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sphk2促进人卵巢癌细胞侵袭转移及其机制探讨

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现代妇产科进展 2020年第4期29卷 276-280页

作者：宋柯琦戴岚狄文上海交通大学医学院附属仁济医院妇产科上海200127 上海市妇科肿瘤重点实验室上海200127 癌基因及相关基因国家重点实验室上海200127

目的:研究鞘氨醇激酶2(sphk2)对人卵巢癌细胞系SKOV3和HO8910细胞侵袭和迁移能力的影响,探讨其可能调控机制。方法:设计并体外合成靶向sphk2的shRNA(short hairpin RNA)序列(shRNA sphk2)及阴性对照序列(shRNA NC),并与LV3(H1/GFP&Puro... 详细信息

目的:研究鞘氨醇激酶2(sphk2)对人卵巢癌细胞系SKOV3和HO8910细胞侵袭和迁移能力的影响,探讨其可能调控机制。方法:设计并体外合成靶向sphk2的shRNA(short hairpin RNA)序列(shRNA sphk2)及阴性对照序列(shRNA NC),并与LV3(H1/GFP&Puro)慢病毒载体重组形成shRNA表达载体,包装shRNA慢病毒颗粒后分别转染SKOV3和HO8910细胞系。分别用Real-time PCR和Western blot法检测shRNA sphk2病毒颗粒转染后在mRNA及蛋白水平的沉默效率。Transwell小室实验检测细胞迁移和侵袭能力变化;Western blot法检测sphk2敲降后细胞中MMP-9蛋白表达。结果:用构建的shRNA慢病毒颗粒感染SKOV3和HO8910细胞后,sphk2 mRNA和蛋白表达水平显著下降。SKOV3和HO8910细胞中,shRNA sphk2转染组的迁移和侵袭细胞数均显著少于shRNA NC组和未转染组,差异均有统计学意义(Psphk2转染组中MMP-9蛋白表达明显下降(Psphk2可促进卵巢癌细胞的迁移和侵袭,其分子机制可能与调节MMP-9表达有关,提示sphk2在卵巢癌的发展转移中起着重要的作用。

关键词： sphk2 卵巢癌侵袭迁移 MMP-9

miR-137调节靶基因sphk2抑制胶质瘤细胞增殖作用的研究

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miR-137调节靶基因SPHK2抑制胶质瘤细胞增殖作用的研究

作者：周钱安徽医科大学

学位级别：硕士

目的:探讨mi R-137调节靶基因sphk2对胶质瘤细胞增殖的影响。方法:1.用锁核酸探针原位杂交技术(ISH)检测WHO II-IV级共60例胶质瘤组织和10例非肿瘤对照脑组织中mi R-137的表达水平;采用免疫组织化学方法(IHC)检测上述组织标本中sphk2、K... 详细信息

目的:探讨mi R-137调节靶基因sphk2对胶质瘤细胞增殖的影响。方法:1.用锁核酸探针原位杂交技术(ISH)检测WHO II-IV级共60例胶质瘤组织和10例非肿瘤对照脑组织中mi R-137的表达水平;采用免疫组织化学方法(IHC)检测上述组织标本中sphk2、Ki-67的表达水平;分析sphk2、mi R-137与Ki-67表达水平之间的关系;分析sphk2、mi R-137与Ki-67表达水平与肿瘤级别的关系,明确其在胶质瘤辅助病理诊断中的意义。2.采用Western blot检测和比较种常见胶质母细胞瘤(GBM)细胞系及人星形胶质细胞系(HA)sphk2的表达水平;用免疫荧光技术检测U87和U251细胞中sphk2的定位情况及表达水平。3.利用生物信息学软件预测mi R-137的靶基因并通过荧光素酶实验验证预测结果。利用mi R-137mimics转染GBM细胞系,观察mi R-137对sphk2m RNA和蛋白含量的影响,以证实上述mi RNA对靶基因表达的调节作用和机制。4.采用克隆形成实验以及Ed U细胞增殖实验等方法检测mi R-137 mimics转染对GBM细胞增殖的影响;通过sphk2真核表达质粒转染观察补充外源性sphk2能否逆转mi R-137对GBM细胞增殖的影响,探索该mi RNA抑制胶质瘤细胞增殖的分子通路。结果:***显示,与非肿瘤对照脑组织相比,胶质瘤中mi R-137阳性标记指数(LI%)均明显降低;IHC显示,与非肿瘤对照脑组织相比,胶质瘤中sphk2、Ki-67阳性标记指数(LI%)均明显升高,仅Ki-67随肿瘤级别的升高而升高,而其余指标在各级别胶质瘤间无明差异;相关分析显示,mi R-137 LI%与Ki-67 LI%呈显著性负相关,而sphk2 LI%与Ki-67 LI%呈正相关;ROC曲线分析显示,mi R-137、sphk2均可作为胶质瘤辅助诊断的诊断标记物,其中mi R-137对高低级别胶质瘤的诊断也有一定的意义。2.九种GBM细胞系中仅A172和U118两个细胞系sphk2的表达略低于HA细胞,其余胶质瘤细胞系中sphk2表达水平均显著高于HA中sphk2的表达。免疫荧光结果也显示,sphk2在U87和U251细胞系中高表达,且主要定位于细胞核。3.生物信息学分析及荧光素酶实验均证实在胶质瘤细胞中,sphk2基因是mi R-137的靶基因,q RT-PCR及Western blot检测结果显示mi R-137mimics转染可降低GBM细胞系sphk2蛋白的水平,而sphk2 m RNA水平并没有变化,证实mi R-137可通过抑制sphk2翻译过程在转录后抑制靶基因编码蛋白的表达。4.平板克隆实验及Ed U实验检测结果显示mi R-137可明显抑制GBM细胞增殖,且上述效应可被补充外源性sphk2部分逆转。结论:1.人胶质瘤组织的肿瘤细胞中普遍有mi R-137表达的异常减少和sphk2表达的异常增加;mi R-137、sphk2的表达水平均与胶质瘤密切相关,可作为辅助胶质瘤诊断重要参考指标,且上述各指标间存在相关性。2.在胶质瘤细胞中,mi R-137是sphk2表达的重要负调节因子,mi R-137表达异常减少是胶质瘤细胞中sphk2异常过表达的重要原因,在胶质瘤增殖和发生发展调控中起到重要作用。

关键词：胶质瘤微小RNA sphk2 增殖

肝脏特异敲除sphk2调控NAFLD的分子机制及虎杖苷的干预研究

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肝脏特异敲除SphK2调控NAFLD的分子机制及虎杖苷的干预研究

作者：李锐广东药科大学

学位级别：硕士

第一部分目的:鞘氨醇激酶(sphingosine kinases,sphks)是生物体内催化鞘氨醇(sphingosine,Sp)并将其转化为生物活性物质1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate,S1P)的关键酶。sphks包含sphk1和sphk2两个亚型,调控S1P/神经酰胺(ceramide,Cer)的动态平衡,其在生物体内表达及活性的变化与多种疾病密切相关。目前sphk2在非酒精性脂肪肝(Non Alcoholic Fatty Liver Disease,NAFLD)疾病中的具体作用及相关分子机制尚不明确。本课题旨在探究sphk2在高脂饮食(high-fat diet,HFD)诱导小鼠肝脏脂质代谢紊乱及NAFLD疾病进程中的具体作用及分子机制,为NAFLD的防治及新型药物靶点的筛选提供前期实验依据。方法:1、本研究采用野生型WT小鼠与肝细胞特异敲除sphk2基因(sphk2)小鼠HFD诱导20周。动物水平上探索sphk2与NAFLD的相关性及其在NAFLD进程中的作用;2、体外细胞水平,提取WT小鼠、sphk2小鼠原代肝细胞,采用棕榈酸(palmic acid,PA)模拟小鼠肝细胞脂毒性,检测sphk2对肝细胞脂毒性的影响如:肝细胞损伤水平、甘油三酯(triglycerides,TG)沉积水平和肝细胞脂质代谢相关信号通路的基因表达情况等。3、通过小鼠肝脏代谢组学检测筛选出受sphk2调控的显著差异代谢物,同时在原代肝细胞中验证sphk2与代谢物的关系及相关分子机制。结果:1、WT与sphk2小鼠HFD诱导20周,sphk2小鼠肝脏表现出更加严重肝脏脂质沉积、空泡样变、胰岛素抵抗;2、sphk2小鼠肝细胞损伤及线粒体肿胀程度较WT小鼠加重。3、体外实验结果表明PA诱导的原代sphk2肝细胞同样表现出更为严重细胞脂毒性,包括胞内TG累积及肝细胞损伤。4、sphk2小鼠肝脏PPARγ-CD36脂质摄取信号通路过度激活,进一步加重肝内脂质累积。结论:肝细胞sphk2参与HFD诱导的小鼠肝脏脂质代谢紊乱并影响NAFLD疾病进程。其作用机制可能通过干预PPARγ-CD36信号通路,调控肝细胞游离脂肪酸的摄取和肝内TG含量,干预肝脏胰岛素敏感性,进而影响NAFLD的发生发展。本研究提示sphk2有望成为针对NAFLD的药物研发的新靶点。第二部分目的:非酒精性脂肪性肝炎(Nonalcoholic steatohepatitis,NASH)是以肝细胞脂质沉积及炎症细胞浸润为特点的疾病。目前临床尚无特效药物进行干预治疗。中药单体虎杖苷(Polydatin,PD),即白藜芦醇苷,具有良好的抗氧化和抗炎药理活性。PD相较于白藜芦醇具有更好的水溶性、抗氧化性和更低的药物毒性。本实验室前期研究表明PD可以改善四氯化碳诱导小鼠肝纤维化。基于前期研究,本课题将探究PD对NASH及肝纤维化的药效及分子机制。方法:1、实验采用C57BL/6小鼠随机分为3组,对照组小鼠(8只)给予正常饲料,模型组小鼠(10只)给予蛋氨酸-胆碱缺乏(MCD)饲料诱导NASH合并肝纤维化,PD组小鼠(10只)在MCD诱导下每天腹腔注射5 mg/kg PD进行治疗,共持续4周。2、体外研究采用PA(0.25mM)诱导Hep G2细胞系进行。结果:1、给药组PD治疗四周后显著下调MCD诱导小鼠血清丙氨酸转氨酶(ALT),天冬氨酸转氨酶(AST)。同时PD显著抑制了caspase-3、TUNEL阳性表达及MCD小鼠肝脏TG含量。2、PD抑制NOX4氧化酶、炎症因子CD68和Toll样受体(TLR)4/NF-κB p65信号通路。3、PD改善脂多糖(LPS)协同或PA诱导的肝细胞脂质堆积、炎症及肝细胞凋亡。4、PD显著抑制NASH小鼠相关肝纤维化指标。结论:1、PD改善MCD饮食诱导NASH小鼠的肝损伤及肝脏脂质沉积;2、PD通过抑制氧化应激和炎症反应从而抑制NASH及肝纤维的进展。本研究提示PD有望开发成为一种治疗NASH合并纤维化的新型药物。

关键词： sphk2 NAFLD 肝脏胰岛素抵抗脂质沉积 CD36 虎杖苷 NASH 肝纤维化炎症氧化应激

上调LncRNA FEZF1-AS1通过miR-363-3p/sphk2信号轴促进宫颈癌细胞的机制

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河北医药 2023年第13期45卷 1946-1950页

作者：刘俊丽张竣贺清波张秀珍孙萍胡晓君陕西省肿瘤医院妇瘤科西安市710061

目的探讨LncRNA FEZF1-AS1对宫颈癌细胞增殖、侵袭及上皮间充质转化(EMT)的影响及作用机制。方法实时荧光定量PCR分析宫颈癌组织、癌旁正常组织、Hela、H8细胞中LncRNA FEZF1-AS1、miR-363-3p和sphk2的表达;siRNA FEZF1-AS1转染Hela细胞... 详细信息

目的探讨LncRNA FEZF1-AS1对宫颈癌细胞增殖、侵袭及上皮间充质转化(EMT)的影响及作用机制。方法实时荧光定量PCR分析宫颈癌组织、癌旁正常组织、Hela、H8细胞中LncRNA FEZF1-AS1、miR-363-3p和sphk2的表达;siRNA FEZF1-AS1转染Hela细胞,MTT、细胞侵袭实验及Western blot检测下调FEZF1-AS1对Hela细胞增殖、侵袭和EMT的影响。miRanda软件分析LncRNA FEZF1-AS1和miR-363-3p之间的靶向关系,双荧光素酶报告基因实验检测二者的相关性。下调miR-363-3p表达,分析Hela细胞增殖、侵袭和EMT。同时上调LncRNA FEZF1-AS1和miR-363-3p表达,检测LncRNA FEZF1-AS1通过miR-363-3p对Hela细胞增殖、侵袭和EMT的影响。TargetScan分析miR-363-3p和sphk2之间的靶向关系,双荧光素酶报告基因实验检测miR-363-3p和sphk2相关性。siRNA sphk2转染Hela细胞,检测Hela细胞增殖、侵袭和EMT能力。结果与H8细胞相比,Hela细胞中LncRNA FEZF1-AS1、sphk2表达上调(Psphk2具有靶向关系。下调sphk2表达抑制了Hela细胞增殖、侵袭与EMT。结论上调LncRNA FEZF1-AS1通过miR-363-3p/sphk2轴促进Hela细胞增殖、侵袭及其EMT。

关键词： LncRNA FEZF1-AS1 miR-363-3p sphk2 Hela细胞增殖

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鞘氨醇激酶2(sphk2)基因敲除小鼠繁殖及基因型鉴定

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广东药科大学学报 2017年第4期33卷 547-550页

作者：李柠李昌正杨桂智颜思珊李锐刘冰兰天广东药科大学药学院广东广州510006 广东药科大学基础学院广东广州510006

目的繁殖和快速鉴定鞘氨醇激酶2(sphk2)基因敲除小鼠。方法将sphk2敲除杂合子小鼠进行配种繁殖,提取子代小鼠尾部DNA,用PCR方法检测子代小鼠基因型。结果 sphk2杂合子小鼠的饲养及繁殖均获得成功,获得子代小鼠,基因型分别为杂合子(sphk2... 详细信息

目的繁殖和快速鉴定鞘氨醇激酶2(sphk2)基因敲除小鼠。方法将sphk2敲除杂合子小鼠进行配种繁殖,提取子代小鼠尾部DNA,用PCR方法检测子代小鼠基因型。结果 sphk2杂合子小鼠的饲养及繁殖均获得成功,获得子代小鼠,基因型分别为杂合子(sphk2^(+/-))、纯合子(sphk2^(-/-))和野生型(sphk2^(+/+))。结论 sphk2基因敲除小鼠的繁育和鉴定均获得成功,为进一步研究sphk2生物学功能提供了理想的动物模型。

关键词： sphk2 基因敲除小鼠基因型

Advance in the Study of the Mechanisms Regulated by Sphingosine-1-Phosphate

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Science Foundation in China 2010年第1期18卷 57-60页

作者： Fei Ye Xiangqian Kong Cheng Luo Drug Discovery and Design Center(DDDC) State Key Laboratory of Drug Research Shanghai Institute of Materia MedicaChinese Academy of SciencesShanghai 201203China

Sphingosine-1-phosphate（S1P） is a bioactive lipid messenger in the cells that regulate gene expression and NF-κB signal pathway through unknown ***,Cheng Luo,associate professor of DDDC in Shanghai Institute of Materia Medica,whose project was funded by the National Natural Science Foundation of China,joined in a research team led by Professor Sarah Spiegel of Virginia Commonwealth *** team continuously made significant breakthroughs in understanding the regulation mechanism of Sphingosine-1- *** September 2009,in a paper published on SCIENCE magazine（Science 2009, 325：1254-7）,they firstly demonstrated that S1P is a physiologically important regulator of histone deacetylases（HDACs）,HDACs are direct intracellular targets of ***,they identified the mechanism that S1P regulates gene expression through regulating the activity of *** June 24th,2010,in another paper to be published on NATURE magazine（Nature 2010,June 24th,advance online publication,（doi：10.1038/ nature09128）） which reports the regulation of NF-κB signaling pathway by *** demonstrate that S1P is the missing cofactor for TRAF2（tumour-necrosis factor receptor-associated factor 2） and indicate a new paradigm for the regulation of lysine-63- linked *** study also highlight the key role of sphk1 and its product S1P in TNF-αsignalling and the canonical NF-κB activation pathway, and then play crucial role in inflammatory,antiapoptotic and immune *** identification of new mechanisms fay which S1P regulates gene expression and TNF and NF-κB signaling pathway will light up the road to develop novel inhibitors that might be useful for treatment of cancer and in- flammatory diseases.

关键词： SIP sphk1 sphk2 HDAC TRAF2 NF-kB signaling pathway

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鞘氨醇磷酸酯调控机制的研究进展

中国科学基金 2010年第5期24卷 279-282页

作者：叶飞孔祥谦罗成中国科学院上海药物研究所新药研究国家重点实验室上海201203

鞘氨醇磷酸酯(Sphingosine-1-phosphate,S1P)是一种存在于细胞中具有生物活性的脂质信使,关于这类脂质信使在核内如何调控基因表达及在细胞质中如何调控NF-κB信号通路机制尚未明确。国家自然科学基金项目承担者、上海药物研究所罗成副... 详细信息

鞘氨醇磷酸酯(Sphingosine-1-phosphate,S1P)是一种存在于细胞中具有生物活性的脂质信使,关于这类脂质信使在核内如何调控基因表达及在细胞质中如何调控NF-κB信号通路机制尚未明确。国家自然科学基金项目承担者、上海药物研究所罗成副研究员与美国弗吉尼亚联邦大学Sarah Spiegel教授开展合作研究,在该领域研究连续取得重大突破。2009年9月,该研究团队在《科学》(Science)杂志首次提出S1P是一种组蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylase,HDAC)内源性生理调节因子,HDAC是S1P在核内的直接作用靶标,S1P通过调控HDAC,进而达到调控基因表达的功能。2010年6月24日,该团队在《自然》(Nature)杂志上阐明了S1P在NF-κB信号通路上的调控机制,即TRAF2是S1P在胞内的一个新靶点,S1P是人们一直在探索的激活TRAF2的E3泛素连接酶活性的辅助因子,该研究提供了一个RIP1上K63位多聚泛素化调节的新模式,并且阐明了sphk1及其产物S1P在TNF-α信号通路和经典的NF-κB信号通路中的关键作用。S1P在调控基因表达和TNF-α信号通路和经典的NF-κB信号通路中的关键作用的新机制将为发展新型HDAC抑制剂,开发抗肿瘤、炎症及免疫疾病的新型药物提供新的关键线索。

关键词： S1P sphk1 sphk2 HDAC TRAF2 NF—κB信号通路

Research Progress on the Effect of Sphingosine Kinase 2 on Glioma

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Proceedings of Anticancer Research 2021年第6期5卷 16-19页

作者： Chunpeng Wang Xiaohui Liu Shiwen Guo Department of Neurosurgery The First Affiliated Hospital of Xi'an Jiao to ng University Xi'an 710000Shaanxi ProvinceChina Department of Internal Medicine-Oncology Anyang Cancer HospitalAnyang 455000Henan ProvinceChina

Objective:The purpose of this study is to explore the role of sphingosine kinase 2(sphk2)in the treatment of glioma,which is the most common primary tumor in the central nervous ***:A total of 82 patients were included in this study,with 27 cases in the control group and 55 cases in the glioma group;the expressions of sphk2 and gpl30 in the two groups were compared by immunohistochemical method,and the correlation between the two factors was ***:Both sphk2 and gpl30 were upregulated in the glioma group,and the two factors were significantly ***:The high expression of sphk2 may play an important role in the occurrence,development,and diagnosis of glioma.

关键词： Glioma sphk2 Diagnosis Biomarker