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杨树PLETHORA5基因调控次生壁沉积的分子机制研究

杨树PLETHORA5基因调控次生壁沉积的分子机制研究

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作者：刘帅西南大学

学位级别：硕士

树木的次生发育是木材形成的生物学基础,起始于维管形成层细胞的连续分裂。维管形成层向外侧分化为韧皮部,向内侧分化成木质部。木质部的成熟需经历一系列复杂的细胞学进程,包括细胞膨大、次生细胞壁沉积以及细胞的程序性死亡,最终形成... 详细信息

树木的次生发育是木材形成的生物学基础,起始于维管形成层细胞的连续分裂。维管形成层向外侧分化为韧皮部,向内侧分化成木质部。木质部的成熟需经历一系列复杂的细胞学进程,包括细胞膨大、次生细胞壁沉积以及细胞的程序性死亡,最终形成高度木质化的成熟木质部纤维和导管,即为木材。现有研究认为,由NAC和MYB家族转录因子构成的多级前反馈环是次生细胞壁生物合成调控网络的核心。其中,SECONDARY WALL-ASSOCIATED NAC DOMAIN PROTEIN(snd)/VASCULAR RELATED NAC DOMAIN(vnd)转录因子作为一级调控开关,调控下游一系列转录因子及次生壁生物合成相关基因的表达。但是,目前围绕snd/vnd上游调控的分子机制仍然是未知的。植物的生长发育广泛依赖于激素的调控,生长素是已知调控木材发育最重要的植物激素之一。杨树次生维管组织形成层区域较高浓度的生长素对维持形成层细胞活性,调节细胞分化等方面具有重要作用。当外施一定浓度生长素时,木质部细胞次生壁沉积会受到明显抑制,但其调控机制仍然是未知的。据文献报道,AP2/ERF转录因子家族的亚支AINTEGUMENTA-LIKE(AIL)/PLETHORA(PLT)转录因子家族,广泛参与调控植物生长发育过程。在模式植物拟南芥根尖发育的研究中已经证明,AIL/PLT转录因子处于生长素信号下游,具有与生长素一致的浓度梯度,对其下游基因的调控作用呈现浓度梯度依赖性。在杨树次生维管组织中,AIL/PLT基因家族成员ANT参与对维管形成层细胞分裂的调控并被认为是维管形成层的标记基因。但该家族成员对木质部发育尤其是次生壁沉积等方面的作用及其调控机制仍未见报道。杨树作为模式植物被广泛应用于树木次生发育的研究中。本研究以毛白杨为实验材料,通过对AIL/PLT家族基因进行基因功能分析,揭示其家族基因PLT5介导生长素信号调控下游snd/vnd基因表达进而影响木质部次生细胞壁沉积,进一步完善了生长素精细调控次生发育的调控网络。主要研究结果如下:(1)精确表征生长素在次生维管组织中含量的分布模式通过特异性抗体杂交对生长素在杨树次生维管组织中的含量分布模式进行精细检测。免疫荧光结果显示,生长素在次生维管组织中的形成层中大量累积,并且向两侧呈梯度递减模式。这与已有文献报道一致,暗示生长素在次生发育过程中具有重要调控作用。(2)筛选参与木材发育的AIL/PLT家族基因通过系统进化分析,在杨树中鉴定出13个AIL/PLT家族基因。组织表达分析显示,大多数AIL/PLT家族基因在根中具有较高水平的表达,仅ANT和PLT5在茎中表达量较高。利用Aspwood数据库对AIL/PLT家族基因在杨树次生维管组织中的表达模式进行分析,发现ANT和PLT5在维管形成层中具有较高水平的表达。进一步利用冰冻切片分离了野生型毛白杨次生维管的不同组织,并对各组织中ANT和PLT5的表达水平进行检测,发现PLT5的表达模式与生长素分布高度一致。(3)PLT5在维管形成层高表达,而其编码蛋白可移动至木质部通过构建PLT5启动子连接荧光报告基因(proPLT5-e YFP-TMC)的植物表达载体,经遗传转化后获得转基因杨树,用其表征PLT5在次生维管组织中的转录位置。经共聚焦激光扫描显微镜观察后发现PLT5在维管形成层区域高表达,与生长素高累积区域是一致的。同时利用转基因植株(proPLT5-PLT5-e YFP)观察PLT5蛋白定位,发现其蛋白定位在成熟木质部细胞,与其转录本表达位置存在差异,表明其蛋白可能存在移动。(4)PLT5受生长素信号直接调控构建了proPLT5-GUS的植物表达载体,瞬时转化烟草后进行生长素外源处理。GUS酶活检测结果表明,生长素诱导PLT5启动子对其下游基因的转录。外施生长素对野生型毛白杨进行处理,通过q PCR检测发现PLT5的表达水平显著上调。对内源增加生长素信号的转基因植株(ARF5.1-OE)进行q PCR检测,同样发现PLT5表达量显著上调。Effector-Reporter及Ch IP实验结果证明,PLT5被生长素信号响应因子ARF5直接调控。(5)PLT5参与介导生长素对次生维管组织发育的调控为了解析PLT5对杨树次生维管发育的生物学功能,构建了在维管形成层特异上调PLT5表达的转基因株系(pro WOX4-PLT5)。组织切片观察、间苯三酚染色及扫描电镜结果显示,在该转基因株系中木质部的次生壁沉积受到明显抑制,表明过表达PLT5对次生壁合成具有显著的抑制作用,这与生长素对次生壁合成的调控作用一致。同时发现木质部纤维细胞和导管细胞的发育也受到影响,说明PLT5过表达对木质部细胞发育过程也有调控作用。以上结果说明了PLT5介导了生长素对次生壁合成及次生维管组织发育的调控。(

关键词：生长素次生发育 AIL/PLT snd/vnd 次生壁合成

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