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Multifaceted roles and functions of sox30 in human cancer

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Cancer Innovation 2024年第2期3卷 11-27页

作者： Na Sun Cheng Wang Pingping Gao Rui Wang Yi Zhang Xiaowei Qi Department of Breast and Thyroid Surgery The Southwest Hospital of Army Medical UniversityChongqingChina

SRY-box transcription factor 30(sox30)participates in tumor cell apoptosis in lung *** occurrence of somatic sox30 mutations,the expression signature of sox30 in normal and cancer tissues,the correlation of sox30 with immune cells and immune-related genes,and the clinical significance of sox30 in various cancers have stimulated interest in sox30 as a potential cancer ***30 influences drug sensitivity and tumor immunity in specific cancer *** this review,we have comprehensively summarized the latest research on the role of sox30 in cancer by combining bioinformatics evidence and a literature *** summarize recent research on sox30 in cancer regarding somatic mutations,trials,transcriptome analysis,clinical information,and sox30-mediated regulation of malignant ***,we report on the diagnostic value of sox30 mRNA expression levels across different cancer *** review on the role of sox30 in cancer progression may provide insights into possible research directions for sox30 in cancer and a theoretical basis for guiding future studies.

关键词： cancer progression prognosis sox30

sox30基因敲除致小鼠睾丸间质细胞增殖异常的研究

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第三军医大学学报 2021年第11期43卷 1063-1073页

作者：唐莹姜晓韩飞周洋西崔志鸿刘晋祎杨惠芳曹佳宁夏医科大学公共卫生与管理学院劳动卫生与环境卫生教研室银川750004 陆军军医大学(第三军医大学)军事预防医学系毒理学研究所重庆400038 西南大学药学院中医药学院重庆400700

目的探讨sox30基因敲除对小鼠睾丸间质细胞增殖的影响。方法采用HE染色法观察10周龄sox30基因野生型(sox30^(+/+))、杂合型(sox30^(-/+))及纯合缺失型(sox30^(-/-))小鼠睾丸组织病理形态;采用免疫组化技术检测睾丸组织中间质细胞特异性... 详细信息

目的探讨sox30基因敲除对小鼠睾丸间质细胞增殖的影响。方法采用HE染色法观察10周龄sox30基因野生型(sox30^(+/+))、杂合型(sox30^(-/+))及纯合缺失型(sox30^(-/-))小鼠睾丸组织病理形态;采用免疫组化技术检测睾丸组织中间质细胞特异性表达蛋白3β-HSD的表达水平;采用慢病毒感染及siRNA干扰技术构建sox30基因过表达及敲低TM3细胞模型,并在此细胞模型基础上分别采用CCK-8法、流式细胞术、RT-qPCR法以及Western blot法检测细胞存活率、细胞周期分布及周期相关基因的mRNA及蛋白表达水平。采用JASPAR数据库预测sox30与周期相关基因的启动子区结合位点。结果与sox30^(+/+)和sox30^(-/+)小鼠比较,HE染色结果显示sox30^(-/-)小鼠睾丸组织中间质细胞显著增生,同时免疫组化染色发现表达3β-HSD的间质细胞增多。与Vector组相比,sox30组TM3细胞存活率降低(Psox30-NC组比较,sisox30-3组TM3细胞存活率增加(Psox30蛋白质可能的结合位点。结论sox30基因敲除可导致小鼠间质细胞增殖异常,CyclinD1和Cdk2可能是sox30调控细胞周期的重要靶基因。

关键词： sox30 小鼠睾丸间质细胞 TM3细胞细胞周期

sox30基因在雄性生殖发育毒性中的作用及机制初步研究

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SOX30基因在雄性生殖发育毒性中的作用及机制初步研究

作者：王平中国人民解放军陆军军医大学

学位级别：硕士

研究背景:近50年以来,人类的平均寿命已得到显著提高,但是生殖健康总体水平却呈现出下降的趋势。根据文献的统计分析,从1973到2011年,全球男性精子总数和密度分别降低约5.33×10个/年和0.7×10/m L.年;同时临床上各种男性生殖疾病的发... 详细信息

研究背景:近50年以来,人类的平均寿命已得到显著提高,但是生殖健康总体水平却呈现出下降的趋势。根据文献的统计分析,从1973到2011年,全球男性精子总数和密度分别降低约5.33×10个/年和0.7×10/m L.年;同时临床上各种男性生殖疾病的发病率也在逐渐增加。已有的研究表明,基因与环境交互作用是造成男性生殖功能损伤尤其是生精障碍等不孕不育的重要原因之一。其中,邻苯二甲酸酯(PAEs)是人类体液中最常被检出的环境有机污染物,其中又以邻苯二甲酸二丁酯(DBP)为代表受到广泛研究。目前的研究表明,DBP可以诱导雄性生殖损害,DBP暴露后导致睾丸生精细胞早熟脱落和精子数量下降,具有支持、营养和保护生精细胞功能的支持细胞内蛋白骨架解聚是生精细胞早熟脱落的重要节点。尽管DBP生殖发育毒性已有大量的研究报道,但其分子机制还未充分阐明。sox蛋白是一类基因转录调控分子,在生殖细胞的发生、分化和成熟等过程中起重要的调控作用,同时也参与了包括癌症在内的众多疾的发生。sox30基因是最近发现的sox家族成员,本课题组前期也首次报道,在成体小鼠睾丸中sox30基因低甲基化而高水平表达,推测sox30可能在维持正常的雄性生殖功能方面具有重要作用。最新的国内外一些报道也表明sox30基因是精子形成所必需的,与睾丸发育紧密相关,但是sox30基因在生殖系统发育中的功能和机制尚不清楚。此外,在前期研究中,我们发现DBP处理诱导的睾丸病理损伤和生精过程中,sox30基因表达发生改变,提示sox30可能在DBP诱导的雄性生殖损伤中发挥作用,但是二者的应答作用和机制还需实验证实。本研究拟通过sox30基因敲除小鼠模型,分析不同基因型雄性小鼠的各脏器组织的病理特征,评价sox30在生殖发育中的潜在作用。其次,通过DBP诱导的TM4细胞体外损伤模型及sox30差异表达TM4细胞模型,探讨sox30在DBP诱导的TM4细胞增殖抑制中的作用和分子机制。研究方法:***30基因敲除对雄性小鼠各重要脏器组织形态及生殖功能的影响通过基因重组构建sox30基因敲除小鼠并进行PCR鉴定基因型,称重各脏器质量并计算脏器指数(包括心、肝、脾、肺、肾、大脑、胸腺、睾丸、附睾和骨髓),显微观察不同基因型小鼠各脏器组织结构和形态特征,分析sox30基因敲除对小鼠各脏器发育的作用。重点观察睾丸、附睾组织形态及附睾精子数目,检测睾丸组织激素水平,分析sox30对生殖功能的影响。***30在DBP致TM4细胞增殖抑制中的作用及机制体外构建DBP诱导TM4细胞损伤模型,通过CCK8法分析DBP染毒对TM4细胞形态及增殖的影响,流式细胞术(FCM)检测DBP染毒后TM4细胞周期的变化,PCR及WB检测周期相关分子蛋白。通过慢病毒感染和si RNA干扰技术构建sox30差异表达TM4细胞模型,并采用通过FCM、WB和PCR法分别检测sox30差异表达后TM4细胞周期及相关分子的表达变化。在此基础上,采用FCM法检测DBP处理及sox30干扰后TM4细胞周期变化,验证DBP通过调控sox30表达诱导TM4细胞周期阻滞的作用及机制。研究结果:***30基因敲除可导致雄性小鼠部分脏器病理损伤及生精障碍(1)野生型(WW)、杂合型(KW)和纯合型(KK)雄性小鼠体质量之间未见差异(P>0.05);KK组小鼠睾丸脏器指数较WW和KW组明显降低(Psox30基因敲除影响雄性小鼠睾丸发育。(2)显微观察一般脏器组织病理形态特征发现,与WW组和KW组比较,KK组雄性小鼠的部分脏器结构和形态发生改变:?大脑神经元及胶质细胞数量减少,胶质纤维结节形成;?肝细胞显著增生;?脾脏红髓增生;(4)骨髓巨核成簇伴小梁旁异常分布。结果提示:sox30敲除可潜在影响大脑、肝脏、脾脏发育和造血细胞分化。(3)通过对不同基因型雄性小鼠性腺病理形态观察发现,与WW组和KW组比较,KK组雄性小鼠睾丸组织体积和曲细精管直径变小(Psox30敲除可导致小鼠生精障碍。通过ELISA法检测3组基因型雄性小鼠睾丸组织中T和INH-B的水平,结果发现:与WW和KW组比较,KK组小鼠睾丸组织匀浆中T和INH-B显著下降(Psox30可影响小鼠睾丸T和INH-B合成分泌。***30基因参与DBP诱导的TM4细胞增殖抑制(1)DBP处理可诱导TM4细胞G1期阻滞通过CCK8法实验发现DBP暴露下可显著抑制TM4细胞增殖,且与DBP暴露诱导TM4细胞G1期阻滞有关;PCR检测发现DBP处理后细胞周期调控分子CDK2、CDK6下降,sox30表达量明显上调(P<0.05)。提示DBP

关键词： sox30 基因敲除生殖发育毒性邻苯二甲酸二丁酯

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sox30在膀胱癌中的表达及功能研究

SOX30在膀胱癌中的表达及功能研究

作者：刘洋广州医科大学

学位级别：硕士

背景膀胱癌是泌尿系最常见的恶性肿瘤,也是十大恶性肿瘤之一。sox30基因已被证实在肺癌中发挥抑癌作用,但是其在膀胱癌中的作用尚无明确报道。目的检测sox30基因在人膀胱癌组织及膀胱癌细胞系中的表达水平;研究sox30基因的表达水平与膀... 详细信息

背景膀胱癌是泌尿系最常见的恶性肿瘤,也是十大恶性肿瘤之一。sox30基因已被证实在肺癌中发挥抑癌作用,但是其在膀胱癌中的作用尚无明确报道。目的检测sox30基因在人膀胱癌组织及膀胱癌细胞系中的表达水平;研究sox30基因的表达水平与膀胱癌的临床病理特征之间的关系;研究sox30基因的表达水平与膀胱癌临床预后的关系;探讨sox30基因对膀胱癌细胞生物学功能的影响。方法使用实时荧光定量聚合酶链式反应(Quantitative real-time reverse transcription PCR,q RT-PCR)检测sox30基因在4株膀胱癌细胞、一株正常膀胱上皮细胞、一例正常膀胱组织以及30对膀胱癌组织及其对应的癌旁组织的m RNA表达水平并对检测结果进行统计分析;使用蛋白印记法(western-blot)检测sox30基因在4株膀胱癌细胞、一株正常膀胱上皮细胞、一例正常膀胱组织以及随机四对膀胱癌及其癌旁组织的蛋白表达水平;使用免疫组织化学法(Immunohistochemistry)检测sox30基因在56对膀胱癌及其癌旁组织的表达水平,并使用统计学方法分析其表达高低与膀胱癌的临床病理特征以及临床预后的关系;利用慢病毒包装感染T24细胞株和5637细胞株,使用q RT-PCR和western-blot检测病毒感染效率并对检测结果进行统计分析;使用CCK-8试剂盒检测sox30基因对膀胱癌细胞的增殖的影响;使用Transwell法检测sox30基因对膀胱癌细胞的迁移和侵袭的影响;使用流式细胞术检测sox30基因对膀胱癌细胞的凋亡的影响。结果1.荧光定量PCR检测显示,与癌旁正常组织相比,sox30基因在膀胱癌组织中的表达水平明显下降76.67%(23/30);western-blot实验结果显示在随机选择的四对膀胱癌及其对应的癌旁组织中,sox30基因蛋白表达水平在膀胱癌组织中明显低于相对应的癌旁组织;2.荧光定量PCR以及western-blot分析显示sox30基因在T24,5637,J82,SW780细胞中m RNA表达平以及蛋白的表达水平均明显低于正常膀胱上皮细胞以及正常的膀胱上皮组织;3.免疫组织化学分析显示,与癌旁正常组织相比,sox30基因在膀胱癌组织中表达水平明显下降,并且经过统计学分析发现,sox30表达的降低与膀胱癌患者的低生存率成正相关(P=0.0388),并且膀胱癌中sox30基因的表达水平与膀胱癌的临床病理分期有关(P=0.019),而与患者的年龄(P=0.093)、性别(P=0.639)、肿瘤组织学分级(P=0.068)、肿瘤的大小(P=0.150)以及肿瘤的病理类型(P=0.317)无明显的相关关系;4.选择5637和T24细胞株进行慢病毒感染,荧光定量PCR和western-blot实验数据显示sox30蛋白表达水平明显高于阴性对照组,提示过表达成功;***-8增殖实验、Transwell侵袭迁移实验以及流式细胞术检测凋亡实验数据显示;sox30基因过表达后明显抑制膀胱癌细胞的增殖、侵袭和迁移,促进肿瘤细胞的凋亡。结论***30在膀胱癌组织中表达水平明显下降,并且与膀胱癌的临床病理分期以及膀胱癌的预后有关;***30基因过表达后抑制膀胱癌细胞的增殖、侵袭和迁移,促进膀胱癌细胞的凋亡,这些数据表明sox30在膀胱癌中可能是一个抑癌基因,提示sox30基因可能为改善膀胱癌预后和治疗提供一种新的、有前景的治疗靶点。

关键词： sox30 膀胱肿瘤侵袭凋亡治疗靶点

sox30基因在小鼠和大鼠睾丸发育过程中的表达与甲基化分析

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Sox30基因在小鼠和大鼠睾丸发育过程中的表达与甲基化分析

作者：马学翔第三军医大学

学位级别：硕士

立题背景:大量研究已经表明,表观遗传修饰改变在发育过程中起着关键作用。其中,DNA甲基化是目前研究最多和最为深入的表观遗传修饰方式之一。越来越多的证据表明,DNA甲基化主要通过调控发育过程中组织特异性基因的时空表达,维持着生物... 详细信息

立题背景:大量研究已经表明,表观遗传修饰改变在发育过程中起着关键作用。其中,DNA甲基化是目前研究最多和最为深入的表观遗传修饰方式之一。越来越多的证据表明,DNA甲基化主要通过调控发育过程中组织特异性基因的时空表达,维持着生物体正常的发育进程。DNA甲基化变化一旦发生异常往往与发育中出现的多种疾病状态密切相关。因此,开展发育相关基因表观遗传修饰方式的研究,有助于阐明疾病的发病机制,对深入认识相关疾病具有重要理论和现实意义。sox30(SRY-box containing gene 30)作为sox核转录因子基因超家族的成员,一直被认为只在高等脊椎动物尤其是哺乳动物中存在,而在低等脊椎动物中并不存在。而我们最近的研究表明,sox30基因在整个动物界中普遍存在,这一发现意味着sox30基因可能比先前认为的更加重要。已有研究显示,sox30基因主要在睾丸生殖细胞和支持细胞中表达,可能参与了性腺发育、精原细胞分化和精子形成过程。最近,我们又首次发现sox30基因在肺癌中是一个新的受DNA甲基化调控的肿瘤抑制基因,其作用机制是通过转录激活p53信号促进肿瘤细胞的凋亡而发挥抑制功能。然而,sox30基因在小鼠和大鼠发育过程中的具体表达变化模式以及其表达是否受DNA甲基化调控目前还不清楚。实验目的:(1)明确sox30基因在成体小鼠和大鼠各种组织中表达情况;明确sox30基因在小鼠和大鼠胚胎发育全胚和发育各阶段卵巢及睾丸组织中的表达变化;(2)了解sox30基因在成体小鼠和大鼠各种组织中的DNA甲基化发生情况,以及sox30基因在小鼠和大鼠胚胎发育和出生后发育各阶段睾丸组织中的DNA甲基化变化情况;(3)确定sox30基因在小鼠和大鼠发育过程的睾丸组织中的表达和DNA甲基化之间的关系。(1)采用rt-pcr、rt-qpcr、wb和免疫组织化学方法检测sox30基因在成体小鼠和大鼠各种组织中以及发育各阶段睾丸组织中的表达和定位情况;(2)采用甲基化特异性pcr(msp)结合亚硫酸氢盐修饰测序方法检测sox30基因在成体小鼠和大鼠各种组织以及发育各阶段睾丸组织中的dna甲基化情况;(3)通过rt-pcr、rt-qpcr、msp和bsp方法检测生殖系统来源的多种细胞株经过去甲基化药物(甲基化转移酶抑制剂)5-aza-c处理前后sox30基因表达水平和dna甲基化状态的变化情况。实验结果:(1)本研究通过检测sox30基因在成体小鼠和大鼠的卵巢、子宫、附睾、睾丸、心脏、脑、肝脏、肾脏、脾脏、胰脏、肺、肌肉、肠、垂体、血液和海马组织中的表达谱发现,在成体小鼠,sox30基因在睾丸组织中的表达量最高,其次是在附睾组织和肺组织中,且sox30在睾丸组织中的表达远远高于在附睾和肺组织中的表达;在成体大鼠,sox30也是在睾丸中的表达量最高,其次是在附睾和血液中,且sox30在睾丸组织中的表达远远高于在附睾和血液中的表达。这些结果说明sox30基因在小鼠和大鼠睾丸的功能维持或精子发生中具有重要作用。(2)sox30基因在小鼠和大鼠发育阶段e8.5(胚胎期8.5天)、e10.5、e12.5、e14.5、e15.5、e19.5全胚胎及1d(出生后1天)、4d、7d、10d、15d、20d、30d、40d、60d和73d的卵巢和睾丸组织中的表达分析发现,在小鼠中,sox30在胚胎期e8.5、10.5、12.5全胚胎中表达较低,在e14.5时表达量明显升高,在从出生后1d到60d成鼠卵巢组织中都呈低表达或不表达状态,而在从出生后1d到60d成鼠的睾丸组织中表达量逐渐升高,直到60天达到峰值,并在出生后15d的睾丸组织中呈现爆发式升高,高于出生后10d时睾丸组织中的表达近30倍;在大鼠中,sox30在胚胎期e8.5、10.5、12.5、15.5、19.5雄性和19.5雌性全胚胎中均呈低表达状态,在从出生后1d到73d成鼠卵巢组织中表达低或不表达,从出生后1d到40d大鼠的睾丸组织中表达量逐渐升高,到40天时达到峰值,以后维持在峰值水平。这些数据表明,sox30基因在小鼠和大鼠的性别分化和睾丸发育过程中可能发挥关键作用。(3)通过检测sox30基因在小鼠睾丸中的细胞定位发现,sox30不仅在小鼠睾丸生殖细胞中表达,还在睾丸支持细胞中表达,只是在生殖细胞中的表达量高于在支持细胞中的表达。这些数据显示,sox30基因参与了生殖细胞的发育和成熟,在睾丸发挥正常功能中具有重要作用。(4)通过分析sox30基因在成体小鼠各组织中的dna甲基化情况发现,sox30在实验方法:卵巢、心脏、大脑、肝脏、肾脏、脾脏、胰脏、肌肉和小肠组织中都是甲基化状态,而在附睾、睾丸和肺组织中则是非甲基化状态。考虑到前期的sox30基因的组织分布表达结果,我们认为sox30基因在成体小鼠组织中的甲基化与

关键词： sox30 睾丸发育基因表达 DNA甲基化

小鼠生殖细胞特异性转录因子SOHLH1调控sox30基因表达的机制

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中国比较医学杂志 2019年第7期29卷 36-41页

作者：齐婉婧孙奇李媛张雪金美玉何岩郑志红中国医科大学实验动物部

目的SOHLH1(Spermatogenesis-and oogenesis-specific bHLH transcription factor-1)和sox30(SRY box)是与精子发生相关的转录因子,Sohlh1与sox30的基因敲除雄鼠均丧失生育能力。出生后7天Sohlh1基因敲除雄鼠DNA芯片显示sox30表达显著下调,本文探究了早期发育相关转录因子SOHLH1对精子发生后期的关键基因sox30基因的转录调控作用。方法构建sox30启动子荧光素酶表达质粒,瞬时共同转染sox30荧光素酶表达质粒和Sohlh1真核表达质粒并利用荧光素酶活性测定实验检测荧光值。通过染色质免疫共沉淀实验检测SOHLH1与sox30启动子DNA序列特异序列的结合情况筛选主要激活位点。结果共转染Sohlh1真核表达质粒和sox30启动子区域荧光素酶质粒的实验组荧光素酶活性高于对照组。SOHLH1与sox30启动子上的特异性位点结合,在-489 bp位点的结合作用最强。结论精子发生早期重要转录因子SOHLH1可以直接激活顶体形成相关基因sox30转录,-489 bp(CAGGTG)为主要特异性结合位点,丰富了精子发生中延时翻译表达调控的现象并进行了调控机制的初步探索。

关键词：精子发生 sox30 ChIP SOHLH1 小鼠

小鼠生殖细胞特异性转录因子SOHLH1对sox30基因表达调控的研究

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小鼠生殖细胞特异性转录因子SOHLH1对Sox30基因表达调控的研究

作者：齐婉婧中国医科大学

学位级别：硕士

目的:雄性生殖细胞从具有有丝分裂活性的原始生殖细胞发育为成熟精子的过程被称为精子发生。精子发生起源于精原干细胞,分为精原细胞的有丝分裂期、精母细胞的减数分裂期和精子形成期三个阶段。精原细胞经历有丝分裂后在精子形成期发生... 详细信息

目的:雄性生殖细胞从具有有丝分裂活性的原始生殖细胞发育为成熟精子的过程被称为精子发生。精子发生起源于精原干细胞,分为精原细胞的有丝分裂期、精母细胞的减数分裂期和精子形成期三个阶段。精原细胞经历有丝分裂后在精子形成期发生一系列复杂的结构重塑最终形成成熟精子。许多与精子形成期相关的基因在雄性生殖细胞发育的早期如精原细胞中已经开始转录,此时转录的m RNA在细胞发育至后期时才被翻译为蛋白质并发挥功能。精卵发生特异表达螺旋-环-螺旋转录因子1(Spermatogenesis-and oogenesis-specific b HLH transcription factor-1,Sohlh1)在雄性生殖细胞中主要表达于A1-A4型精原细胞,编码蛋白含有一个b HLH结构域,可以形成异二聚体或同型二聚体与DNA上的E-box序列CANNTG结合调控下游基因的表达。本课题组前期研究发现Sohlh1基因敲除雄性小鼠不育,精原细胞发育及分化异常导致进入减数分裂的精母细胞减少,无成熟精子产生。基因芯片检测结果显示出生后7天野生型雄鼠与Sohlh1基因敲除雄鼠睾丸组织中sox30、Rnf17等精子发生中关键基因均出现表达差异,推测SOHLH1可能直接或间接调控sox30基因转录。sox30是sox家族H亚族唯一的成员,编码蛋白具有一个HMG box结构域,与性腺发生和精子发生有关。sox30基因敲除雄性小鼠无生育能力,圆形精子细胞核表面没有参与顶体形成的顶体颗粒,说明精子发生阻滞于精子形成期,推测sox30可能与精子发生中的顶体形成相关,现阶段并无转录因子调控sox30表达的报道。SOHLH1主要表达于精子发生早期的分化型精原细胞,有研究发现sox30的m RNA在精母细胞中存在转录并持续存在,但sox30蛋白最早出现于精子发生后期的圆形精子细胞中,我们通过生物信息学预测发现sox30基因上游存在SOHLH1转录因子结合序列,推测sox30基因有可能受SOHLH1转录调控。正常sox30m RNA具有完整的HMG结构域和C端结构域,但sox30 m RNA变异体缺少完整的C端结构域,研究显示C端结构域与m RNA的延时翻译现象相关。本研究拟通过分析野生型小鼠和Sohlh1-/-小鼠雄性生殖细胞中sox30基因m RNA的转录情况,初步探索sox30基因在雄性生殖细胞中的表达模式和精原细胞早期发育相关的重要转录因子SOHLH1参与精子发生后期相关基因sox30的转录调控机制,并进一步筛选sox30基因启动子序列上SOHLH1特异性结合位点的DNA序列。研究方法:将野生型C57BL/6J雄鼠和Sohlh1基因敲除雄鼠作为本实验的研究对象,通过q RT-PCR实验检测PD7(出生后7天)和成年小鼠睾丸组织RNA中sox30 m RNA不同转录本的表达水平;通过构建sox30启动子表达载体和双荧光素酶报告基因研究SOHLH1对sox30启动子序列的转录调控作用;通过Ch IP实验筛选SOHLH1在sox30启动子序列上的主要结合位点。结果:q RT-PCR实验结果显示,与出生后7天的野生型C57B6L/J小鼠相比,Sohlh1-/-小鼠睾丸组织中,sox30 m RNA表达量显著下调(Psox30 m RNA变体表达量下调(Psox30 m RNA表达量显著下调(Psox30的两个转录本表达量均出现异常,成年Sohlh1-/-小鼠中sox30 m RNA变异体出现了异常转录并累积的现象。双荧光素酶实验结果显示,将Sohlh1真核表达质粒与启动子荧光表达载体共转染时,sox30启动子上游-876 bp的区域内的荧光活性最强,推测核心启动子片段位于该片段内,生殖细胞特异表达转录因子SOHLH1可以激活sox30基因的转录。Ch IP实验结果显示,转录因子SOHLH1可以结合于sox30转录起始位点上游-544 bp E-box(CAACTG)、-489 bp E-box(CAGGTG)、-166 bp E-box(CAACTG)、-101 bp E-box(CATATG)这四个E-box位点,但与-489 bp(CAGGTG)位置的E-box位点结合作用较强,此E-box位点为sox30基因启动子上的主要转录激活位点。结论:1、转录因子SOHLH1对睾丸组织特异表达基因sox30的表达具有转录激活作用,SOHLH1对sox30的转录激活证明该基因存在延时翻译的现象。2、在小鼠睾丸中,转录因子SOHLH1能够结合于sox30基因转录起始位点上游-544 bp、-489 bp、-166

关键词： sox30 SOHLH1 转录后调控精子发生

转录因子sox30在尼罗罗非鱼精子发生中的功能及作用机制研究

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转录因子Sox30在尼罗罗非鱼精子发生中的功能及作用机制研究

作者：唐耀浩西南大学

学位级别：硕士

动物精子发生是雄性个体产生成熟精子的生物学过程,精子发生异常直接影响雄性个体的育性。因此,精子发生的调控机制一直是动物生殖发育生物学领域的研究热点和难点之一。sox30是sox基因家族成员。小鼠中的研究显示,sox30在精子形变过程... 详细信息

动物精子发生是雄性个体产生成熟精子的生物学过程,精子发生异常直接影响雄性个体的育性。因此,精子发生的调控机制一直是动物生殖发育生物学领域的研究热点和难点之一。sox30是sox基因家族成员。小鼠中的研究显示,sox30在精子形变过程中发挥作用。然而,迄今为止在其他脊椎动物如鱼类中还未见有关sox30功能的研究报道。我们前期的转录组分析显示,sox30在尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）精巢中高表达。本研究中,我们通过Western blot和免疫荧光技术分析了sox30在不同发育阶段尼罗罗非鱼性腺中的表达模式和细胞定位,运用CRISPR/Cas9技术分析了sox30突变对尼罗罗非鱼精巢发育和精子发生的影响,利用Ch IP-seq和蛋白组学分析了sox30在尼罗罗非鱼精子发生中的作用机制,并探究了尼罗罗非鱼精巢高表达的Dmrt1转录因子对sox30转录的调控作用。本研究得到的主要结果如下:***30在不同发育阶段尼罗罗非鱼性腺中的表达变化及细胞定位利用抗尼罗罗非鱼sox30的抗体,通过Western blot检测了sox30在孵化后30天（30 days after hatching,30 dah）、75 dah、90 dah和180 dah尼罗罗非鱼性腺中的表达变化,发现sox30在75 dah的精巢中有表达,在90 dah和180 dah精巢中的表达升高;但是,sox30在卵巢中不表达。我们进一步应用免疫荧光技术检测了sox30在5 dah、30 dah、90 dah和180 dah尼罗罗非鱼性腺中的表达定位情况,结果显示sox30在90 dah和180 dah雄鱼精巢的精母细胞、圆形精子细胞和输出精管的上皮细胞及180 dah雄鱼精巢的精子中表达,在成熟精子中也有表达。***30在尼罗罗非鱼精巢发育和精子发生中的功能我们应用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功构建了尼罗罗非鱼sox30的纯合突变系。在此基础上,我们对90 dah和180 dah的sox30纯合突变及野生型雄鱼的精巢进行了形态解剖学和组织学分析。苏木精-伊红染色结果显示,90 dah野生型与sox30纯合突变雄鱼的精巢都有精原细胞、精母细胞和圆形精子细胞。统计分析结果显示,与野生型相比,sox30纯合突变雄鱼精巢中的精母细胞数量显著减少。与180 dah野生型雄鱼相比,纯合突变雄鱼的性腺成熟系数（gonadosomatic index,GSI）显著减小。利用巴氏染色对精子形态的分析表明,sox30纯合突变雄鱼精子出现尾部变短、弯折和卷曲等畸形。运用计算机辅助精子分析系统检测精子活力的相关指标,发现与野生型雄鱼相比,sox30纯合突变雄鱼精子的前向运动（PR）、平均直线运动速度（VSL）、平均路径速度（VAP）和摆动性（WOB）等精子活力指标都显著下降,非前向运动的精子比例显著升高。我们进一步将野生型和sox30纯合突变雄鱼分别与野生型雌鱼进行人工授精,通过检测受精率来分析sox30纯合突变对雄鱼育性的影响。结果显示,与野生型相比,sox30纯合突变雄鱼的受精率显著降低。这些结果表明,sox30缺失主要导致雄鱼部分精子尾部异常,精子运动能力下降,从而使突变雄鱼的育性降低。***30在尼罗罗非鱼精子发生中的作用机制（1）尼罗罗非鱼sox30潜在靶基因的ChIP-seq筛选我们采用Ch IP-seq方法对尼罗罗非鱼精巢中sox30的潜在下游靶基因进行了全基因组水平的鉴定筛选。根据ChIP-seq技术原理,将180 dah尼罗罗非鱼精巢组织分散成单细胞,将其固定后,利用核酸酶解法将细胞的基因组打断成100-900 bp大小的DNA片段,再利用sox30的特异抗体免疫沉淀sox30与基因组DNA结合而成的复合物,最后回收基因组DNA片段并进行高通量测序。结果显示,我们在尼罗罗非鱼sox30的免疫共沉淀产物中共获得20,812,218 raw reads和20,635,915clean reads,在未进行sox30免疫共沉淀的input对照组中共获得25,604,443 raw reads和25,316,577 clean reads。多序列比对分析显示,sox30与尼罗罗非鱼精巢中潜在靶基因的结合基序主要为C（T/G/A）C（G/A/T）T（A/C/G）A（T/G/C）G（T/C）G（T/C/A）G（T/A/C）C（G/T/A）。与对照组相比,在sox30免疫共沉淀物中共鉴定得到5,093个特异性Ch IP peaks,其中2,746个ChIP peaks定位在基因间隔区;1,738个和72个ChIP peaks分别定位于内含子和外显子区;537个Ch IP peaks定位于转录起始位点上游2.0 kb的启动子区,这537个峰对应

关键词：尼罗罗非鱼精子发生 sox30 功能调控机制

DBP应答因子sox30在睾丸生精细胞脱落中的作用及机制研究

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DBP应答因子Sox30在睾丸生精细胞脱落中的作用及机制研究

作者：周洋西西南大学

学位级别：硕士

研究背景:近年来,人类的预期寿命显著增加,但男性精液质量却呈不断下降趋势。环境暴露是引起精液质量下降的主要原因之一。已证实以邻苯二甲酸二丁酯(DBP)为代表的邻苯二甲酸酯类化合物具有明显的雄性生殖毒性,可导致睾丸生殖细胞凋亡... 详细信息

研究背景:近年来,人类的预期寿命显著增加,但男性精液质量却呈不断下降趋势。环境暴露是引起精液质量下降的主要原因之一。已证实以邻苯二甲酸二丁酯(DBP)为代表的邻苯二甲酸酯类化合物具有明显的雄性生殖毒性,可导致睾丸生殖细胞凋亡、睾酮合成紊乱、生精细胞脱落、精液质量下降等。在雄性生殖系统中,睾丸支持细胞对生精过程至关重要,作为DBP发挥生殖毒性的重要靶细胞之一,其结构和功能的异常可导致以生精细胞脱落为代表的生精过程异常,但具体的作用机制尚未完全清楚。支持细胞内主要的中间纤维是波形蛋白,处于正常聚合和解聚动态平衡状态的波形蛋白对于维持睾丸支持细胞的正常结构具有重要作用。我们前期研究发现:DBP暴露可通过诱导波形蛋白异常解聚从而使睾丸支持细胞失去结构支撑,进而向基底层塌陷并最终导致生精细胞脱落。通过对波形蛋白的调控进行生物信息学分析发现波形蛋白启动子区存在多个sox30的结合位点。sox30基因是1999年新发现的一个基因,是sox基因家族H亚族的仅有成员,目前已经证实sox30在睾丸发育中高表达并且对于生精过程是必须的,但是其在生殖发育中的具体作用及机制还不太清楚。同时前期通过组学筛选及分析发现sox30基因是DBP暴露的应答分子之一。因此,研究DBP应答基因sox30在生精细胞脱落中的作用及机制,可为探究环境暴露导致的男性精液质量持续下降提供新的实验证据。研究目的:进一步证实DBP应答基因sox30在生精细胞脱落中的作用;明确sox30调控生精细胞脱落的分子机制。研究方法:1.利用JASPAR网站对波形蛋白启动子区结合位点进行预测分析。在前期构建的DBP染毒大鼠原代睾丸支持细胞中利用q RT-PCR法及Western blotting法在m RNA以及蛋白水平检测sox30基因以及波形蛋白的表达。体外构建小鼠支持细胞株(TM4)细胞DBP染毒模型,采用免疫荧光法对DBP染毒后的TM4细胞骨架结构进行染色。探究DBP对支持细胞骨架系统以及sox30表达的影响。2.采用慢病毒载体在TM4细胞中构建sox30过表达模型以及si RNA技术构建sox30干扰TM4细胞模型。观察sox30差异表达后对TM4细胞形态的影响;利用q RT-PCR法和Western blotting法检测sox30差异表达后TM4细胞波形蛋白的表达水平、波形蛋白磷酸化水平,体外评价sox30对TM4细胞骨架关键分子波形蛋白的影响。3.基于sox30基因敲除小鼠模型,计算sox30(sox30野生型)、sox30(sox30杂合型)、sox30(sox30纯合缺失型)三种基因型小鼠的睾丸脏器指数;通过HE染色后光学显微镜观察比较不同基因型小鼠睾丸及附睾的病理形态,分析sox30敲除对睾丸曲细精管中支持细胞及各级生精细胞的影响;免疫荧光法检测和分析不同基因型小鼠睾丸支持细胞骨架结构;采用q RT-PCR和Western blotting法检测不同基因型小鼠睾丸组织中波形蛋白的表达水平和波形蛋白的磷酸化水平。在体内模型中评价sox30在支持细胞骨架系统维持中的作用以及对波形蛋白表达和磷酸化的影响,明确sox30敲除在生精细胞的脱落中的作用。4.通过NCBI(https://***)和UCSC(http://*** u/cgi-bin/hg Blat)寻找波形蛋白基因的启动子区,设计引物PCR扩增后克隆至荧光素酶报告载体,与sox30过表达载体/Vector及p RL-TK质粒共转染至TM4细胞,采用荧光素酶报告基因试剂盒检测荧光素酶活性变化,确定sox30是否能够调控波形蛋白启动子活性,明确sox30对波形蛋白的转录调控作用。5.在构建的sox30过表达细胞模型和sox30干扰细胞模型基础上,采用q RT-PCR和Western blotting法初步筛选出sox30调控波形蛋白磷酸化的关键中间分子;在此基础上,采用相关分子的激动剂和抑制剂对sox30过表达细胞或sox30干扰细胞进行处理,检测波形蛋白的表达、磷酸化水平以及波形蛋白骨架系统的恢复情况,体外确定参与sox30调控波形蛋白磷酸化的靶分子。另外,通过Western blotting法检测sox30、sox30、sox30三种基因型小鼠睾丸组织中相关靶分子的蛋白表达水平,在体内敲除小鼠模型中进一步探索哪些磷酸激酶在sox30诱导的波形蛋白的磷酸化中起关键作用。研究结果:***暴露可诱导支持细胞骨架系统解聚及sox30异常表达课题组前期研究结果表明DBP处理大鼠睾丸支持细胞后会导致波形蛋白骨架发生解聚且诱导生精细胞脱落,为了进一步探究其分子机制,我们利用JASPAR网站分析发现波形蛋白的启动子区存在多个sox30的结合位点,表明sox30可能参与支持细

关键词： sox30 邻苯二甲酸二丁酯睾丸支持细胞生精细胞波形蛋白