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海军军医大学学报 2023年第12期44卷 1421-1428页

作者：贺维刘梦梦张延琴潘鹭翔何磊顾锦涛高源周月媛张阔张英起郝强西北大学生命科学学院西安710069 空军军医大学药学系生物制药学教研室西安710032 空军军医大学西京医院核医学科西安710032

目的设计一种基于外泌体高效递送的方法,将治疗性核酸递送到肝癌组织治疗原发性肝癌。方法构建靶向肝癌的融合表达sp94和CD47的质粒,转染至HEK293T细胞后提取分离外泌体。通过透射电子显微镜及纳米颗粒跟踪分析、蛋白质印迹法等方法对... 详细信息

目的设计一种基于外泌体高效递送的方法,将治疗性核酸递送到肝癌组织治疗原发性肝癌。方法构建靶向肝癌的融合表达sp94和CD47的质粒,转染至HEK293T细胞后提取分离外泌体。通过透射电子显微镜及纳米颗粒跟踪分析、蛋白质印迹法等方法对外泌体进行鉴定。小鼠经尾静脉分别注射200μg DiD标记的未修饰外泌体和sp94修饰的外泌体,采用小动物活体成像仪检测并分析外泌体对肝癌组织的靶向作用。将未修饰外泌体和CD47修饰的外泌体分别与巨噬细胞RAW264.7、小鼠肝癌细胞Hepa1-6共孵育,验证细胞对修饰后外泌体的吞噬情况。通过电穿孔法将Polo样激酶1(PLK1)siRNA加载到不同修饰的外泌体中,再与Hepa1-6细胞共孵育,采用流式细胞术检测细胞凋亡水平。原发性肝癌模型小鼠经尾静脉注射加载PLK1 siRNA的修饰外泌体,系统研究并分析其对原发性肝癌的治疗效果。结果sp94修饰增强了外泌体对肝癌组织的靶向作用,CD47修饰减少了外泌体被巨噬细胞吞噬。sp94和CD47双修饰外泌体递送PLK1 siRNA促进了肝癌细胞凋亡。在原发性肝癌模型小鼠中,sp94和CD47双修饰外泌体加载PLK1 siRNA能有效抑制小鼠肝癌结节的生长,延长小鼠生存期。结论sp94和CD47双修饰外泌体可以高效靶向肝癌递送治疗性核酸PLK1siRNA,有效抑制肝癌的生长。

关键词：原发性肝癌外泌体靶向递送 sp94 CD47 Polo样激酶1 细胞凋亡

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肝细胞癌GPC3127-136-Hsp70 mRNA纳米颗粒疫苗的构建及体外功能验证

肝细胞癌GPC3127-136-HSP70 mRNA纳米颗粒疫苗的构建及体外功能验...

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作者：王宇西南大学

学位级别：硕士

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是目前最致命的恶性肿瘤之一,其发病率每年都呈百分比增长,在发展中国家HCC发病率较高。引发HCC的危险因素有很多,包括乙肝病毒和丙肝病毒的感染、脂肪性肝硬化、酒精性肝硬化、长期的吸烟史、... 详细信息

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是目前最致命的恶性肿瘤之一,其发病率每年都呈百分比增长,在发展中国家HCC发病率较高。引发HCC的危险因素有很多,包括乙肝病毒和丙肝病毒的感染、脂肪性肝硬化、酒精性肝硬化、长期的吸烟史、过度饮酒等。HCC患者通常在晚期被诊断出来,其预后很差,目前的治疗手段如手术切除,化疗及口服索拉菲尼的治疗都不能防止HCC的复发,因此寻求新的治疗手段来预防和治疗HCC是非常迫切的。随着科学的发展,mRNA疫苗的免疫原性强及易降解等问题被逐步解决,mRNA疫苗已经成为研究癌症疫苗及传染病疫苗的重点方向,mRNA疫苗相对于传统的灭活疫苗和减毒活疫苗等其他类型的疫苗有着许多的优势。本课题就基于此设计了编码HCC抗原表位GPC3的mRNA疫苗,该疫苗能够靶向HCC细胞Hepa1-6并进入细胞分泌表达靶向树突状细胞的目的蛋白。本课题主要的研究方法、结果及结论如下:1、mRNA疫苗体外转录系统的构建及筛选为构建能够高效表达目的蛋白的mRNA疫苗,需要对mRNA的序列进行优化,本课题针对信号肽对mRNA的翻译效率及目的蛋白分泌量的影响,共设计了三种不同模式的mRNA序列,区别在于信号肽的不同,将三种mRNA序列分别记作mRNA-n1、mRNA-n2、mRNA-n3。其中mRNA-n1的信号肽序列来源于小鼠的Igκ链,mRNA-n2的信号肽序列来源人IL-2,mRNA-n3的信号肽序列来源人血清白蛋白信号肽。mRNA的开放阅读框序列选用本课题的目的基因GPC3-Hsp70,在目的基因C末端连接上HA标签蛋白的基因,用HA标签蛋白抗体来鉴定目的蛋白的表达,目的蛋白记作GPC3-Hsp70-HA。将GPC3-Hsp70基因插入由公司构建的载体p CDNA3.1(+)-HA-n1/n2/n3中,构建重组质粒p CDNA3.1(+)-GPC3-Hsp70-HA-n1/n2/n3,经双酶切及测序鉴定构建成功。将重组质粒p CDNA3.1(+)-GPC3-Hsp70-HA-n1/n2/n3用Lipofectamine?3000 Reagent转染进HEK-293T细胞后利用Western Blot检测到目的蛋白的表达,由此确定构建的质粒能够表达出目的蛋白,能够用于后续mRNA的制备。将以上重组质粒单酶切后用酚氯仿回收获得的线性化质粒进行体外转录生成mRNA,记作Cap-GPC3-Hsp70-HA-n1/n2/n3,将以上3种mRNA转染进入Hepa1-6细胞12h后,利用Western Blot检测蛋白的表达情况,结果表明Cap-GPC3-Hsp70-HA-n1组目的蛋白的表达量高于Cap-GPC3-Hsp70-HA-n2组和Cap-GPC3-Hsp70-HA-n3组,且其表达的目的蛋白能够分泌到胞外。综上所述,选择Cap-GPC3-Hsp70-HA-n1进行后续实验。2、mRNA候选疫苗纳米颗粒的制备及功能验证为了防止mRNA的降解,并使mRNA能够顺利进入细胞中表达出目的蛋白,基于本课题组以前的研究,用带正电荷的多聚赖氨酸K18通过静电相互作用结合mRNA形成纳米颗粒,使mRNA在不被细胞外的核酸酶降解的情况下运送至细胞内,完成内体逃逸,进入细胞质翻译出目的蛋白。在此基础上,可以对mRNA纳米颗粒进行修饰,使之具备一定的靶向性,能够更加精准的发挥作用。据研究报道,sp94是HCC细胞的靶向肽,能够特异性的与HCC细胞表面的受体GRP78蛋白结合。因此,本课题在多聚赖氨酸K18的N端用一个柔性Linker GGG连接sp94(sp94-GGG-K18),并使之与mRNA通过静电相互作用结合形成mRNA纳米颗粒,随后对形成的mRNA纳米颗粒的粒子直径,多肽与mRNA结合的紧密程度进行了测量,结果表明在多肽与mRNA N/P=5:1时,能够得到符合条件的mRNA纳米颗粒。随后用CCK-8法对多肽的毒性进行测量,结果显示在多肽浓度≤1000pm/10个细胞时,多肽对细胞无毒性。随后本课题利用流式细胞术试验及细胞免疫荧光对Hepa1-6细胞表面的sp94受体GRP78蛋白进行测定,结果表明Hepa1-6表面有GRP78蛋白的表达,可以支持后续mRNA纳米颗粒的靶向性试验。将制备好的mRNA纳米颗粒与Hepa1-6细胞共孵育后进行细胞免疫荧光试验,结果表明带有sp94的mRNA纳米颗粒能够靶向Hepa1-6细胞,且能够将mRNA带入Hepa1-6细胞中,完成mRNA的内体逃逸及mRNA在胞内的翻译。3、GPC3-Hsp70对DC细胞靶向性验证热休克蛋白70(heat shock protein 70,Hsp70)属于热休克蛋白家族的一员,在进化上高度保守。有研究报道,Hsp70具有结合抗原肽的能力,并且在抗原提呈细胞表面具有Hsp70的受体,能够将Hsp70连同其结合的抗原肽一并吸收进胞内,从而将抗原提呈

关键词： mRNA疫苗肝细胞癌 GPC3127-136 sp94 Hsp70

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肝癌靶向的阳离子脂质体共递送多西他赛和siRNA的研究(英文)

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Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences 2014年第10期23卷 667-673页

作者：李井泉仰浈臻孟婷婷齐宪荣北京大学医学部天然药物及仿生药物国家重点实验室北京100191

肝细胞癌是全世界最常见的恶性肿瘤之一,居癌症相关死亡原因第三位。通过在纳米载体系统上修饰靶向配体可将药物主动靶向至肿瘤细胞。随着药物制剂学的发展,采用纳米给药系统共递送化疗药物与基因药物成为了治疗肿瘤的一种手段。本研究... 详细信息

肝细胞癌是全世界最常见的恶性肿瘤之一,居癌症相关死亡原因第三位。通过在纳米载体系统上修饰靶向配体可将药物主动靶向至肿瘤细胞。随着药物制剂学的发展,采用纳米给药系统共递送化疗药物与基因药物成为了治疗肿瘤的一种手段。本研究通过薄膜超声法制备了共包载多西他赛(DTX)和小干扰RNA(siRNA)的脂质体,并用sp94对其进行修饰。血清稳定性试验表明,脂质体能较好地保护siRNA免受血清中核酸酶的降解。与未修饰的阳离子脂质体相比,sp94修饰的阳离子脂质体显著增强了制剂的在肿瘤细胞内的摄取和对肿瘤细胞的抗增殖作用,表明了sp94的主动靶向作用。本课题成功构建了主动靶向肝癌的共包载DTX和siRNA的阳离子纳米粒给药系统,为肝细胞癌的治疗提供了新的研究思路。

关键词： sp94 肝癌脂质体多西他赛小干扰RNA

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靶向肽修饰的纳米金棒体系用于四介铂前体药物的运输

靶向肽修饰的纳米金棒体系用于四介铂前体药物的运输

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作者：刘蕾中国科学技术大学

学位级别：硕士

靶向药物及其载体一直是近年来的研究热点。本文选取了纳米金棒和靶向性较高的肝靶向肽sp94 (SFSIIHTPILPL)为研究目标。讨论了固相合成多肽和纳米金棒制备过程的一些问题,在此基础上合成了靶向肽修饰的纳米金棒,并利用修饰后的纳米金... 详细信息

靶向药物及其载体一直是近年来的研究热点。本文选取了纳米金棒和靶向性较高的肝靶向肽sp94 (SFSIIHTPILPL)为研究目标。讨论了固相合成多肽和纳米金棒制备过程的一些问题,在此基础上合成了靶向肽修饰的纳米金棒,并利用修饰后的纳米金棒负载四价铂前体药物,然后研究了其靶向特性及四价铂的释放。本文主要研究内容包括：1.晶种生长法合成纳米金棒。以NaBH4作为还原剂,十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)作为表面活性剂合成种子溶液。采用抗坏血酸作为还原剂合成纳米金棒,并优化纳米金棒合成实验条件。最后通过UV-vis和TEM检测反应产物。结果表明：成功的制备了纳米金棒,发现合适浓度的AgNO3及种子溶液才有利于纳米金棒的生成,加入HCl可以明显提高纳米金棒的产率,但会有部分纳米金球生成。2.固相合成法合成靶向肽。本文以DMF为溶剂,采用固相合成法合成了多肽。合成了sp94等多肽,产物使用HPLC和质谱表征。结果表明固相合成得到了纯度较好的多肽。3.靶向肽修饰纳米金棒。本文采用了GCGC的肽段连接到纳米金棒表面,得到了稳定的纳米金棒-靶向肽体系。然后将Pt(Ⅳ)前体药物连接到靶向肽修饰的纳米金棒上。细胞靶向实验证明了该体系有良好的肝癌细胞靶向性,同时Pt(Ⅳ)释放实验表明该体系运载具有良好的可控释放性。

关键词：纳米金棒靶向肽 sp94 固相合成四价铂

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