检索结果-南通市图书馆

sqstm1/p62 regulate breast cancer progression and metastasis by inducing cell cycle arrest and regulating immune cell infiltration

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

Genes & Diseases 2022年第5期9卷 1332-1344页

作者： Jia-Long Qi Jin-Rong He Cun-Bao Liu Shu-Mei Jin Xu Yang Hong-Mei Bai Yan-Bing Ma Institute of Medical Biology Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical CollegeKunmingYunnan 530102PR China Kunming Medical University Institute of Medical BiologyKunmingYunnan 650500PR China Yunnan Institute of Materia Medical Department of PathologyKunmingYunnan 650111PR China

The autophagy adaptor protein sqstm1/p62 is overexpressed in breast cancer and has been identified as a metastasis-related ***,the mechanism by which sqstm1/p62 contributes to breast cancer progression and tumor microenvironment remains *** study revealed that silencing sqstm1/p62 expression suppressed breast cancer progression via regulating cell proliferation and reshaping the tumor microenvironment(TME).Here,we found that sqstm1/p62 was overexpressed in multiple human cancer tissue types and that was correlated with poor patient overall survival(OS)and disease-free survival(DFS).Moreover,we found that short-hairpin RNA(shRNA)-mediated knockdown of p62 expression significantly inhibited cell proliferation,migration,and invasion,and promoted cell death in vitro,as well as suppressed breast cancer growth and lung metastasis in *** addition,flow cytometry analysis of splenocytes and tumor infiltrating lymphocytes(TILs)indicated that the numbers of CD8α+interferon(IFN)-γ+cells(CTLs)and CD4+IFN-γ+(Th1)cells were increased while those of CD4+IL-4+(Th2)cells,tumor-associated macrophages(TAMs)and myeloid-derived suppressor cells(MDSCs)were ***-pCR analyses showed that the gene expression of Th1/Th2 cytokines changed in the tumor *** sqstm1/p62 suppressed tumor cell lung ***,our results provide strong evidence that silencing tumor cell sqstm1/p62 inhibited tumor growth and metastasis through cell cycle arrest and TME *** finding provides a novel molecular therapeutic strategy for breast cancer progression and metastasis treatment.

关键词： Breast cancer Cell cycle Metastasis sqstm1/p62 Tumor microenvironment

N-乙酰神经氨酸诱导sqstm1/p62唾液酸化激活自噬促进内皮损伤相关动脉粥样硬化机制研究

维普期刊数据库评论

在线全文

维普期刊数据库

学校读者我要写书评

暂无评论

N-乙酰神经氨酸诱导SQSTM1/p62唾液酸化激活自噬促进内皮损伤相关...

作者：陈乐重庆医科大学

学位级别：硕士

研究背景与目的:心血管疾病（Cardiovascular disease,CVD）依旧是我国乃至世界导致人类死亡率居高不下的重要原因。动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）是一类血管重构性疾病,是CVD的病理基础。其中,血管内皮作为调控血管健康的第一道... 详细信息

研究背景与目的:心血管疾病（Cardiovascular disease,CVD）依旧是我国乃至世界导致人类死亡率居高不下的重要原因。动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）是一类血管重构性疾病,是CVD的病理基础。其中,血管内皮作为调控血管健康的第一道屏障,是血管内代谢产物交流的主要场所。唾液酸（Sialic acid,SIA）是一种九碳单糖酰化衍生物,是糖脂代谢分流至己糖胺途径的代谢终产物,在血管损伤性疾病如肿瘤、高血压、高血脂等病理过程中发挥关键调控作用。已有研究揭示,SIA在血管损伤类疾病患者血浆中的积累是表征疾病进程的特色标记物及“代谢检查点”。但是,血浆内唾液酸的积累是否惰性,是否会调控血管内皮功能,其自身的作用一直以来被忽视。因此,本课题采用N-乙酰神经氨酸（N-Acetylneuraminic acid,Neu5Ac）,SIA的主要形式,在动物与细胞层面模拟了高唾液酸的微环境,探讨其对血管内皮稳态的影响及其对AS进程的调控作用。研究结果将有望重新定义唾液酸在血管损伤类疾病中的关键作用,并为AS等疾病防治策略的建立提供全新的视角与靶点。研究方法:首先,为了探讨体内游离Neu5Ac与AS疾病进程相关性。我们采用比色法检测高脂血症患者血清和Apo E小鼠血浆内游离Neu5Ac水平。进一步在Apo E小鼠模型基础上,采用Neu5Ac继续干预8周后,分别采用生化分析仪、油红O、H&E染色和Masson染色等方法分析小鼠血浆内脂质变化,以及主动脉斑块内脂质积累、坏死核心和胶原积累,由此初步明确Neu5Ac在体内对AS进程的调控作用。细胞水平上,我们采用不同浓度Neu5Ac干预血管内皮细胞（HUVECs）后,CCK-8、流式细胞术、RT-pCR和Western blot等方法分析HUVECs活力及功能的改变,体内、体外初步探究Neu5Ac诱导血管内皮损伤,进而促进AS进程作用。接下来,我们对于Neu5Ac诱发HUVECs损伤机制进行初步研究。基于转录组测序分析自噬通路变化,随后采用Western blot、免疫荧光和透射电镜等方法分析自噬蛋白sqstm1/p62、LC3、ATG5和ATG7的表达以及自噬形成情况,并采用m RFp-GFp-LC3双荧光串联系统评估自噬通量的变化。进一步联合Bafilomycin A1、3-MA、Rapamycin等,基于免疫荧光、Western blot和CCK-8等手段检测血管内皮自噬水平、内皮炎症及活力的改变,明确Neu5Ac诱导血管内皮过度自噬并促进内皮炎症损伤作用。最后,我们对Neu5Ac激活内皮自噬并诱发内皮炎症损伤的分子机制进行了初步探究。基于RT-pCR方法分析自噬主要分子标记物sqstm1/p62和LC3的转录水平。结合蛋白稳定性实验分析sqstm1/p62和LC3蛋白在Neu5Ac干预后半衰期的改变。免疫共沉淀结合免疫荧光方法探究泛素在激活sqstm1/p62降解中的关键作用。接下来,凝集素、免疫共沉淀实验结合唾液酸化修饰转移酶抑制剂p-3Fax-Neu5Ac探究sqstm1/p62唾液酸化修饰在促进其结合泛素降解中的正向调控作用。研究结果:临床样本层面,相较于健康成人血清和普通小鼠血浆,高脂血症患者血清和Apo E小鼠血浆中游离Neu5Ac水平显著上升。动物水平,额外给予Apo E小鼠Neu5Ac后,可上调血浆内脂质水平,增加斑块面积、坏死核心及胶原纤维含量。同时,斑块面积与血浆内Neu5Ac水平呈正相关。以上结果初步提示Neu5Ac参与并促进AS疾病进程。细胞层面,Neu5Ac呈浓度和时间依赖性抑制HUVECs活力,上调粘附分子ICAM-1和促炎因子IL-1β的表达水平,提示Neu5Ac可能通过诱发血管内皮炎症性损伤,参与AS疾病进程。进一步,我们发现Neu5Ac显著下调sqstm1/p62和LC3水平,上调自噬通量。联用3-MA可显著降低自噬水平同时缓解内皮炎症,反之Rapa可加剧内皮炎症及活力降低。以上结果提示Neu5Ac诱导HUVECs过度自噬,并促发内皮炎症性损伤作用。sqstm1/p62作为调控自噬通量的主要桥梁蛋白,我们发现Neu5Ac可导致sqstm1/p62半衰期缩短,降解加剧。进一步免疫印迹结合免疫荧光结果表明,Neu5Ac诱发sqstm1/p62结合泛素降解,而其唾液酸化修饰是增强其结合泛素降解的主要翻译后修饰类型。采用p-3Fax-Neu5Ac联合处理后,可显著降低sqstm1/p62与泛素结合水平同时缓解其蛋白降解水平。以上结果提示,Neu5Ac诱发sqstm1/p62唾液酸化修饰,驱动其结合泛素降解介导的过度自噬。结论:本研究基于N-乙酰神经氨酸积累于血管内事实,从动物与细胞层面评价了Neu5Ac诱导血管内皮过度自噬,进而促进内皮炎症

关键词：动脉粥样硬化 N-乙酰神经氨酸血管内皮损伤自噬 sqstm1/p62

sqstm1/p62和p53在人脑胶质瘤组织中的表达及意义

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

SQSTM1/P62和P53在人脑胶质瘤组织中的表达及意义

作者：张学浩河北大学

学位级别：硕士

目的:人脑胶质瘤是最常见的中枢神经系统恶性肿瘤,占原发性恶性中枢神经系统肿瘤的80%以上,其具有侵袭性强和复发率高的特点,尽管广泛使用最大程度的外科手术治疗,术后给予化疗和放疗辅助治疗,肿瘤仍然易复发、预后差。随着目前分子生... 详细信息

目的:人脑胶质瘤是最常见的中枢神经系统恶性肿瘤,占原发性恶性中枢神经系统肿瘤的80%以上,其具有侵袭性强和复发率高的特点,尽管广泛使用最大程度的外科手术治疗,术后给予化疗和放疗辅助治疗,肿瘤仍然易复发、预后差。随着目前分子生物学及分子病理诊断的发展,从分子角度诊断及治疗胶质瘤尤为重要。sqstm1/p62是一种多功能支架蛋白,涉及多种不同的细胞过程,包括选择性自噬、抗氧化反应、内体运输、炎症和细胞凋亡。p53起转录因子的作用,可调控参与细胞生长、衰老和凋亡等生物学过程。本课题通过免疫组织化学染色的方法检测胶质瘤组织中sqstm1/p62和p53的表达,探讨在不同病理级别人脑胶质瘤组织中sqstm1/p62和p53的表达,分析两者相关性及临床意义,为胶质瘤诊断、治疗提供有价值的分子标记物。同时建立人脑胶质瘤pDX模型,研究sqstm1/p62和p53在pDX组织中的表达特点,为进一步研究两者在肿瘤发展过程中的作用提供了有价值的技术平台。方法:1.收集河北大学附属医院神经外科2016年5月019年5月手术切除的50例人脑胶质瘤组织标本,按照第四版WHO(2016)胶质瘤分类标准进行分组:低级别组(WHOⅠ-Ⅱ级)22例,高级别组(WHOⅢ-Ⅳ级)28例,用免疫组织化学染色的Sp方法检测胶质瘤组织中sqstm1/p62和p53两种蛋白的表达,运用统计学方法分析与病理级别的关系,以及分析两者在胶质瘤组织中的相关性。2.采用颅内原位移植法将病人来源肿瘤细胞移植至裸鼠颅内,用原位移植法成功建立了胶质母细胞瘤pDX模型,通过免疫组织化学染色的Sp方法检测pDX模型肿瘤组织sqstm1/p62和p53两种蛋白的表达情况。结果:1.50例人脑胶质瘤组织中sqstm1/p62在低级别胶质瘤组和高级别胶质瘤组中阳性率分别为22.73%(5/22)、82.14%(23/28),sqstm1/p62在不同组别胶质瘤组织中表达有显著差异,高级别胶质瘤组表达显著高于低级别胶质瘤组(χ2=17.651,p﹤0.05)。2.50例人胶质瘤组织中p53在低级别胶质瘤组和高级别胶质瘤组组织中阳性率分别为13.64%(3/22)、42.86%(12/28),p53在不同组别中表达有显著差异,高级别胶质瘤组表达显著高于低级别胶质瘤组(χ2=5.009,p﹤0.05)。***1/p62与p53表达呈正相关(r=0.317,p﹤0.05),即在胶质瘤组织中sqstm1/p62表达升高,p53的表达也升高。4.成功建立了pDX模型,sqstm1/p62在pDX肿瘤组织阳性表达率为(35.63±3.45)%,在其来源的胶母肿瘤组织中阳性表达率为(33.07±6.40)%,两者无统计学意义(p>0.05);p53在pDX肿瘤组织阳性表达率为(7.84±2.22)%,在其来源的胶母肿瘤组织中阳性表达率为(6.79±1.77)%,两者无统计学意义(p>0.05)。结论:***1/p62与p53在胶质瘤中的表达与胶质瘤级别有关,两者均可以作为预测胶质瘤恶性度的理想分子标记物。***1/p62与p53在胶质瘤中的表达呈正相关,两者起协同作用促进胶质瘤的发生和发展,潜在机制可能与胶质瘤细胞自噬被抑制有关。***模型肿瘤组织的自噬及凋亡能力与其来源的胶母肿瘤组织无明显差异,pDX模型保留了原发肿瘤的生物学特性,为胶质瘤的个体化研究提供了理想的技术平台。

关键词：胶质瘤分子标记物 sqstm1/p62 p53

sqstm1/p62对TLR4信号通路的调控效应在糖尿病肾小管上皮细胞炎症中的作用

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

SQSTM1/p62对TLR4信号通路的调控效应在糖尿病肾小管上皮细胞炎症...

作者：吕波山东大学

学位级别：硕士

糖尿病肾脏病(Diabetic kidney disease,DKD)是由糖尿病引起的肾脏损害,是糖尿病的微血管病变并发症之一。在全球范围内,DKD己经成为终末期慢性肾脏病的首位病因,绝大多数是不可逆转的,临床上防治只能延缓其病程进展,不能彻底根除,已成... 详细信息

糖尿病肾脏病(Diabetic kidney disease,DKD)是由糖尿病引起的肾脏损害,是糖尿病的微血管病变并发症之一。在全球范围内,DKD己经成为终末期慢性肾脏病的首位病因,绝大多数是不可逆转的,临床上防治只能延缓其病程进展,不能彻底根除,已成为影响人类健康和生活质量的全球公共卫生问题。WHO数据显示,目前全球有超过三亿糖尿病病人,其中40%将在未来一年内进展为终末期肾脏病[1]。DKD的高发也带来了医疗资源的巨大消耗。统计数据显示:1998年,美国用于治疗DKD的医疗费用投入为160亿美元,而2010年这一数字增长为390亿美元。目前,DKD己经成为一个公共卫生和社会问题,严重威胁着人们的身心健康。新近的研究发现,Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)介导的肾小管上皮细胞炎症因子的分泌是DKD的重要致病因素。多功能蛋白sqstm1/p62(以下简称p62)可与TLR4通路中的TRAF6直接结合,进而对TLR4信号通路发挥调节效应,我们的实验研究发现,在高糖环境下肾小管上皮细胞p62表达水平降低,而p62是否参与了 DKD肾小管上皮细胞TLR4通路的过度激活,进而参与肾小管上皮细胞分泌炎症因子的调控,这些目前尚不清楚。我们通过体外培养肾小管上皮细胞株HK-2,体外高糖刺激HK-2细胞72小时后发现,肾小管上皮细胞炎症因子IL-1β、IL-6、IL-10表达水平与对照组相比升高,细胞纤维化指标E-钙粘蛋白(E-Cadherin)表达降低、波形蛋白(Vimentin)的表达升高,p62表达水平降低。体内糖尿病小鼠肾小管上皮细胞p62表达也降低,伴随EMT增强,TLR4信号通路被激活。而过表达p62能够部分逆转高糖引起的肾小管上皮细胞的炎症因子分泌和EMT。本研究表明p62有可能成为一个有效干预靶点,通过调控TLR4通路对DKD起保护效应。本研究对于深入理解DKD肾小管上皮细胞TLR4通路激活的细胞内机制,以及为临床治疗寻找DKD新的干预靶点具有重要意义。研究目的1.糖尿病环境下肾小管上皮细胞HK-2细胞p62异常表达是否参与高糖诱导下的肾小管上皮细胞TLR4信号通路的过度激活,深化对DKD肾小管间质炎症发生发展机制的认识。2.上调或下调p62的表达能否通过调控肾小管上皮细胞TLR4信号通路对DKD的病程的发生发展产生影响。研究方法:1.人肾小管上皮细胞HK-2慢病毒包装质粒过表达p62,按Invitrogen公司Lipofectamine 3000使用说明进行共转染HK2细胞,用实时定量pCR及免疫印迹法分别在mRNA和蛋白水平检测p62的转染基因效率。2.收集细胞总蛋白后,用免疫印迹法检测细胞纤维化指标(EMT)E-钙粘蛋白(E-Cadherin)、波形蛋白Vimentin的表达和TLR4信号通路相关分子TLR4、TRAF6的水平。***法提取培养细胞总RNA,逆转录合成cDNA,应用实时定量RT一pCR检测细胞炎症因子IL-1β、IL-6、IL-10的mRNA的表达。在HK-2细胞中过表达p62后,加高糖刺激72h,收集上清液采用BD Milliplex试剂盒用Luminex检测 IL-1β、IL-6、IL-104.在高糖环境下培养肾小管上皮细胞,用免疫共沉淀方法检测p62和TRAF6相互作用能力。在HK-2细胞中过表达p62后,加高糖刺激72h,收集上清采用BD Milliplex试剂盒用Luminex检测IL-1β、IL-6、IL-10。STZ诱导的糖尿病小鼠肾脏匀浆提取RNA,qpCR检测糖尿病小鼠p62的mRNA表达水平。肾脏匀浆提取总蛋白,western blotting显示糖尿病小鼠p62的表达水平。肾脏石蜡切片免疫组织化学染色显示在肾小管区域p62的表达水平。研究结果:1.在高糖刺激肾小管上皮细胞72小时后,肾小管上皮细胞炎症因子IL-1β、IL-6、IL-10表达水平与对照组相比升高,细胞纤维化指标E-钙粘蛋(E-Cadherin)表达降低,波形蛋白(Vimentin)的表达升高,TLR4和TRAF6的表达水平升高。2.糖尿病鼠肾小管上皮细胞EMT增强,TLR4信号通路被激活。3.糖尿病情况下,p62表达水平降低,p62和TRAF6相互作用阻断了 TLR4信号通路的过度激活。4.过表达p62能够抑制高糖刺激导致的HK-2细胞的EMT转化和炎症因子的分泌。研究结论:1.在高糖环境下肾小管上皮细胞p62水平降低。2.p62作为一种下游机制参与了 DKD肾小管上皮细胞TLR4通路的过度激活,作为一种下游机制参与了 DKD肾小管上皮细胞TLR4通路的过度激活。3.p62能成为一个潜在的干预靶点,通过调控TLR4通路对DKD的病情进展起保护作用。

关键词： sqstm1/p62 TOLL样受体肿瘤坏死因子受体相关因子6 糖尿病肾脏病炎症

sqstm1/p62对甲状腺乳头状癌TpC-1细胞生物学行为的影响和机制研究

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

SQSTM1/p62对甲状腺乳头状癌TPC-1细胞生物学行为的影响和机制研究

作者：余芳沁郑州大学

学位级别：硕士

背景和目的上皮滤泡细胞来源的甲状腺癌是全球内分泌系统最常见的恶性肿瘤之一,近年来发病率急剧上升。国际范围内,甲状腺癌是韩国女性最常见的癌症,美国女性第五常见的癌症。分化型甲状腺癌包括甲状腺乳头状癌和甲状腺滤泡状癌,虽然死... 详细信息

背景和目的上皮滤泡细胞来源的甲状腺癌是全球内分泌系统最常见的恶性肿瘤之一,近年来发病率急剧上升。国际范围内,甲状腺癌是韩国女性最常见的癌症,美国女性第五常见的癌症。分化型甲状腺癌包括甲状腺乳头状癌和甲状腺滤泡状癌,虽然死亡率较低,但其复发率较高,在某些亚型患者中复发率达20-30%,甚至更高。尽管pTC的发病率和复发率很高,但大多数患者在经过手术加放射性碘和定期复查等标准治疗后预后良好。然而,手术无效和放射性碘难治的pTC仍然是导致甲状腺癌相关死亡的重要原因,并且目前没有有效的治疗方案。人们普遍认为,自噬和代谢系统通过细胞内蛋白质的分解及再分布来帮助肿瘤细胞存活。在我们之前的研究中,我们通过pCR发现pTC组织中p62的表达高于正常甲状腺组织。因此,我们认为p62在pTC中占有重要的地位,并通过调控pTC细胞的生长,实现细胞内稳态的精确调节。Sequestosome 1基因（sqstm1）也被称为p62,位于5q35,是泛素化系统中的一个适配蛋白,也是选择性自噬中的一个货车蛋白,在调节细胞内蛋白降解中发挥重要作用。但也有报道指出,p62还参与了细胞周期、细胞代谢、硒对过氧自由基的清除作用等多种细胞生物学活动。p62基因突变与骨paget病、小鼠髓系白血病进展、神经退行性疾病、肥胖、血管衰老、衰老病理和癌症密切相关。p62由440个氨基酸组成,覆盖10多个结构域和结合位点,是调节胰岛素信号、能量平衡、脂肪生成、BAT产热、炎症、氧化应激、凋亡等多种细胞活动的关键中心。越来越多的证据表明,p62参与多种信号转导途径,包括胰岛素信号转导途径、Keap1-Nrf2途径、ERK途径、p38/MApK信号转导途径,证实p62对细胞具有重要的调节作用。因此,我们从多个方面探讨了p62对pTC细胞生理和功能的影响,并进一步研究pTC的发病机制。材料与方法1.收集经临床手术切除的甲状腺肿瘤组织及正常组织标本105例。通过RT-q pCR法检测p62基因在肿瘤及正常组织中的表达情况,并应用统计学知识分析临床病理特征。2.收集正常甲状腺细胞系Nthy-ori 3-1和甲状腺乳头状癌细胞系TpC-1提蛋白,通过Western Blot实验检测细胞水平p62蛋白的表达情况。3.通过CRISpR/Cas9基因编辑技术敲除TpC-1细胞株的p62基因片段,构建稳定传代细胞系p62-KO-TpC-1,通过RT-q pCR和Western Blot实验验证其敲除效率。4.通过CCK-8实验、集落形成实验、流式细胞术测细胞周期以及RT-q pCR测增殖相关基因在TpC-1和p62-KO-TpC-1细胞中的表达情况评估p62对肿瘤细胞增殖能力的影响;通过transwell实验检测p62对肿瘤细胞侵袭迁移能力的影响;通过流式细胞术检测细胞凋亡率,并通过Western Blot检测凋亡相关蛋白bax、bcl-2在TpC-1和p62-KO-TpC-1中的表达情况,评估p62对肿瘤细胞凋亡能力的影响。5.构建裸鼠荷瘤模型。实验组细胞株（p62-KO-TpC-1）、空白对照细胞株（TpC-1）接种2组各7只BALB/c雌性裸鼠,观察小鼠行为变化,定期测量小鼠体重和瘤体体积,至接种第20天处死裸鼠,剥取瘤体称重,根据瘤体重量、体积生长变化情况做点图和线图,分析计算抑瘤率,评估两组细胞株在小鼠体内成瘤结果的差异。6.将剥离的裸鼠瘤体进行免疫组化染色（Immunohistochemistry,IHC）和苏木精-伊红染色（hematoxylin-eosin staining,HE）,检测p62、pCNA、pTEN、p53的表达,并用Image J软件分析差异。7.收集TpC-1和p62-KO-TpC-1细胞提蛋白,通过Western Blot检测增殖凋亡侵袭迁移相关通路蛋白的表达情况,探讨p62对TpC-1细胞的作用机制。8.采用SpSS 21.0统计学软件分析数据。结果1.105例pTC组织中p62蛋白表达率为69.5%（73/105）,差异具有统计学意义（p﹤0.05）;p62的表达情况与肿瘤大小相关（p=0.0066）,但是,p62基因的表达情况与患者的年龄、性别、TNM分期以及淋巴结转移无统计学关系（p＞0.05）。2.相较正常甲状腺细胞系Nthy-ori 3-1,甲状腺乳头状癌细胞系TpC-1中p62蛋白表达明显升高。3.通过CCK-8法和平板集落形成实验检测细胞生长情况,可见p62敲低后,集落形成的能力减弱,细胞生长速度明显变缓（p＞0.05）。4.流式细胞术分析显示,抑制TpC-1细胞中p62的表达可使G1期细胞比例降低,S期细胞比例升高（p＞0.05）,结合CCK-8和平板集落形成的实验结果,表明敲除p62后TpC-1细胞周期被阻滞在了S期;敲除p62后细胞凋亡率上

关键词： sqstm1/p62 甲状腺乳头状癌增殖凋亡自噬

sqstm1/p62通过ATF2介导的MRpL12参与急性肾损伤下线粒体DNA表达及能量稳态调控

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

SQSTM1/p62通过ATF2介导的MRPL12参与急性肾损伤下线粒体DNA表达...

作者：马媛山东大学

学位级别：硕士

急性肾损伤（AKI）是全球性的公共卫生问题,与高发病率,高死亡率和高医疗费用相关。肾小管线粒体功能障碍导致的细胞应激、肾小管细胞死亡和失功能被认为是AKI致病机制中的最重要途径,也被认为是今后最有望成为突破AKI治疗瓶颈的靶标。... 详细信息

急性肾损伤（AKI）是全球性的公共卫生问题,与高发病率,高死亡率和高医疗费用相关。肾小管线粒体功能障碍导致的细胞应激、肾小管细胞死亡和失功能被认为是AKI致病机制中的最重要途径,也被认为是今后最有望成为突破AKI治疗瓶颈的靶标。线粒体的主要生物学功能是通过氧化磷酸化（OXpHOS）以ATp的形式提供能量。线粒体DNA（mtDNA）能够编码氧化磷酸化复合物Ⅰ-V的十三种核心成分,其稳定表达对于细胞能量稳态乃至整个机体稳态至关重要。但是,mtDNA表达调控及其对环境适应的分子机制仍然未知。考虑到细胞可能遇到的复杂生物环境和多种能量调节状态,相信有复杂的mtDNA表达调控机制亟待发现。新近研究表明,sqstm1/p62具有多种功能结构域,并参与广泛的细胞过程,如炎症,肿瘤和新陈代谢等。目前已有发现sqstm1/p62基因全身敲除动物表现出代谢率降低,成熟型肥胖和糖耐量下降等一系列表型。研究目的:本文利用肾小管上皮细胞及肾小管特异性敲除sqstm1/p62小鼠,研究sqstm1/p62能否通过调控肾脏线粒体DNA表达参与急性肾损伤并阐明其具体调控机制。研究方法:一、体外实验:以肾小管上皮细胞（HK-2）为研究对象HK-2细胞转染sqstm1/p62 shRNA过表达质粒和小干扰siRNA后验证效率。细胞缺血模型通过无血清饥饿48h诱导,缺氧模型通过3%O2孵箱培养24h实现。经过相应处理后,Seahorse XF96细胞外通量分析仪检测HK-2细胞线粒体有氧呼吸水平。实时定量pCR（qpCR）和免疫印迹技术（western blotting）分别检测13种线粒体DNA编码的氧化磷酸化（OXpHOS）复合物、p62、MRpL12、ATF2、p38等的mRNA或蛋白表达。提取细胞总DNA通过qpCR检测线粒体拷贝数。同时,通过sqstm1/p62敲除基因芯片查找相关分子线粒体核糖体蛋白（Mitochondrial Ribosomal protein L12,MRpL12）。将 sqstm1/p62 过表达细胞进行相关结构域激活剂抑制剂阻断刺激后检测MRpL12表达变化。利用生物信息学预测 MRpL12 转录因子-激活转录因子 2（Activating Transcription Factor 2,ATF2）。提核蛋白后检测p-ATF2及p-p38蛋白水平并通过免疫荧光共聚焦染色检测p-ATF2及p-p38入核水平变化。免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,Co-Ip）检测MRpL12与pOLRMT及sqstm1/p62与p38蛋白结合量,并通过邻位连接技术（proximity Ligation Assay,pLA）再次验证。凝胶迁移实验（electrophoretic mobility shift assay,EMSA）体外水平检测转录因子ATF2与MRpL12启动子序列是否能够结合,染色质免疫共沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation,ChIp）体内水平检测结合量的改变,而双荧光素酶报告基因检测（Dual-Luciferase reporter assay,DR）检测转录活性改变情况。二、体内实验:以肾小管特异性敲除sqstm1/p62小鼠及急性肾损伤（AKI）病人为研究对象AKI病人组化切片来自于山东大学齐鲁医院病理科。sqstm1/p62flox/flox小鼠与肾小管cre小鼠杂交,后代通过pCR基因鉴定及免疫荧光定位染色确定肾小管特异性敲除sqstm1/p62杂交鼠。sqstm1/p62肾小管特异性敲除小鼠及其同窝对照单侧肾切除,对侧肾动脉夹闭40分钟后再灌注48小时进行AKI造模。苏木精-伊红染色法（hematoxylin-eosin staining,H/E）检测AKI造模效率,免疫组化染色检测AKI小鼠及AKI病人sqstm1/p62、MRpL12、复合物Ⅰ-Ⅴ及p-ATF2等蛋白表达水平。酶标仪检测血肌酐、尿素氮,小鼠尿量、身长、体重、肾脏重量等多次测量标准不变。透射电镜（Transmission electron microscope,TEM）观察小鼠肾脏皮质线粒体数量及线粒体形态,后续用image pro plus进行图像分析。Clark氧电极检测肾皮质小管组织线粒体复合物Ⅰ-Ⅴ活性。研究结果:一、体外实验:1.通过XF96细胞外通量分析及复合物活性检测证实:sqstm1/p62过表达后提高肾小管上皮细胞线粒体氧化磷酸化水平,敲除后降低;qpCR及western blotting证实线粒体DNA编码13个氧化磷酸化复合物mRNA及蛋白水平在sqstm1/p62过表达后升高,敲除后降低。线粒体拷贝数及免疫荧光染色则证明线粒体数量在sqstm1/p62过表达后也升高,敲除后降

关键词： sqstm1/p62 MRpL12 线粒体DNA 氧化磷酸化急性肾损伤

携带超氧化物歧化酶1突变基因的家族性肌萎缩侧索硬化患者sqstm1/p62基因筛查研究

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

中华内科杂志 2014年第12期53卷 957-960页

作者：杨毅樊东升北京大学第三医院神经内科 100191

目的探讨13例超氧化物歧化酶1（SOD1）基因突变的家族性肌萎缩侧索硬化（ALS）患者的临床特点及其伴随的sqstm1/p62基因突变情况.方法收集北京大学第三医院神经内科确诊的SOD1基因突变的家族性ALS家系先证者13例及健康对照者100例,提... 详细信息

目的探讨13例超氧化物歧化酶1（SOD1）基因突变的家族性肌萎缩侧索硬化（ALS）患者的临床特点及其伴随的sqstm1/p62基因突变情况.方法收集北京大学第三医院神经内科确诊的SOD1基因突变的家族性ALS家系先证者13例及健康对照者100例,提取外周血DNA,并对sqstm1/p62基因的8个外显子及外显子-内含子连接区、编码区域上游2 kb起始区域进行测序.归纳整理ALS家系先证者的临床资料并随访,分析临床表型与基因型的关系.结果 13例SOD1基因突变的家族性ALS先证者中,经测序发现1例SOD1 G16A基因突变的家族性ALS先证者还同时携带sqstm1/p62基因内含子5第31555位点插入T碱基突变,即＋1 insert T（TT＞ TG）,该患者为男性,肢体起病,病程进展快于另2位仅有SOD1 G16A基因突变的先证者（sqstm1/p62基因无突变）.结论 SOD1 G16A基因突变的家族性ALS先证者若同时携带sqstm1/p62基因内含子5第31555位点T碱基插入突变可能会影响p62蛋白正常功能,从而促进ALS病程进展.

关键词：肌萎缩侧索硬化超氧化物歧化酶突变表型 sqstm1/p62

双香豆素化合物抗狂犬病病毒的效果及基于sqstm1/p62抗病毒机制的初步探究

维普期刊数据库

同方期刊数据库评论

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

双香豆素化合物抗狂犬病病毒的效果及基于SQSTM1/P62抗病毒机制的...

作者：徐梦娴扬州大学

学位级别：硕士

狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)感染引起的一种高度致死性的人兽共患病。RABV主要侵害人和温血动物的脑部神经系统,并引起致死性脑脊髓炎。狂犬病分布范围广,主要发生在发展中国家,我国狂犬病死亡人数位列全球第二,... 详细信息

狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)感染引起的一种高度致死性的人兽共患病。RABV主要侵害人和温血动物的脑部神经系统,并引起致死性脑脊髓炎。狂犬病分布范围广,主要发生在发展中国家,我国狂犬病死亡人数位列全球第二,仅次于印度。目前,预防狂犬病唯一有效的方法是在暴露前或暴露后接种疫苗,然而一旦出现临床症状,死亡率几乎为100%。因此,探寻狂犬病的有效救治药物,具有十分重要的意义。香豆素(Coumarin,CM)是一类重要的含苯骈α-吡喃酮结构的芳香氧杂环化合物,主要存在于芸香科、伞形科、木犀科等植物的根、茎、叶中,也存在于细菌和真菌的代谢物中。CM具有抗肿瘤、抗炎症、抗氧化和抗病毒等多种生物活性。其中,简单CM蛇床子素(osthole)可有效抑制乳腺癌、胃癌细胞的增殖和转移、侵袭;吡喃型CM-Calanolides A(从藤黄科红厚壳属植物Calophyllumlanigerum中分离得到)具有显著抗人类免疫缺陷病毒(HIV)的活性,并已成为抗HIV药物开发的热点先导物,在美国进入临床II期试验;双香豆素化合物(Biscoumarin,BCM)为CM的衍生物,能够有效抑制金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的生长。但BCM是否具有抗RABV的作用,目前尚未有研究报道。本课题中使用的BCM是以4-羟基香豆素为原料,与无水乙醇一起加热溶解,并加入含有不同取代基的芳香醛类,经过一系列化学方法制备而成(文中将其标记为BCM-1～9)。本文研究旨在筛选具有抗RABV活性的BCM并探讨其分子作用机制。1.双香豆素化合物抑制狂犬病病毒增殖的效果研究首先,利用磺酰罗丹明B(Sulforhodamine B,SRB)比色法分别检测9种BCM对BHK-21细胞的毒性(半数细胞毒性浓度,CC50),结果表明BCM-8和BCM-9在低浓度(2.5μM)时即能显著抑制BHK-21的细胞增殖(ppCR(Quantitative real-time pCR,qRT-pCR)等方法,检测BCM-3抑制RABV感染复制的作用方式,以及BCM-3在感染不同时间点对病毒复制的影响,结果显示:5μMBCM-3可降低RABV标准攻击毒株(Challenge virus standard-11,CVS-11)的病毒滴度 40 倍(pp基因的表达,下调达60.0%(pp蛋白表达达60%(pp基因水平均无明显变化(p>0.05)。最后利用10 LD50的CVS-11细胞毒构建RABV感染小鼠模型,分组灌胃给药,观察BCM-3是否可以挽救病毒感染小鼠的存活率,结果显示:小鼠感染RABV后的临床症状为后肢跛行,体重减轻,用50 mg/kg BCM-3治疗感染小鼠,可将小鼠存活率由0%提高至12.5%,提示BCM-3在小鼠RABV感染模型上具有一定的治疗效果。2.双香豆素化合物调控sqstm1/p62发挥抗狂犬病病毒作用的机制研究研究报道,自噬在病毒的免疫逃逸和复制增殖中均发挥着重要的作用。RABV可以通过诱导自噬来消除细胞凋亡,进而维持细胞稳态。但有文献报道RABV感染后可诱导不完全自噬,使内源性LC3表达上调,而自噬的重要底物sqstmI/p62的变化不明显,且通过外源性转染改变sqstmI/p62的表达在抗RABV中的作用仍不清楚。值得注意的是sqstm1/p62还是一个具有多种功能的骨架蛋白,广泛参与多种信号通路。前期试验已证实BCM-3能有效抑制RABV复制,那么这种抑制是否与细胞自噬或sqstm1/p62具有相关性呢?本课题紧接着开展以下研究。选用N2a细胞作为后续机制研究的细胞模型,通

关键词：狂犬病抗狂犬病病毒香豆素化合物双香豆素化合物 sqstm1/p62

sqstm1/p62分子在胃癌前病变中作用机制研究

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

SQSTM1/p62分子在胃癌前病变中作用机制研究