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基于PacBio smrt技术的婴幼儿配方奶粉微生物安全性评价

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中国食品学报 2019年第10期19卷 212-220页

作者：边燕飞席晓霞郑艺侯强川孙天松孙志宏内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室农业部奶制品加工重点实验室

目的:婴幼儿配方奶粉中的大量细菌已被灭活,然而灭活微生物仍影响产品品质和货架期。现行纯培养技术只能对食品基质中活菌进行检测,无法全面评估污染微生物组成,而基于宏基因组学策略能够对婴幼儿配方奶粉加工过程中污染微生物进行全面... 详细信息

目的:婴幼儿配方奶粉中的大量细菌已被灭活,然而灭活微生物仍影响产品品质和货架期。现行纯培养技术只能对食品基质中活菌进行检测,无法全面评估污染微生物组成,而基于宏基因组学策略能够对婴幼儿配方奶粉加工过程中污染微生物进行全面客观的评价。方法:采集6份婴幼儿配方奶粉,使用细菌纯培养、单分子实时测序技术(PacBio smrt)和微滴式数字PCR(ddPCR)联用技术对其污染微生物组成进行评价。结果:采用纯培养技术在样品中均未检测到大肠菌群、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、阪崎肠杆菌和芽孢。使用PacBio smrt测序技术,在婴幼儿配方奶粉中共鉴定出14个细菌门、138个细菌属和255个细菌种。其中6份样品均存在过嗜冷菌蜡样芽孢杆菌,其平均相对含量高达23.54%,这一灭活的细菌也会影响产品货架期。此外,在IF3、IF4、IF5和IF6样品中,检测到相对含量较低的致病菌大肠杆菌,其相对含量分别为0.06%,0.01%,0.15%和0.05%。采用ddPCR技术对smrt测序方法检测到的致病菌蜡样芽孢杆菌和大肠杆菌进行定量分析,发现每克奶粉样品中蜡样芽孢杆菌和大肠杆菌的平均拷贝数取对数后分别为5.45和4.89。结论:在6份婴幼儿配方奶粉中均未检出致病菌,符合食品安全国家标准,然而奶粉中被灭活的蜡样芽孢杆菌和大肠杆菌可能增加产品腐败的风险,影响产品的货架期。本研究结合多个技术全面评价婴幼儿配方奶粉的微生物污染情况,初步建立婴幼儿配方奶粉的微生物检测技术。

关键词：婴幼儿配方奶粉污染微生物纯培养 ddPCR PacBio smrt测序

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云南玉米穗腐病致病菌鉴定与共生群落分析

中国测试 2022年第2期48卷 56-65页

作者：吴畏田宇昂白宇汐梁琳悦余洋梁鹏宽蒋中华石海春柯永培孙群四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室四川成都610064 四川大学生命科学学院四川成都610064 四川省农业科学院国家农业微生物成都观测实验站四川成都610066 四川农业大学农学院四川温江611130

为鉴定云南玉米穗腐病主要致病菌、研究其共生真菌群落结构以及了解主要致病菌的流行特征,从云南采集病原样本进行分离纯化,对主要致病菌进行形态学鉴定和致病性测定;并对样本中真菌总DNA的rDNA-ITS序列进行smrt测序和生物信息学分析。... 详细信息

为鉴定云南玉米穗腐病主要致病菌、研究其共生真菌群落结构以及了解主要致病菌的流行特征,从云南采集病原样本进行分离纯化,对主要致病菌进行形态学鉴定和致病性测定;并对样本中真菌总DNA的rDNA-ITS序列进行smrt测序和生物信息学分析。最后依据从文献中收集的中国21个省份穗腐病致病菌的分离鉴定结果,利用空间插值分析推测主要致病菌在中国的分布。研究结果表明,云南玉米穗腐病主要致病菌为拟轮枝镰孢菌(Fusarium verticillioides),其共生真菌群落中弯曲单胞瓶霉(Phialemonium curvatum)、季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma caribbica)等稳定存在但在不同患病部位相对丰度不同;镰孢菌属不同的种在中国呈现一定的地域性分布。拟轮枝镰孢菌可能与少数共生真菌存在稳定的互利关系,其在云南的分布可能与玉米品种易感和现代物流导致的扩散有关。

关键词：致病菌鉴定分离鉴定 smrt测序空间插值分析玉米穗腐病拟轮枝镰孢菌微生物群落

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脊髓小脑性共济失调一家系分析

脊髓小脑性共济失调一家系分析

作者：邹金龙河南大学

学位级别：硕士

背景脊髓小脑性共济失调(Spinocerebellar ataxias,SCAs)是一组以共济失调为主要临床特征的常染色体显性遗传的神经退行性疾病,病变主要累及脊髓,小脑,也可累及脑干、丘脑、基底神经节、大脑皮层和周围神经等组织。脊髓小脑性共济失调36... 详细信息

背景脊髓小脑性共济失调(Spinocerebellar ataxias,SCAs)是一组以共济失调为主要临床特征的常染色体显性遗传的神经退行性疾病,病变主要累及脊髓,小脑,也可累及脑干、丘脑、基底神经节、大脑皮层和周围神经等组织。脊髓小脑性共济失调36型(spinocerebellar ataxias 36,SCA36)是在世界范围内较为罕见的SCA亚型,在中国大陆常染色体显性遗传性共济失调家系中占比约为1.6%,主要临床症状为共济失调、听力下降、构音障碍、运动神经元受累等,该病是由NOP56基因1号内含子区GGCCTG异常重复扩增导致,重复次数大于15次为异常,致病次数在650-3000次之间。目前,主要应用三引物聚合酶链式反应(Triplet repeat-primed Polymerase Chain Reaction,TP-PCR)筛查并联合Southern印记杂交技术(Southern blot)进行确诊,但上述方法都具有很大的局限性,比如,TP-PCR测序长度较短,无法获得致病序列的确切长度,而Southern blot工作量大,具有放射性,无法描述突变区域核苷酸序列构成。因此,我们探索新的测序方法解决上述问题。单分子实时测序技术(Single Molecule Real-Time sequencing,smrt)是基于Pac Bio公司平台的三代测序技术,具有长读长、高准确度、覆盖均匀、无PCR扩增、无GC偏好性的特点。由于该病发病率低,且诊断方法有限,因此对SCA36的临床特征描述和探索smrt测序技术在SCA36疾病的应用诊断诊断价值具有重要的意义。目的本研究收集整理一个河南汉族SCA36家系,描述该家系临床一般资料、神经电生理、影像学特征,并应用smrt测序技术检测并分析致病区域重复序列的碱基组成,在此基础上探讨基因型和表型的相关性,同时对有生育要求的家系成员进行遗传咨询,加深对SCA36的认识,为揭示该罕见病的遗传机制,诊断及治疗奠定基础。方法1.收集该家系先证者和部分家系成员的临床一般资料,绘制遗传家系图谱,完善体格检查,实验室生化检查,纯音测听和神经电生理检查。并进行相关量表评估,同时对该家系先证者和部分家系成员进行常规头颅磁共振平扫及弥散张量成像(diffusion tensor imaging,DTI)扫描,并募集6例与患者年龄相仿的体检者作为健康对照组进行DTI比较,观察家系成员小脑萎缩情况并基于DTI测量比对分析颅内多部位(小脑,胼胝体,皮质脊髓束,视辐射)的各项异性分数(fractional anisotropy,FA)值。2.对先证者及部分家系成员采集外周血,DNA提取,通过TP-PCR技术确定家系SCA类型。进一步对先证者进行人类全外显子组测序(Whole Exome Sequencing,WES),排除由外显子区域单碱基变异(single nucleotide variants,SNV),插入和删除(Insertions and Deletions,InDels)突变造成共济失调症状的可能。最后对先证者在内的3名患者进行smrt测序,并对测序数据进行质控和组装,得到不同类型的子读长(subreads)。重点分析跨过异常重复扩增区域的subreads,内容包括:异常重复区域的长度、GGCCTG重复次数、核苷酸基序(motif)序列分布和组成。结合患者的临床症状,探讨该家系基因型和表型的相关性。结果1.该家系患者共11人,二代中7人患病,发病年龄在42-50岁。该家系临床特点为晚发型共济失调,伴有运动神经元损伤、听力下降、构音障碍、情绪障碍和睡眠障碍。家系患者的神经电生理和纯音测听结果提示运动神经元损伤和以高频听阈为主的听力下降。头颅磁共振平扫和DTI提示:患者小脑萎缩,左侧小脑上脚和下脚的FA值降低。2.8名家系成员与SCA相关的TP-PCR检测结果提示:7名成员与SCA36相关的NOP56基因GGCCTG序列异常重复扩增,5名成员与SCA17相关的TBP基因CAG序列异常重复扩增,4名成员NOP56基因和TBP基因均有异常重复扩增,其中与SCA17相关的TBP基因CAG异常重复扩增次数为43次,处于不完全外显。先证者WES结果未发现与SCA相关的SNV和InDels。由于该家系典型症状和遗传模式与SCA17不符,临床初步诊断为SCA36家系。3.结合3名患者smrt测序数据与发病年龄,病程和共济失调等级量表评分(Scale for the Assessment and Rating of Ataxia,SARA),提示跨过异常重复扩增区域的subreads中扩增区域的平均长度、GGCCTG重复的平均次数与发病年龄成负相关趋势,与疾病进展成正相关趋势。4.通过对subreads重复区域内

关键词： SCA smrt测序 NOP56基因 GGCCTG 打断序列

基于PacBio RS Ⅱ和NGS的甘蓝型油菜可变剪接分析

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基于PacBio RS Ⅱ和NGS的甘蓝型油菜可变剪接分析

作者：袁佳兰华中农业大学

学位级别：硕士

可变剪接(Alternative Splicing,AS)过程发生在前体信使RNA向成熟信使RNA的转换过程中,通过使一个基因产生多种mRNA成熟体,能够显著地增加转录组和蛋白质组多样性。目前,科研人员已经使用高通量测序技术揭晓了模式生物中AS的含量及其复... 详细信息

可变剪接(Alternative Splicing,AS)过程发生在前体信使RNA向成熟信使RNA的转换过程中,通过使一个基因产生多种mRNA成熟体,能够显著地增加转录组和蛋白质组多样性。目前,科研人员已经使用高通量测序技术揭晓了模式生物中AS的含量及其复杂性。但是目前我们对于多倍体植物甘蓝型油菜中的可变剪接现象还知之甚少。本研究中,我们从甘蓝型油菜14个不同发育阶段/组织中提取高质量的RNA后,将这些RNA等量混合,使用Pacbio RSII测序系统对混合RNA样本进行单分子实时(Single Molecule Real-Time,smrt)测序和分析。来自混合样本的RNA被抽提后,构建不同长度的cDNA文库:1-2 kb、2-3 kb和3 kb以上,其中3 kb以上文库测2个smrt cell,其余2个文库各测3个smrt cell。另外,使用Illumina HiSeqTM 2000平台对甘蓝型油菜21个不同发育阶段/组织分别进行第二代测序(Next-generation sequencing,NGS),其中每个取样点2个生物学重复。我们结合smrt测序和NGS测序,在全基因组范围内对甘蓝型油菜中的可变剪接现象进行了鉴定及分析。本研究中得到的主要结果如下:(1)利用smrt测序技术,我们鉴定了 70,815个全长转录本,这些转录本覆盖了 20,898个注释编码基因。鉴定到1,360个新基因座和1,821个错误注释基因,进而更新了现有的甘蓝型油菜的基因注释。(2)同时,利用smrt和NGS测序一共鉴定了 71,889个注释基因,其中有39,908个(55.51%)多外显子基因发生了 AS现象,这些基因一共发生了 80,598个AS事件。在可变剪接不同类型中,内含子保留类型(Intronretention,IR)发生频率最高,占41.06%以上,可变受体端位点类型(17.67%)频率约是可变供体端位点类型(10.97%)的1.6倍,外显子互斥事件(1.73%)占比最低。(3)对甘蓝型油菜不同组织/发育时期进行AS分析,发现AS事件在不同组织/发育时期之间呈现出动态变化现象。对于相同组织类型,早期发育阶段的AS事件基本上要多于晚期发育阶段。例如,在叶子组织中,幼叶中的AS事件共计47,017个,显著高于子叶(37,722个)中;而在花蕾、种子和角果皮组织中,随着成熟度的增加可变剪接事件总数表现出先增加后减少的趋势。这种不均等分布可能与不同组织中表达的基因总数有关,并且AS基因比率(AS基因数/总表达基因数)在更年幼的组织中更高。(4)不同的AS类型具有不同的特征,这些特征可能有差异的影响各个AS类型。其中,本研究结果表明在甘蓝型油菜中,外显子数目的增加可以促进IR的频率;内含子长度的增加,外显子跳跃(Exon Skipping,ES)的比例会增加,IR的比例减少。另外一方面,随着基因表达水平的增加,IR事件呈现出降低趋势,ES事件发生频率显著增加。通过对多倍体植物甘蓝型油菜进行可变剪接分析,我们鉴定了大量的可变剪接事件,并且通过smrt测序得到的全长转录本序列更新了现有的甘蓝型油菜基因组注释,为不同异构体的后续功能研究提供丰富的数据资源,并且进一步增强了人们对多倍体植物中可变剪接的认识。

关键词：可变剪接 smrt测序 Illumina RNA-seq 甘蓝型油菜植物发育

原料乳中蜡样芽孢杆菌快速识别及耐药基因分布迁移研究

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原料乳中蜡样芽孢杆菌快速识别及耐药基因分布迁移研究

作者：梁丽姣南京财经大学

学位级别：硕士

本研究以五省份不同季节采样的原料乳作为研究对象，采用宏基因组测序技术，调查并分析不同产地、不同季节的原料乳中常见微生物的时空分布规律;结合选择性培养法和抗生素耐药表型验证，明确蜡样芽孢杆菌在原料乳中的污染及耐药情况;设... 详细信息

本研究以五省份不同季节采样的原料乳作为研究对象，采用宏基因组测序技术，调查并分析不同产地、不同季节的原料乳中常见微生物的时空分布规律;结合选择性培养法和抗生素耐药表型验证，明确蜡样芽孢杆菌在原料乳中的污染及耐药情况;设计特征性靶向基因，建立快速准确鉴定蜡样芽孢杆菌的分子检测方法;同时探究其携带耐药基因的可转移性。最终解决原料乳中细菌组成待明确，蜡样芽孢杆菌识别待精准的问题，同时探究这一细菌的潜在风险。为建立原料乳中耐药微生物的风险识别、风险评估和全程控制技术提供参考资料，为乳品行业生产高质量乳制品及防控耐药基因传播提供指导。研究结果包含如下三个部分：　　1.宏基因组学分析原料乳中的细菌多样性　　原料乳的质量是影响整个乳品加工链的关键因素，原料乳中细菌丰富度和多样性对其质量和安全均存在较大影响。本章节使用了PacificBiosciences公司(PacBio)开发的单分子实时(smrt)测序技术分析了五省份三采样季节的原料乳样品中种水平的细菌组成与多样性差异。Alpha与Beta多样性分析结果联合表明，不同地区、不同季节原料乳的细菌群落丰富度与群落分布多样性存在差异或显著性差异，但聚类结果出现明显重叠，表明微生物群落结构存在相似，未见明显特征细菌。在注释到的种水平细菌中，研究发现冷链运输距离与时间与魏氏假单胞菌的相对丰度呈正相关，表明该细菌的含量有望成为评价原料乳新鲜度的标准。此外，研究发现大部分样本中均注释到同为嗜冷菌与条件致病菌的蜡样芽孢杆菌，表明大部分原料乳有被蜡样芽孢杆菌污染的风险，乳品行业应加强对蜡样芽孢杆菌的检测与关注。　　2.原料乳中蜡样芽孢杆菌快速检测识别的qPCR方法开发　　本章节建立了原料乳中蜡样芽孢杆菌的荧光PCR检测方法，解决了乳制品中蜡样芽孢杆菌与芽孢杆菌属其他细菌区分难的问题，同时适用于纯芽孢的检测。通过构建目标基因gyrB的重组质粒以确定方法的拷贝数检出限与定量限，并通过制备模拟污染样品的方式确定了该方法的实际检出限。荧光PCR方法的拷贝数检出限低至2.57×104拷贝数/ml，定量范围在2.57×104至2.57×1011拷贝/ml，同时扩增效率良好，达94.0%。在模拟污染样品检验中，牛奶样品中低至200CFU/ml的细菌即可被检出。经过适用性验证，该方法适用于纯芽孢DNA的检测，可以满足乳品产业实际生产需求。　　3.原料乳中蜡样芽孢杆菌的分离鉴定及耐药基因的分布迁移研究　　本章节采用第二章建立的实时荧光PCR蜡样芽孢杆菌检测方法筛选蜡样芽孢杆菌的阳性污染样本并分离获取了乳源蜡样芽孢杆菌。依据耐药表型检测筛选的结果进行两组质粒接合实验探究耐四环素基因tetA与耐甲氧苄啶磺胺甲恶唑基因sul1的可转移性。结果表明四环素类抗生素耐药基因tetA不能通过质粒接合方式完成种内传播，而磺胺类抗生素耐药基因sul1能够通过质粒接合方式完成种内传播使接合子获得甲氧苄啶-磺胺甲恶唑耐药性，不同耐药基因的可转移性有所区别可能与不同抗生素的抑菌机理与细菌的耐药机理有关。本章节的研究揭示了乳源蜡样芽孢杆菌具有抗生素抗性基因转移风险，因蜡样芽孢杆菌在环境中广泛存在，且能产生耐高温的芽孢，乳品产业应当进一步加强对这一细菌的检测与控制，以降低蜡样芽孢杆菌耐药基因转移这一潜在安全风险。

关键词：原料乳 smrt测序蜡样芽孢杆菌 qPCR技术耐药基因转移嗜冷菌

胡萝卜果胶杆菌胡萝卜亚种全基因组三代测序及分析

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胡萝卜果胶杆菌胡萝卜亚种全基因组三代测序及分析

作者：卢天华河北科技大学

学位级别：硕士

植物细菌性软腐病是一类危害程度高且无有效生物防治手段的疾病,其主要致病菌之一胡萝卜果胶杆菌由于分布广泛和最具多样化而备受关注。本研究以胡萝卜果胶杆菌胡萝亚种PC1菌株为研究对象,首先应用smrt第三代测序技术对其进行全基因组测... 详细信息

植物细菌性软腐病是一类危害程度高且无有效生物防治手段的疾病,其主要致病菌之一胡萝卜果胶杆菌由于分布广泛和最具多样化而备受关注。本研究以胡萝卜果胶杆菌胡萝亚种PC1菌株为研究对象,首先应用smrt第三代测序技术对其进行全基因组测序,使用Pac Bio RS II测序仪获取的测序数据组装得到高质量且无间隔的PC1全基因组,序列全长为5 303 871 bp,GC含量为51.7%,包含1条完整的闭环染色体。以NCBI上PC1二代测序结果作为参考序列（NC＿012917.1）,调整确定PC1菌株序列起始位点,并进行参考基因组比对。下机数据甲基化分析结果显示PC1中主要存在三种m6A甲基化修饰。其次利用常规基因组注释流程对PC1基因组进行完整注释并绘制基因组圈图。基因组组分分析中,预测得到5 060个CDS、78个t RNA、22个r RNA及48个串联重复序列。与6大数据库（NR、Swiss-Prot、Pfam、Egg NOG、GO和KEGG）进行基因组基础比对和功能注释。可移动元件分析预测到17个基因组岛、3个前噬菌体和9个CRISPR-Cas区域。代谢系统分析中,获得144个碳水化合物活性酶相关基因信息及5组次级代谢产物合成基因簇。致病系统分析预测到575个毒力因子基因、304个耐药基因、774个病原基因、7种分泌系统、422个分泌蛋白、1 103个转运蛋白、1 109个跨膜蛋白及22对双组分调控系统信息。此外,与参考基因组比对过程中出现的3个gap中包含的编码基因中存在:6个基因组岛、1个前噬菌体、7个碳水化合物酶相关基因、18个毒力基因、5个耐药基因、15个病原体与宿主互作相关基因、2组不同类型的分泌系统基因及1对双组分调控系统。最后从亚种及种水平选取六株近缘菌,从多方面对PC1进行比较基因组分析。平均核苷酸一致性（ANI）分析结果显示PC1与同亚种的BP201601.1之间的ANI值最高,亲缘关系最接近。基于ANI值结果绘制进化分类树,显示四株胡萝卜果胶杆菌被归到同一簇中。共线性比对结果显示在亚种水平上PC1基因组与其他亚种的共线性较好,与同亚种的BP201601.1共线性差异最小,整体基因组排布最相似。从两种水平分别进行基因家族聚类分析,并绘制可视化视图,其中PC1在两种水平上特有的基因家族均为28个。关键致病基因分析统计得到三类细胞壁降解酶相关基因,其中编码果胶酶功能的基因19个,编码纤维素酶类合成的基因25个,编码蛋白酶合成的基因22个,细胞壁降解酶类相关基因在果胶杆菌属中均高度保守。本文应用多种生物信息学分析手段对PC1基因组进行了完整的全基因组注释,其中二代注释中未涉及的重要功能基因及比较基因组分析获得的特有基因、关键致病基因可作为后续试验分析的重点研究对象。本研究为胡萝卜果胶杆菌研究者提供了序列拼接及基因组注释参考,也为专一性软腐病生物防治杀菌剂的开发和研究提供了理论基础。

关键词：细菌性软腐病胡萝卜果胶杆菌胡萝卜亚种PC1 smrt测序全基因组注释生物信息学分析

CMS-D2育性恢复基因Rf1候选基因筛选与功能分析

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CMS-D2育性恢复基因Rf1候选基因筛选与功能分析

作者：李婷郑州大学

学位级别：硕士

棉花是一种重要的纤维和油料作物。棉花杂种优势利用是增产的重要途径。在生产实践中,棉花理想杂交制种方式是三系杂交。培育强优势不育三系杂交种的关键是创制优良的恢复系,因此围绕恢复基因开展相关应用基础研究显得尤为重要。哈克尼... 详细信息

棉花是一种重要的纤维和油料作物。棉花杂种优势利用是增产的重要途径。在生产实践中,棉花理想杂交制种方式是三系杂交。培育强优势不育三系杂交种的关键是创制优良的恢复系,因此围绕恢复基因开展相关应用基础研究显得尤为重要。哈克尼西棉细胞质雄性不育(CMS-D2)是棉花主要的细胞质雄性不育之一。然而,CMS-D2恢复基因Rf至今没有被分离克隆成功,Rf和CMS-D2胞质的互作机制仍不清楚。本研究利用Pac Bio单分子实时测序技术获得CMS-D2恢复系(R)花药的全长转录本,结合“三系”材料和杂交种(F)的Illumina RNA测序数据,以及课题前期研究Rf位于Chr＿D05上,进一步筛选Rf候选基因,并进行结构分析与初步功能验证。取得的主要研究结果如下:1.共获得44,338个基因位点的107,066个转录本,包括10,086个新基因的转录本和66,419个已知基因的新转录本。共鉴定到56,572个选择性剪接(AS)事件、1,146个lnc RNA、61个融合转录本、10,466个具有可选择性多聚腺苷酸化(APA)位点的基因以及60,995个具有预测开放阅读框(ORF)的新转录本。此外,还有819个Full-length Non-chimeric(FLNC)reads没有被定位到TM-1参考基因组。这些结果为陆地棉基因组注释和转录组研究提供了丰富的数据资源。2.基于不育系(A)、保持系(B)和恢复系(R)花药Illumina RNA测序数据,对所有表达基因进行以下3个比较组分析:A与B、R与B、R与A,分别鉴定到1,295个、1,721个和837个差异表达基因(DEGs)。对DEGs进行GO和KEGG富集分析发现,“binding”是在所有比较组中富集比率最高的GO分类。A与B、R与B比较组中DEGs在“Cutin,suberine and wax biosynthesis”KEGG通路均显著富集;R与A比较组中DEGs在“Circadian rhythm-plant”KEGG通路显著富集。3.筛选在R中特异表达、而在A和B中几乎不表达的DEGs,包括在D05及其同源的A05染色体、Scaffold以及未比对到TM-1参考基因组上的FLNC Reads。对6个可能是恢复基因的候选基因进行荧光定量PCR验证,结果显示Gh CCS772和Gh CCS61在R中的表达量均极显著高于A和B。进一步分析发现,这2个基因在F中的表达量也显著高于A,且在R中的表达量大约是F的两倍。此外,在CMS-D2“三系”材料花药以及R不同组织中进行表达模式分析,发现Gh CCS772和Gh CCS61在R不同组织中均特异性高表达,尤其在花药中表达量最高,说明这2个候选基因可能是恢复基因。4.采用RACE技术获得了Gh CCS772和Gh CCS61的全长转录本,然后对其进行初步预测分析。利用病毒诱导基因沉默(VIGS)技术沉默这2个基因,发现阳性植株均呈现出目的基因表达水平降低;除了少数株系沉默效率高以外,总体上其他株系沉默效率较低,这可能是沉默效率不相同所致。花粉活力测定实验发现,大部分阳性株的花粉生活力有所下降,但差异不显著。此外,观察到部分阳性株花药发育出现了花药不开裂等异常表型。说明这2个候选基因可能是潜在的CMS育性恢复基因或与花药发育相关的基因。

关键词：哈克尼西棉细胞质雄性不育 smrt测序全长转录组差异表达基因恢复基因

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单分子实时测序技术的原理与应用

单分子实时测序技术的原理与应用