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模具工业 2003年第11期29卷 43-44页

作者：黄晓燕成都电子机械高等专科学校四川成都610031

分析了spvc开式异型材的工艺特性 ,介绍了改性spvc的开式异型材通用口模的结构 ,讨论了口模各参数的确定。

关键词： spvc 工艺通用机头参数

λRed重组系统用于沙门菌质粒毒力基因spvc敲除株的构建

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生物技术 2016年第4期26卷 367-371页

作者：高嵩燕婧储元元李嫄渊吴淑燕苏州大学基础医学与生物科学学院病原生物学系江苏苏州215123

[目的]利用λRed重组系统敲除沙门菌质粒毒力基因spvc。[方法]首先以质粒p KD4为模板,扩增得到两侧含spvc同源臂、中间为卡那霉素抗性基因的线性DNA片段。再将此线性片段电转入具重组功能的感受态沙门菌菌株,发生重组后,卡那霉素平板筛... 详细信息

[目的]利用λRed重组系统敲除沙门菌质粒毒力基因spvc。[方法]首先以质粒p KD4为模板,扩增得到两侧含spvc同源臂、中间为卡那霉素抗性基因的线性DNA片段。再将此线性片段电转入具重组功能的感受态沙门菌菌株,发生重组后,卡那霉素平板筛选阳性转化子。最后利用表达FLP重组酶的质粒p CP20,将FRT位点之间的卡那霉素抗性基因消除,用PCR鉴定。Western Blot检测野生沙门菌和spvc敲除株感染的He La细胞ERK磷酸化水平。[结果]沙门菌质粒毒力基因spvc敲除株构建成功,spvc敲除株感染的He La细胞内ERK磷酸化水平升高。[结论]成功构建沙门菌质粒毒力基因spvc敲除株,验证了spvc基因的功能。

关键词： λRed重组系统沙门菌 spvc 基因敲除质粒

沙门菌质粒毒力基因spvc对巨噬细胞和中性粒细胞抗菌作用的影响和机制研究

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沙门菌质粒毒力基因spvC对巨噬细胞和中性粒细胞抗菌作用的影响和...

作者：吴超逸苏州大学

学位级别：硕士

目的:沙门菌（Salmonella）是一类感染人与动物的革兰阴性兼性胞内菌,它是食源性细菌感染的常见病原体。沙门菌入侵机体后巨噬细胞可通过自身的抗菌作用和释放趋化因子募集中性粒细胞抵御感染。已证实沙门菌质粒毒力基因spvc在沙门菌感... 详细信息

目的:沙门菌（Salmonella）是一类感染人与动物的革兰阴性兼性胞内菌,它是食源性细菌感染的常见病原体。沙门菌入侵机体后巨噬细胞可通过自身的抗菌作用和释放趋化因子募集中性粒细胞抵御感染。已证实沙门菌质粒毒力基因spvc在沙门菌感染过程中起重要作用,本研究旨在分析spvc与巨噬细胞焦亡及其释放中性粒细胞趋化因子的关系;研究spvc对中性粒细胞死亡及趋化因子受体的影响;探讨spvc对巨噬细胞和中性粒细胞协同抗菌作用的影响和机制。方法:一、沙门菌质粒毒力基因spvc对巨噬细胞焦亡及其释放中性粒细胞趋化因子的影响应用鼠伤寒沙门菌（Salmonella enterica serovar Typhimurium,***,STM）野生株SL1344（STM-WT）、spvc基因敲除株STM-△spvc和spvc基因回补株 STM-△spvc/pspvc 按感染复数（Multiplicity of infection,MOI）10:1 分别与小鼠巨噬细胞RAW264.7野生型、gsdmd-/-缺陷型和人单核细胞THP-1分化的巨噬细胞（differentiated THP-1,dTHP-1）建立体外感染模型。***对巨噬细胞焦亡的影响收集各感染组巨噬细胞培养液,离心取上清,按照乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase,LDH）细胞毒性检测试剂盒说明,动态分析细胞死亡情况;制作不同时间段巨噬细胞爬片,瑞氏-吉姆萨染色,光学显微镜下观察沙门菌感染巨噬细胞的动态过程及其导致的细胞形态变化;提取各巨噬细胞感染组不同时间段的全细胞裂解液,Western Blot检测GSDMD-NT水平。***对巨噬细胞释放中性粒细胞趋化因子CXCL2和CXCL3的影响收集不同时段各巨噬细胞感染组细胞培养液,离心取上清,按照中性粒细胞趋化因子CXCL2和CXCL3的ELISA检测试剂盒说明,动态检测其水平,分析spvc对沙门菌感染的巨噬细胞释放CXCL2和CXCL3的影响及其与GSDMD的关系。二、沙门菌质粒毒力基因spvc对中性粒细胞死亡及趋化因子受体CXCR2的影响本部分应用STM-WT、STM-△spvc及STM-△spvc/pspvc分别与人早幼粒细胞HL-60分化的中性粒细胞（differentiated HL-60,dHL-60）建立体外感染模型。***对中性粒细胞死亡的影响受试菌分别以MOI（10:1）和MOI（20:1）与dHL-60共作用,收集不同时段各中性粒细胞感染组细胞培养液,按照LDH细胞毒性检测试剂盒说明,离心取上清进行检测,动态分析细胞死亡情况。根据上述结果,3株受试菌分别以MOI（20:1）与dHL-60共作用,制作不同时段中性粒细胞爬片,瑞氏-吉姆萨染色,光学显微镜下动态观察沙门菌感染中性粒细胞过程及其导致的细胞形态变化;提取各感染组全细胞裂解液,Western Blot动态检测PAD4和Cit-H3的蛋白水平。***对中性粒细胞趋化因子受体CXCR2蛋白水平的影响受试菌分别以MOI（20:1）与dHL-60共作用,提取各感染组全细胞裂解液,Western Blot动态检测CXCR2的蛋白水平。三、沙门菌质粒毒力基因spvc对巨噬细胞和中性粒细胞相互作用的影响***对中性粒细胞释放IL-1β的影响STM-WT、STM-△spvc及STM-△spvc/pspvc 以 MOI（20:1）与 dHL-60 共作用,收集各感染组中性粒细胞培养液,离心取上清,按照IL-1β的ELISA检测试剂盒说明,动态检测IL-1β水平并分析比对。***对中性粒细胞募集效应的影响上述3株受试菌以MOI（10:1）与巨噬细胞dTHP-1共作用,收集感染4 h、12 h和24 h的细胞培养液于Transwell下室,上室放入dHL-60,共培养3 h,流式细胞术计数募集至下室的中性粒细胞数。结果:***对沙门菌感染的巨噬细胞焦亡的影响spvc对巨噬细胞死亡率的影响:各感染组感染4 h的LDH释放量无明显差异,各组LDH释放水平均随着感染时间延长而升高;感染12 h和24 h,STM-△spvc感染的各组巨噬细胞LDH释放量均高于野生株和回补株感染组;感染24 h,野生型RAW264.7的LDH释放水平明显高于gsdmd-/-缺陷型感染组。spvc对巨噬细胞形态的影响:各感染组感染4 h细胞形态较为完好,细胞内外细菌数较少,各组未见明显差异。随着感染时间延长,各感染组细胞形态完整性受到破坏,细胞内外细菌数增多;感染24h,STM-△spvc感染的各组巨噬细胞形态破坏更明显,细胞内外细菌数更多,且野生型RAW264.7相比于gsdm-/-缺陷型RAW264.7的STM-△spvc感染组细胞破

关键词：沙门菌质粒毒力基因 spvc 巨噬细胞中性粒细胞细胞焦亡趋化效应

鼠伤寒沙门菌spvB、spvc基因缺陷变异株的构建及其生物学特性研究

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鼠伤寒沙门菌spvB、spvC基因缺陷变异株的构建及其生物学特性研究

作者：吴春雪南昌大学

学位级别：硕士

目的：构建鼠伤寒沙门菌spvB、spvc基因缺陷变异株，并对其生物学特性进行比较研究。为探讨鼠伤寒沙门菌质粒毒力基因spvB、spvc致病机制提供理论和实验依据，并为后续细胞实验及利用小鼠模型进一步研究该基因的功能提供工具和手段。 ... 详细信息

目的：构建鼠伤寒沙门菌spvB、spvc基因缺陷变异株，并对其生物学特性进行比较研究。为探讨鼠伤寒沙门菌质粒毒力基因spvB、spvc致病机制提供理论和实验依据，并为后续细胞实验及利用小鼠模型进一步研究该基因的功能提供工具和手段。方法： 1、用自杀质粒介导的同源重组方法，制备鼠伤寒沙门菌spvB/spvc基因缺陷变异株。根据GeneBank数据库中鼠伤寒沙门菌质粒毒力基因spvB/spvc序列，用Primer Premier5.0软件设计PCR特异性引物，并在各个引物5’末端加上适当的酶切位点，分别扩增获得spvB/spvc基因缺陷性核苷酸片段后，连接至自杀质粒pCVD442。将重组的阳性自杀质粒转化入感受态细菌SM10λpir内，并以接合转移的方法导入含有spvB/spvc基因的鼠伤寒沙门菌野生株中，用蔗糖诱导同源重组。以PCR扩增方法观察重组现象，将完全重组的菌株作为spvB/spvc基因的缺陷变异株，挑选稳定传代的突变株并进行基因测序鉴定。 2、鼠伤寒沙门菌spvB、spvc基因缺陷变异株及野生株的生物学特性比较研究。对两个缺失菌株的遗传稳定性、生长特性及酸性条件下的生存能力进行比较研究。分别将菌株在LB液体培养基中37℃培养12h，每隔1h取样平板计数。将菌株分别在LB琼脂平板中连续传代50代，每隔5代挑取单菌落，PCR扩增鉴定，以研究缺失的基因在鼠伤寒沙门菌基因缺陷变异株中的遗传稳定性。用2mL PH4.0的新鲜LB培养基分别培养基因缺失菌株及野生型鼠伤寒沙门菌2h，从第0h起每隔1h取菌液适当稀释后采用平板活菌计数法测定活菌数，计算生存率。结果： 1、成功构建鼠伤寒沙门菌spvB、spvc基因缺陷株，经PCR及序列分析证实，spvB变异株中spvB基因的编码区有1749个碱基缺失，spvc基因变异株中spvc基因的编码区有711个碱基缺失，且没有发生极性突变。 2、基因缺陷变异株与野生型相比，无酸条件下的生长特性没有明显差别。酸性条件下，spvB、spvc基因缺陷株和野生株的活菌数都比非酸性条件下的活菌数明显降低;且三组菌株在培养第2h时后的生存率均低于第1h后的生存率，差异有明显统计学意义（Pspvc基因缺陷株在酸性环境中培养1h、2h后接种到LB平板生长的菌落数（活菌数）比野生株明显减少（P0.05）;在第2h的spvB基因缺陷株的活菌数低于spvc基因缺陷株的活菌数，差异有统计学意义（P0.05）。结论： 1、运用自杀质粒成功构建了鼠伤寒沙门菌质粒毒力基因spvB/spvc基因缺陷变异株;为进一步研究该质粒基因的功能提供了工具和手段。 2、基因缺陷变异株与野生型相比，在无酸条件下的生长特性没有明显差别;酸性环境对沙门菌的生长有一定的选择性，且在接触酸性环境的2h内随着时间的延长选择性逐渐增强;沙门菌质粒毒力基因spvB、spvc在鼠伤寒沙门菌克服酸应激时可能发挥重要作用，但两基因之间比较对耐酸的影响无明显差异。

关键词：鼠伤寒沙门菌 spvB spvc 基因缺陷变异同源重组生长曲线

鼠伤寒沙门菌***基因共同缺陷变异株的构建及spvB、spvc基因对中毒症状、免疫功能的影响

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鼠伤寒沙门菌***基因共同缺陷变异株的构建及spvB、spvC基因对中...

作者：刘晓艳南昌大学

学位级别：硕士

目的:实验组前期已构建鼠伤寒沙门菌spvB/spvc基因缺陷株,故本研究仅构建鼠伤寒沙门菌***基因共同缺陷株,并将野生菌株与这三株缺陷变异株感染小鼠,观察分析spvB/spvc基因对中毒症状、免疫调节功能的影响。为研究鼠伤寒沙门菌spvB/spvc... 详细信息

目的:实验组前期已构建鼠伤寒沙门菌spvB/spvc基因缺陷株,故本研究仅构建鼠伤寒沙门菌***基因共同缺陷株,并将野生菌株与这三株缺陷变异株感染小鼠,观察分析spvB/spvc基因对中毒症状、免疫调节功能的影响。为研究鼠伤寒沙门菌spvB/spvc毒力基因的致病机制提供理论和实验依据,并为后续细胞实验进一步研究该基因的功能及疫苗的制备提供工具和手段。方法:1.同源重组法制备鼠伤寒沙门菌***基因共同缺陷株。在GeneBank数据库中查出鼠伤寒沙门菌毒力基因spv序列(包括spvABCD),给spvB、spvc设计两对特异性引物,并在引物的5’末端加上酶切位点,PCR法扩增spvB基因上游及spvc基因下游的核苷酸片段后,连接至自杀质粒pCVD442(pCVD442-Δ***)。再将pCVD442-Δ***入感受态细菌SM10λpir内,按接合转移法使pCVD442-Δ***导入野生型鼠伤寒沙门菌211(spvB+.spvc+)中,随后蔗糖诱导同源重组。用PCR扩增来观察重组情况,将稳定的完全重组株认为是***基因共同缺陷变异株,并送基因测序鉴定。2.沙门菌spvB/spvc基因对中毒症状、免疫调节功能影响的研究。所有BALB/c小鼠均给予自由进食、饮水,室温(20℃-22℃),湿度(50%-55%)饲养。随机分为PBS组、野生型沙门菌211(Samonella typhimurium,STM.211)组、敲除spvB基因的沙门菌(STM.211-ΔspvB)组、敲除spvc基因的沙门菌(STM.211-Δspv C)组和同时敲除spv ***基因的沙门菌(STM.211-Δ***)组,每组25只。PBS组经腹腔注射(intraperitoneal,i.p.)0.2ml PBS,其余各组分别注射0.2ml 105CFU的STM.211、STM.211-ΔspvB、STM.211-Δspvc、STM.211-Δ***。造模完成后观察小鼠精神状态、运动情况、腹泻、体重、毛发改变等感染中毒症状,于感染后1 d、3 d、5 d、7 d、9 d,每组随机取5只小鼠摘眼球取血,用ELISA法测定血清IL-10、IL-12、IFN-γ水平;并分离小鼠肝、脾,观察靶器官大体观及显微镜下的病理改变。结果:1.成功构建了稳定的鼠伤寒沙门菌***基因共同缺陷株(STM.211-Δ***),PCR及测序分析证实***基因共同缺陷株中编码区有1965个碱基缺失。***/c小鼠在感染沙门菌后第1天不同程度的出现聚集蜷缩、运动减少、精神萎靡,毛发疏松,部分小鼠出现激惹症状,第3-5天时症状最明显,但均无腹泻症状。STM.211、STM.211-ΔspvB和STM.211-Δspvc组的中毒症状明显较PBS组严重,STM.211-Δ***组与PBS组间无明显差异;沙门菌感染后,IFN-γ和IL-12分泌量显著增高,而IL-10升高的程度较低,产生以Th1优势应答为主的免疫反应,但不同菌株感染组间细胞因子分泌存在差异,STM.211组、STM.211-ΔspvB组、STM.211-Δspvc组的IFN-γ和IL-12分泌量均显著低于STM.211-Δ***组(p0.05)。结论:1.运用自杀质粒介导同源重组法成功构建鼠伤寒沙门菌*** C基因共同缺陷变异株;并为后续细胞实验进一步研究该基因的功能及疫苗的制备提供工具和手段。***/spvc基因相对抑制TH1细胞因子IFN-γ和IL-12的分泌,促进TH2细胞因子IL-10的分泌,使免疫应答向TH2方向偏移,出现TH1/TH2漂移。可见,spvB/spvc基因具有转换不同免疫应答类型的功能,从而有利于病原菌抵抗和逃避宿主的免疫防御,加重感染结局。

关键词：鼠伤寒沙门菌 spvB spvc 基因敲除免疫应答

磷酸苏氨酸裂解酶spvc的晶体结构与功能研究

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磷酸苏氨酸裂解酶SpvC的晶体结构与功能研究

作者：陈琳洁中国协和医科大学

学位级别：硕士

在动物与植物的固有免疫反应中，进化保守的MAPKs起着重要的作用。而病原菌通常采取的策略就是干扰MAPK信号通路来逃避宿主的免疫反应。最近的研究表明，在动物与植物病原菌中高度保守的spvc蛋白属于一类新颖的酶家族——磷酸苏氨酸裂... 详细信息

在动物与植物的固有免疫反应中，进化保守的MAPKs起着重要的作用。而病原菌通常采取的策略就是干扰MAPK信号通路来逃避宿主的免疫反应。最近的研究表明，在动物与植物病原菌中高度保守的spvc蛋白属于一类新颖的酶家族——磷酸苏氨酸裂解酶，它可以不呵逆的使MAPKs失活从而抑制宿主免疫。与蛋白磷酸酶不同的是，磷酸苏氨酸裂解酶可以识别活化的MAPKs中的pThr-X-pTyr模体的pThr，通过切割C-OP键而不是O-P键来使之永久失活。虽然磷酸苏氨酸裂解酶对pThr-X-pTyr模体中的pTyr并没有活性，但是它更喜欢这种双磷酸化形式而不是单磷酸化形式。用pSer取代pThr-X-pTyr模体中的pThr既破坏了酶对底物的识别又降低了酶的催化效率，表明磷酸苏氨酸裂解酶更倾向于对pThr的磷酸基团的消除而不是对pSer。为了研究这个酶家族的催化反应机制，我们解析了spvc的晶体结构，发现其是一种新颖的由单一α／β紧密结合的结构域组成的折叠方式。spvc的核心由七个反向平行的β折叠片和八个α螺旋组成。spvc表面有一个明显的浅凹槽，是由L1、L2、L3环及五个β片盘绕在一起组成的，可能是底物结合的位点。由spvc酶家族的保守残基组成的两个相邻的碱性表面，可能对双磷酸底物中的磷酸基团的识别很重要，这一点已经被进一步的点突变实验证实。保守的K136残基可能作为催化残基参与消除反应。这些结果不仅为这个酶家族所具有的独特的催化反应机制提供了一些启示，同时也为我们设计小分子治疗药物提供了一条新的思路。

关键词： spvc MAPKs HopAI1酶家族磷酸苏氨酸裂解酶