼类的分支上。牙鲆srf基因和其它物种的相似性,说明其在功能上是保守的。利用Real-time PCR检测了牙鲆srf基因的表达情况,结果显示牙鲆srf基因在成鱼各组织以及胚胎仔鱼各发育时期均表达,在各组织(脑、肌肉、心脏、肾脏、鳃、胃、肝脏以及肠)表达中,肾脏和胃中表达较高,而在心脏和肝中表达量相对较低。在胚胎时期高表达,这与srf在胚胎发育中参与中胚层的形成有关;在仔鱼阶段,3dph和7dph表达量最低,这同srf与分化作用有关而与增殖作用无关想符合;而后表达量逐渐升高直到14dph达到最高点,推测是在为牙鲆变态期需要大量基因表达调控,这些基因需要转录因子srf来激活而做准备,在17dph到36dph变态期表达相对较稳定,而在变态结束(41dph)又下降到较低的水平。外源甲状腺激素(thyroid,TH)能够诱导牙鲆提前变态,而硫脲(thiourea,TU)则可以使其变态停滞。本实验通过Real-time PCR和Western blot实验检测TH和TU处理变态期仔鱼后牙鲆srf m RNA和蛋白的表达情况,结果发现,甲状腺处理组与对照组相比除17dph时表达量降低,而在其它时期表达量都没有明显的变化;在硫脲处理组,srf的表达量都下降,尤其是在29dph,36dph和41dph显著降低;在TH拯救实验中,TU-TH处理组与TU处理组相比,srf m RNA的表达水平显著上调;结果表明甲状腺激素间接影响牙鲆srf基因的表达。本实验利用靶基因预测数据库Target Scan、mi RBase等对pol-mi R-133a的靶基因进行预测,筛选出与肌肉发育相关的基因srf、WHSC和Cdc42,将这三个基因包含靶位点的3’UTR连接到pmir-GLO双荧光素酶报告基因载体中构建重组质粒以及定点突变质粒,转染牙鲆胚胎细胞进行双荧光素酶活性检测,结果显示,pol-mi R-133a抑制srf、WHSC和Cdc42 3’UTR双荧光素酶重组质粒表达的荧光素酶活性,对突变质粒的荧光素酶活性没有抑制效果。说明srf、WHSC和Cdc42是pol-mi R-133a的靶基因,推测在牙鲆中pol-mi R-133a调控肌肉细胞增殖可能是通过这些靶基因实现的。为进一步研究牙鲆srf基因的功能,本实验通过PCR方法扩增基因srf的编码区片段,克隆到真核表达载体p EGFP-N1中,构建p EGFP-N1-srf重组质粒,将重组质粒转染牙鲆胚胎细胞,在荧光显微镜下观察到转染细胞有绿色荧光蛋白表达,荧光定

关键词：牙鲆变态发育肌肉 srf pol-miR-133a MRFs

猪miRNA-423-5p靶向srf基因调控肌肉发育的初步研究

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

猪miRNA-423-5p靶向SRF基因调控肌肉发育的初步研究

作者：黄建芳广西大学

学位级别：硕士

microRNA(miRNA)是一类长度在21个核苷酸左右,进化上保守的RNA分子。它通过实现转录后水平的调控,进而参与各项生命活动。猪肌肉发育受到众多基因的调控,近年发现microRNA在骨骼肌的生长发育过程中发挥着极为重要的作用。我们的前期研... 详细信息

microRNA(miRNA)是一类长度在21个核苷酸左右,进化上保守的RNA分子。它通过实现转录后水平的调控,进而参与各项生命活动。猪肌肉发育受到众多基因的调控,近年发现microRNA在骨骼肌的生长发育过程中发挥着极为重要的作用。我们的前期研究发现,miR-423-5p(miRNA-423-5p)在猪骨骼肌不同发育过程中呈现出显著的差异表达,提示miR-423-5p可能通过靶向某些特定基因参与骨骼肌的生长发育调控。但至今未发现miR-423-5p参与猪骨骼肌生长发育调控机制的有关报道。因此本研究以miR-423-5p为主要研究对象,筛选其靶基因,并探讨它们在猪骨骼肌生长发育过程中所发挥的作用。主要研究结果如下：1.运用TargetScan等生物信息学软件预测到srf基因是猪miR-423-5p的一个潜在靶基因。2.采用qRT-PCR的方法检测了广西巴马小型猪miR-423-5p与srf基因在5个不同日龄背最长肌中的表达情况,同时绘制了miR-423-5p的组织表达谱。结果显示：广西巴马小型猪背最长肌中niR-423-5p mRNA的表达水平随着日龄的增长而不断升高,srf mRNA的表达水平则呈现不断下降的趋势,两者呈负相关。在不同组织中,miR-423-5p均有表达,其中在心脏中表达量最高,在背最长肌、脑和肾中表达量也相对较高,在肝和脾中表达量相对较低。3.利用克隆技术将miR-423-5p的前体序列连接到pLV-CMV-3xflag-EF1-GFP (pLV)慢病毒载体上成功构建了pLV-miR-423-5p重组载体,同时转染C2C12细胞,qRT-PCR检测结果显示过表达成功。4.针对srf基因设计引物,通过克隆技术将含有结合位点的srf 3’UTR片段以及结合位点缺失的srf3'UTR片段插入到Psi-checkTM-2 vector中构建靶标正常载体srf-WT和靶标突变载体srf-MUT,然后转染PK15细胞系。利用双荧光素酶报告基因检测系统分析其荧光素酶活性,结果显示：WT组的荧光值极显著低于MUT组和NC组,miWT组的荧光值极显著低于niMUT、miNC和inWT组(P0.05)。这一结果表明,niR-423-5p能与srf基因相互作用,抑制其表达,srf基因为miR-423-5p的一个靶基因。5.诱导C2C12细胞分化,收集细胞进行qRT-PCR检测,结果显示：随着C2C12细胞的分化,niR-423-5p mRNA表达量呈明显的上升趋势,分化到第5天时有下降趋势;srfmRNA表达量随着C2C12细胞的分化呈明显的下降趋势,分化到第5天时有上升趋势,两者表达趋势刚好相反,呈负相关性表达。在C2C12细胞分化过程中,MyoG mRNA表达量呈明显的上调趋势;MyoD则在分化第0天和1天时表达量最高,到第3天时急剧下降而后慢慢上调。6. C2C12细胞转染miR-423-5p mimic/inhibitor后更换分化培养基继续培养48h,收集细胞进行qRT-PCR检测,结果显示：转染miR-423-5p mimic的细胞,成功过表达miR-423-5p;转染miR-423-5p inhibitor细胞的miR-423-5p表达受到抑制。当过表达miR-423-5p时,srf mRNA表达量与对照组比下降,但差异不显著(P>0.05);MyoD和MyoG mRNA表达量显著下降(Psrf mRNA表达量高于对照组,但差异不显著(P>0.05);MyoD和MyoG mRNA表达量显著上调(Psrf蛋白浓度与对照组比显著下降(Psrf蛋白浓度与对照组比显著上升(Psrf是miR-423-5p的靶标基因,且miR-423-5p主要在翻译水平下调srf的表达。综上所述,我们揭示了miR-423-5p可能参与肌肉生长发育的调控机制,即niR-423-5p通过抑制靶标基因srf对肌肉分化进行负向调控,并最终调控骨骼肌的生长发育。

关键词：广西巴马小型猪 microRNA miRNA-423-5p srf 肌肉发育

SRSF3通过剪接调控srf促进结直肠癌血管生成的分子机制研究

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

SRSF3通过剪接调控SRF促进结直肠癌血管生成的分子机制研究

作者：陈银霜苏州大学

学位级别：硕士

肿瘤血管生成是癌症的重要标志,并且与结直肠癌（CRC）的转移密切相关。剪接因子SRSF3是富含丝氨酸和精氨酸蛋白（SRp）家族重要成员,在多种肿瘤中异常高表达,并且在肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭等过程中发挥重要作用。但是,SRSF3是否参与... 详细信息

肿瘤血管生成是癌症的重要标志,并且与结直肠癌（CRC）的转移密切相关。剪接因子SRSF3是富含丝氨酸和精氨酸蛋白（SRp）家族重要成员,在多种肿瘤中异常高表达,并且在肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭等过程中发挥重要作用。但是,SRSF3是否参与肿瘤血管生成仍不清楚。为了深入研究SRSF3在CRC中的作用,我们敲低CRC细胞中SRSF3后,采用RNA测序（RNA-seq）技术测定其对基因表达调控作用。结果发现,870个基因被显著下调,而1152个基因被显著上调。进而对表达下调基因的功能进行分析发现,SRSF3调控了多个血管生成相关基因。反转录PCR（RT-PCR）和实时荧光定量PCR（qPCR）结果进一步证实SRSF3调控血清反应因子srf等多个血管生成相关基因的表达。为了探究SRSF3在肿瘤血管生成中的作用,我们对CRC患者组织样本进行了免疫组化染色（IHC）,发现SRSF3不仅在肿瘤组织中呈现高表达,而且在肿瘤血管周围也有较高的表达水平。敲低SRSF3后,HCT-116和HCT-8细胞培养基中血管内皮生长因子VEGF的表达水平均显著降低。而且,敲低SRSF3的CRC细胞条件培养基可以显著抑制人脐静脉内皮细胞HUVEC的迁移、侵袭和小管形成。随后,我们采用RNA免疫共沉淀实验（RIP）和minigene报告系统证实SRSF3可以与srf外显子6上的“CAUC”位点直接结合,参与srf的剪接调控。同样,敲低srf后,HCT-116和HCT-8细胞培养基中VEGF的表达水平也显著降低;敲低srf的CRC细胞条件培养基也可以显著抑制HUVEC细胞迁移、侵袭和小管形成。而且,过表达srf还能逆转敲低SRSF3的条件培养基对血管生成的抑制作用。这些研究结果表明,SRSF3能与srf pre-mRNA直接结合参与srf的剪接过程,并调控srf表达,从而影响VEGF分泌,调节CRC血管生成。这为SRSF3作为肿瘤治疗靶点提供了理论依据,并为CRC的抗血管生成疗法提供了新的方向。

关键词：结直肠癌血管生成剪接 SRSF3 srf

MiR-296-5p靶向srf调控COX2参与分娩启动

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

MiR-296-5p靶向SRF调控COX2参与分娩启动

作者：张中远华中农业大学

学位级别：硕士

由妊娠到分娩是多种因素相互协调的过程,子宫肌层从静息过渡到活跃而有节奏的收缩状态,需要胎盘、母体和胎儿间复杂的相互作用,炎症和激素是分娩的最终共同途径。近年来的研究发现,miRNA也参与调控分娩启动。课题组前期构建不同妊娠阶... 详细信息

由妊娠到分娩是多种因素相互协调的过程,子宫肌层从静息过渡到活跃而有节奏的收缩状态,需要胎盘、母体和胎儿间复杂的相互作用,炎症和激素是分娩的最终共同途径。近年来的研究发现,miRNA也参与调控分娩启动。课题组前期构建不同妊娠阶段大白猪和清平猪胎盘组织的miRNA表达谱,本研究从中筛选差异表达的miR-296-5p作为研究对象。miR-296-5p通过促进血管生成维持妊娠,本论文旨在探究miR-296-5p在分娩启动过程中的作用。为了探究miR-296-5p是否参与分娩启动,我们在妊娠15.5 d的孕鼠腹腔注射脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)构建小鼠早产模型,检测分娩标志基因c-fos和COX2的表达变化,以及miR-296-5p和血清响应因子(Serum response factor,srf)的表达模式。通过双荧光素酶报告系统验证miR-296-5p和srf之间的靶向关系。人羊膜上皮(WISH)细胞中模拟miR-296-5p超表达和抑制,检测srf和分娩标志基因COX2的变化,验证miR-296-5p是否参与分娩启动。通过转染pcDNA3.1-srf和干扰片段进一步验证srf对COX2的靶向关系,证明miR-296-5p通过靶向srf调控COX2表达。激素水平检测miR-296-5p和srf对PGE2分泌的作用,以及PGE2对miR-296-5p、srf和COX2的反馈调节机制。试验主要研究结果如下:1)小鼠早产模型中分娩标志基因c-fos和COX2表达水平显著高于对照组,miR-296-5p表达水平降低,同时miR-296-5p潜在靶基因srf表达水平升高,表明miR-296-5p可能靶向srf参与分娩启动。2)利用miR-296-5p mimics分别与srf 3’UTR和srf 3’UTR mutant的pmirGLO载体共转染WISH细胞。miR-296-5p mimics显著抑制pmirGLO-srf 3’UTR载体的双荧光活性,而对突变载体荧光活性无影响,证明miR-296-5p与srf的靶向关系。3)将miR-296-5p inhibitor转染至WISH细胞,srf和COX2表达显著增高,表明miR-296-5p调控分娩标志基因COX2参与分娩启动。WISH细胞转染pcDNA3.1-srf,COX2表达极显著升高,说明miR-296-5p是通过靶向srf调控COX2的表达。4)激素水平检测miR-296-5p和srf对PGE2分泌的作用,发现干扰miR-296-5p和超表达srf均促进PGE2分泌。WISH细胞中添加1μM PGE2对miR-296-5p、srf和COX2具有反馈调节机制。结论:分娩启动时miR-296-5p表达降低,解除了对srf的抑制,进而使COX2表达升高,PGE2分泌增加,且PGE2对miR-296-5p、srf和COX2存在反馈调节机制。

关键词： miR-296-5p srf COX2 PGE2 分娩启动