检索结果-南通市图书馆

作者：李丹丹山东农业大学

学位级别：硕士

传粉是开花植物有性生殖过程的关键环节。成熟花粉落在柱头表面,经历粘附、水合、萌发等过程并长出花粉管。花粉管穿过柱头和花柱生长,到达子房,完成双受精过程。花粉和柱头互作对植物传粉识别是至关重要的。其中,花粉水合是一个决定花... 详细信息

传粉是开花植物有性生殖过程的关键环节。成熟花粉落在柱头表面,经历粘附、水合、萌发等过程并长出花粉管。花粉管穿过柱头和花柱生长,到达子房,完成双受精过程。花粉和柱头互作对植物传粉识别是至关重要的。其中,花粉水合是一个决定花粉在柱头表面萌发的关键步骤。植物非酵解型蔗糖激酶1复合体(Sucrose Nonfermenting Related Protein Kinase 1 complex,Sn RK1 complex)是糖信号转导过程中的关键调控因子,主要参与了代谢、激素和发育信号的转导。Sn RK1 complex包括一个催化亚基α和两个调控亚基β、γ/βγ。KINβγ是植物Sn RK1 complex特有的亚基,优先在拟南芥花粉的营养细胞中表达。kinβγ/+突变体花粉内部活性氧水平降低,突变体花粉在野生型柱头表面水合异常。研究结果表明KINβγ参与调控花粉内的活性氧水平,以及花粉在柱头表面的水合过程。为了进一步验证活性氧是否参与调控花粉在柱头表面的水合,我们构建了在花粉内过表达拟南芥过氧化氢酶基因CATALASE 3(CAT3)的载体并转化拟南芥。q RT-PCR检测到转基因株系花粉中CAT3表达上升,花粉粒内部活性氧水平有不同程度的降低。进一步观察发现CAT3过表达株系的花粉在柱头表面的水合受到抑制。FISSION1A(FIS1A)是一种线粒体和过氧化物酶体定位的蛋白,对两种细胞器分裂是必需的。fis1A突变体花粉的活性氧水平与野生型相比显著降低;将突变体的花粉授到野生型柱头上5min后,发现部分花粉不能水合。进一步表明花粉内的活性氧水平介导花粉在柱头表面的水合。为了进一步研究kinβγ突变体花粉不能在柱头表面水合的原因,我们通过RNA-seq分析了kinβγ突变体花粉的基因表达,鉴定出213个上调的基因和146个下调的基因。为了鉴定KINβγ参与调控基因表达的关键DNA序列,我们分析了kinβγ-2/+中下调和上调基因的启动子区域(距离转录起始位点上游1000 bp)。我们发现这些基因的启动子富含WRKY转录因子优先结合序列W-box元件TTGAC(C/T)。spik是定位在质膜上的K通道并在K跨膜运输中起作用。RNA-seq数据显示在kinβγ花粉中内流K通道Shaker Pollen Inward Kchannel(spik)的表达下调。考虑到K在渗透调节中起重要作用,我们推测spik可能参与KINβγ调节花粉的水合。我们观察了拟南芥spik的一个突变体spik-1花粉的水合情况。在花粉萌发培养基上,spik-1花粉的水合与野生型无明显差别。但是突变体花粉在野生型柱头表面的水合出现异常。为了验证kinβγ花粉中K转运是否受到影响,我们测定了野生型与kinβγ-1/+以及kinβγ-2/+花粉粒的钾含量,发现kinβγ突变体花粉中钾含量明显降低。这些结果表明,除了活性氧之外,拟南芥Sn RK1 complex调节spik的表达参与调控花粉在柱头表面的水合。

关键词：拟南芥 SnRK1复合体活性氧花粉水合 spik

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杧果钾通道基因Mispik的克隆、表达与功能分析

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生物技术通报 2022年第10期38卷 164-172页

作者：韩蕾李俊林高爱平黄建峰李建召宋志忠鲁东大学农林工程研究院山东省高校作物高产抗逆分子模块育种重点实验室烟台264025 中国热带农业科学院作物品种资源研究所海口571100 南京林业大学林学院南京210037 剑桥大学植物系剑桥英国CB23EA

Shaker类型钾通道在植物生长发育中起重要作用,其在果树中的生物学功能依然未知。克隆并揭示杧果spik钾通道基因的功能,为研究热带果树Shaker类型钾通道的生物学功能提供基因资源和理论基础。以杧果品种‘桂热82’为材料,利用RACE-PCR... 详细信息

Shaker类型钾通道在植物生长发育中起重要作用,其在果树中的生物学功能依然未知。克隆并揭示杧果spik钾通道基因的功能,为研究热带果树Shaker类型钾通道的生物学功能提供基因资源和理论基础。以杧果品种‘桂热82’为材料,利用RACE-PCR技术克隆Shaker类型钾离子通道基因Mispik(GenBank ID:OM179914),利用生物信息学手段分析该基因及编码蛋白的序列特征,通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分析该基因的组织特异性表达特征,及其在转录水平对缺钾、高钾、低温、NaCl和PEG处理等5种非生物胁迫的响应情况,并创制Mispik超表达转基因拟南芥株系。结果显示,Mispik蛋白的分子量为90006.83 kD,等电点(pI)为7.59,含有6个跨膜结构,属于不稳定的亲水蛋白。杧果Mispik与梨Pbrspik和拟南芥Atspik的氨基酸序列一致性高达59.46%,三者紧密聚为一类,遗传距离最近。在转录水平上,Mispik在杧果花粉中特异性表达,并在一年生嫁接苗根部受缺钾或NaCl处理的抑制均显著降低,受高钾、PEG或低温胁迫诱导而显著增强。Mispik在拟南芥中表达后增强了转基因株系的钾素富集能力,并促进转基因植株提早抽薹和开花。杧果Mispik是花粉中特异表达的Shaker类型钾通道基因,其表达水平易受多种非生物胁迫的调控,可能在杧果钾素营养高效与利用中发挥作用。

关键词：杧果 Shaker类型钾离子通道 spik 花粉异源超表达

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DG1调控拟南芥花粉发育及花粉管在雌蕊组织中生长的研究

DG1调控拟南芥花粉发育及花粉管在雌蕊组织中生长的研究

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作者：曹梦醒山东农业大学

学位级别：硕士

被子植物花粉在柱头表面的萌发与生长依赖花粉与柱头的相互识别。而这一识别机制的研究能让人们更好的理解授粉过程中雄配子体与雌蕊组织的相互作用。内吞作用通过将胞外物质、膜蛋白以及脂类转运到细胞内,参与调控植物的生长发育以及... 详细信息

被子植物花粉在柱头表面的萌发与生长依赖花粉与柱头的相互识别。而这一识别机制的研究能让人们更好的理解授粉过程中雄配子体与雌蕊组织的相互作用。内吞作用通过将胞外物质、膜蛋白以及脂类转运到细胞内,参与调控植物的生长发育以及信号转导过程。研究表明网格蛋白介导的内吞在调控花粉管生长以及花粉管与雌蕊组织的互作中起作用。但是花粉管的内吞作用调控花粉管与雌蕊组织互作的分子机制还不清楚。拟南芥Defective Pollen Tube Growth1(DG1)基因编码的蛋白属于衔接蛋白类似物。DG1在12时期的花粉中开始表达,并且在萌发后的花粉管顶端也有表达。DG1定位于花粉管的亚顶端细胞质及质膜。研究表明DG1参与网格蛋白介导的内吞。为了研究DG1在花粉发育中的作用,我们利用CRISPR/Cas9技术对DG1进行突变,得到了一个DG1翻译提前终止的突变体dg1-3/+。对此突变体的花粉进行亚历山大染色观察,发现有一半的花粉形态异常且不能萌发。进一步观察发现突变体花粉从12时期开始出现胼胝质的异常积累,同时纤维素及果胶质的分布也存在不同程度的异常。为了研究DG1在花粉管生长中的作用,我们构建了雌激素诱导的通过artificial microRNA技术降低DG1表达的pER8::amiRNA-DG1载体。其拟南芥转基因株系的花粉能够在经过雌激素处理的柱头表面萌发,花粉管可以在柱头乳突细胞表面生长,但是无法生长进入花柱的引导组织。这一结果表明,DG1调控花粉管在雌蕊组织中的生长。为进一步研究DG1调控花粉管生长的机制,我们利用酵母双杂交的方法筛选拟南芥花粉的cDNA文库,寻找DG1内吞的货物蛋白。我们筛选到了果胶甲酯酶PME和膜定位的钾离子通道蛋白spik与DG1互作,进而利用膜蛋白酵母双杂交系统和Pull-down技术确认它们与DG1互作。内吞过程中,衔接蛋白通过结合货物蛋白中保守的Y-X-X-Phi氨基酸位点参与货物蛋白的内吞。不同物种的spik同源序列比对发现,拟南芥spik中含有保守的Y-I-L-V序列。将该序列的Y突变后,spik不能与DG1的μHD结构域互作,表明DG1可能通过识别spik的Y-I-L-V序列调控其内吞。在pPME::PME-RFP转基因植株中,PME-RFP定位于花粉管顶端的质膜及细胞壁上,而且其定位受到内吞抑制剂Tyr A23的影响。进一步,我们分离到了拟南芥PME的T-DNA插入的敲除突变体pme,发现pme突变体与dg1-3突变体花粉的表型相类似,花粉从第12时期开始出现胼胝质的异常积累以及形态的异常,最终表现为花粉败育。为了揭示PME是否影响花粉管在柱头表面的生长,我们构建了pER8::amiRNA-PME的载体转化拟南芥,观察转基因株系花粉在雌激素处理过的柱头表面的生长情况。这些结果将有助于我们更好的分析DG1调控花粉管在柱头表面生长的作用机制。

关键词：拟南芥内吞作用衔接蛋白 DG1 spik PME

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