检索结果-南通市图书馆

中国神经科学学会第四次会员代表大会暨第八届全国学术会议

作者： Jing LI,Xian-Hua CHEN~*,Shu-Jing LI,Ping XU State Key Laboratory of Medical Neurobiology and Laboratory of Genomic Physiology,Institute of Brain Science, Fudan University,Shanghai 200032,China

＜正＞ZNF265-1,a member of the newly identified arginine/serinerich（SR） protein ZNF265,has been shown by our previous studies to regulate the splicing of Tra2beta *** major spliced isoform of the Tra2beta gene,Tra2betal,also encodes a pre-mRNA splicing ***,we demonstrate that two ZNF-265 transcript isoforms（ZNF265-1 and ZNF265- 2） are expressed in various mouse tissues and that ZNF265-1 is a major *** expression of ZNF265-1 in the cerebral cortex is significantly lower in relative to other tissues,which is opposite to the higher expression of Tra2betal in neural *** recombinant proteins of both ZNF265 isoforms are nuclear,in consistent with their functions as pre-mRNA splicing *** analysis with the minigenes of GluR-B（Glutamate receptor-B gene） and smn2（spinal cord motoneural survival gene） demonstrates that ZNF265-1 inhibits the Flop exon and exon 7 usages in the splicing of two minigenes,respectively,which is opposite to the effects of *** results indicate that the ZNF265-1 and Tra2betal regulate the pre-mRNA splicing of GluR-B and smn2 in opposite patterns.

关键词： ZNF265 Tra2beta pre-mRNA splicing opposite GluR-B smn2

来源： cnki会议评论

在线全文

cnki会议

学校读者我要写书评

暂无评论

SMA小鼠中相关剪接因子表达与smn2外显子7列入比率关系研究

引用

中国比较医学杂志 2020年第5期30卷 54-63页

作者：杜利莉马钰柏文清吴刘成邵义祥南通大学神经再生重点实验室江苏南通226001 南通大学实验动物中心江苏南通226001 南通大学杏林学院江苏南通226001

目的研究smn2外显子7在SMA小鼠不同组织的列入,筛选与其相关的剪接因子。方法通过RT-PCR和非变性PAGE电泳分析在神经及非神经组织中smn2外显子7列入比例,通过QPCR筛选分析剪接因子在大脑和脊髓与非神经组织中的mRNA水平。结果smn2外显子... 详细信息

目的研究smn2外显子7在SMA小鼠不同组织的列入,筛选与其相关的剪接因子。方法通过RT-PCR和非变性PAGE电泳分析在神经及非神经组织中smn2外显子7列入比例,通过QPCR筛选分析剪接因子在大脑和脊髓与非神经组织中的mRNA水平。结果smn2外显子7在大脑和脊髓组织中列入比例显著高于非神经组织,QPCR筛选显示Nova1/2在大脑和脊髓中的表达显著高于大部分非神经组织。通过差异分析显示,Srsf7/9及Nova2在SMAⅠ型小鼠脊髓中的表达显著高于对照小鼠。结论神经组织中,Srsf7/9和Nova1/2基因高表达与smn2外显子7列入比例显著提高呈正相关,剪接因子SRSF7/9及NOVA1/2可能参与smn2基因的剪接调控。

关键词： SMA小鼠剪接因子表达 smn2 外显子列入

来源：

维普期刊数据库

同方期刊数据库评论

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

脊髓性肌萎缩症相关基因smn2剪接调控序列的研究

脊髓性肌萎缩症相关基因SMN2剪接调控序列的研究

引用

作者：高园苏州大学

学位级别：硕士

背景和目的:RNA剪接是真核生物基因转录后加工的关键步骤,剪接体通过识别剪接信号切除内含子形成成熟的mRNA。剪接信号除了 5’剪接位点、3’剪接位点及分支点序列外,还存在辅助性的剪接调控元件(splicing regulatory elements,SREs)等... 详细信息

背景和目的:RNA剪接是真核生物基因转录后加工的关键步骤,剪接体通过识别剪接信号切除内含子形成成熟的mRNA。剪接信号除了 5’剪接位点、3’剪接位点及分支点序列外,还存在辅助性的剪接调控元件(splicing regulatory elements,SREs)等剪接信号。研究表明人类95%以上的基因在剪接过程中会通过识别不同的剪接信号发生可变剪接,得到多个转录本,因此剪接信号在RNA可变剪接调控中具有重要的作用。RNA结合蛋白通常特异性的识别3-7个碱基序列,这为系统性研究SREs提供了可能性,但至今还没有这方面工作的报道。我们以脊髓性肌萎缩症相关基因smn2为模型,构建一个连续5碱基RNA序列库,系统研究1024个不同的5碱基RNA序列对smn2外显子7剪接调控的影响,分析发现新的SREs,并寻找与SREs相互作用的RNA结合蛋白,探索在RNA可变剪接过程中SREs发挥作用的机制。本课题不仅为研究RNA可变剪接提供新的分子机制而且可以为设计RNA为靶点的基因治疗药物提供理论依据。方法:以脊髓性肌萎缩症(spinal muscular atrophy,SMA)相关基因smn2为研究模型,采用两步突变法在smn2 minigene内含子7的核苷酸第11位到15位区域进行5碱基全序列突变,构建完整45个序列组合(即1024个)的5碱基序列库。接着将1024个质粒转染HEK293细胞检测5碱基序列库中各序列对smn2剪接的影响,利用荧光RT-PCR测定外显子7的列入百分比。之后采用生物信息学基因集富集分析法鉴定出最强的20个抑制性和促进性的3-4碱基的剪接调控元件,同时根据5碱基序列对剪接调控的影响并结合其两侧序列确定出多个新的强剪接调控元件。最后在smn2和其它基因背景下对新发现的剪接调控元件作初步特征分析。结果:首先构建了国际上第一个系统性研究RNA可变剪接调控的完整的5碱基序列库。其次在HEK293细胞里,分析了 1024个序列对smn2外显子7列入的调控作用,获得大量调控可变剪接的序列信息,包含多个尚未报道过的SREs,其中部分SREs的调控作用依赖5碱基两侧的序列。我们对其中两个强SREs(GCACC和GCAAACCTT)进行了初步特征分析,它们不仅能在不同位置强烈抑制smn2外显子7的列入,也能改变MAPT、PDCD1基因的剪接模式,表明是具有共性的SREs。而且验证了 Poly-C和Poly-T的长度及其在不同位置对剪接调控的作用,但存在差异。同时,我们还证实了一个远距离RNA-RNA相互作用阻碍U1 RNA与5’剪接位点的结合从而抑制smn2外显子7的列入,碱基配对数增加使其结构更加稳定,能增强抑制效果。最后,根据对数据库的分析,发现RBFOX1的核心结合序列UGCAUG如果后面连接C能够明显促进smn2外显子7的列入,提示UGCAUGC可能是RBFOX1的最优结合序列。对各种SREs作用机制特别是其特异性结合蛋白的鉴定正在进行之中。我们的RNA剪接调控数据库包含有大量的剪接相关信息,可为后人研究可变剪接调控机制提供重要的信息资源。结论:建立了一个系统完整的RNA剪接调控序列库,分析了所有1024个5碱基序列组合对smn2外显子7剪接的影响,发现了大量新的SREs。其中两个强抑制性序列GCACC和GCAAACCTT可以在多种基因调节RNA可变剪接,是具有普遍性的剪接调控元件,而促进性的剪接调控元件Poly-C和Poly-T在长度依赖性和位置效应方面具有明显差异。我们的数据库还对前人提出的剪接调控假说进行了验证并对部分已知SREs序列进行了优化。

关键词：可变剪接 smn2 剪接调控元件 RNA结合蛋白 5碱基序列库

来源：

同方学位论文库评论

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

TaC9-ABE系统介导的修复人smn2基因的研究

TaC9-ABE系统介导的修复人SMN2基因的研究

引用

作者：彭晓华五邑大学

学位级别：硕士

脊髓性肌萎缩症(SMA)是一种常染色体隐性疾病,主要表现为肌萎缩和进行性肌无力。SMA患者将逐渐丧失运动能力,进而影响呼吸和吞咽,最终导致死亡,是婴幼儿最常见的致死性单基因遗传病。人群携带率高达1/50,在我国新生儿的患病率为1/10000... 详细信息

脊髓性肌萎缩症(SMA)是一种常染色体隐性疾病,主要表现为肌萎缩和进行性肌无力。SMA患者将逐渐丧失运动能力,进而影响呼吸和吞咽,最终导致死亡,是婴幼儿最常见的致死性单基因遗传病。人群携带率高达1/50,在我国新生儿的患病率为1/10000左右。有98%的SMA患者是由于运动神经元生存基因1(smn1)纯合缺失导致功能性全长smn(smn-FL)蛋白的缺乏引起的。人体内存在与smn1基因高度同源的smn2基因,它与smn1的主要区别在于第7外显子的第6位由C·G转变为T·A,使第7外显子内的外显子剪接增强子转变为外显子剪接沉默子。因此,smn2基因的表达产物多是不含外显子7的易降解截断型转录本,直接影响到运动神经元的逐步萎缩和死亡。尽管目前已有多种针对SMA的治疗方法,包括小分子化合物治疗、反义核酸治疗、干细胞治疗、基因治疗以及神经和肌肉的保护疗法等,主要目标都是通过提高内源全长smn2蛋白表达量或转入外源smn1基因,保障运动神经元表达足量的全长smn蛋白,维持运动神经元活性。但这些方法分别存在时效性、可操作性、安全性和有效性等缺陷,难以彻底治愈SMA。近年来,基因编辑技术可实现直接修复内源smn2基因7号外显子上第6位碱基T到C的转换,实现smn蛋白正常表达,保障运动神经元正常存活和发挥功能。但目前的基因编辑治疗方案对7号外显子第6位碱基的编辑效率太低且具有脱靶编辑的可能,为SMA疾病的治疗带来安全隐患。本课题首次将TaC9-ABE系统应用于SMA的治疗。TaC9-ABE系统是一种双向导基因编辑器,包括表达类转录激活效应器(transcription activator-like effector,TALE),腺苷脱氨酶,sgRNA和nCas9蛋白。该系统具有安全、高效、编辑窗口宽等优势,可有效利用双重AAV实现基因治疗。本课题利用TaC9-ABE系统首先分别在HEK293T细胞中成功筛选出高效编辑人类smn2基因外显子7的组合(TaC9-F4),编辑效率可达70%以上,远高于常规ABE编辑效果。进一步在U2OS和Hela细胞上也证实其基因编辑效果的可重复性。本课题还构建了多株smn1基因突变的人类诱导多能干细胞系(SMA-iPSC),用以模拟SMA病人来源iPSC。TaC9-ABE系统可在SMA-iPSC中实现高效精确修复smn2基因(T6C),并且在可能的10个脱靶位点均未检测到基因编辑。基因修复的SMA-iPSC在干细胞形态、多能性状态和核型等特征与正常干细胞一致且smn2的7号外显子转录本含量增加。将SC-SMA-iPSC分化为运动神经元后进一步检测发现smn全长蛋白含量也有所提高,说明TaC9-ABE系统可安全有效地实现smn2基因修复。综上所述,本课题首次利用TaC9-ABE系统建立了一套高效安全和精确的smn2基因修复策略,并在iPSC上验证了其安全性和有效性。未来可进一步在小鼠或大动物SMA模型上进行碱基编辑纠正smn2基因,为人类SMA疾病的治疗提供一个新型的安全高效和一劳永逸的解决方案。

关键词：脊髓性肌肉萎缩症 smn1 smn2 SMA-iPSC TaC9-ABE系统

来源：

同方学位论文库评论

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

SMA小鼠中相关剪接因子表达与smn2外显子7列入比率关系研究

SMA小鼠中相关剪接因子表达与SMN2外显子7列入比率关系研究

引用

第十五届中国实验动物科学年会

作者：杜利莉马钰柏文清吴刘成邵义祥南通大学神经再生重点实验室南通大学实验动物中心

目的研究smn2外显子7在SMA小鼠不同组织的列入,筛选与其相关的剪接因子。方法通过RT-PCR和非变性PAGE电泳分析在中枢和外周组织中分析smn2外显子7列入比例,通过QPCR筛选分析剪接因子在大脑和脊髓与外周组织的m RNA水平。结果 smn2外显子... 详细信息

目的研究smn2外显子7在SMA小鼠不同组织的列入,筛选与其相关的剪接因子。方法通过RT-PCR和非变性PAGE电泳分析在中枢和外周组织中分析smn2外显子7列入比例,通过QPCR筛选分析剪接因子在大脑和脊髓与外周组织的m RNA水平。结果 smn2外显子7在大脑和脊髓组织中列入比例显著高于外周组织,QPCR筛选显示剪接因子NOVA1/2在大脑和脊髓中的表达显著高于大部分外周组织。通过差异分析显示,NOVA1在SMAⅠ型小鼠脊髓中的表达显著高于对照小鼠。结论在中枢神经系统中,SRSF7/9和NOVA基因高表达与smn2外显子7列入比例显著提高呈正相关,其可能参与smn2基因的剪切调控。

关键词： SMA小鼠剪接因子表达 smn2 外显子列入

来源： cnki会议评论

在线全文

cnki会议

学校读者我要写书评

暂无评论

Disruption of splicing-regulatory elements using CRISPR/Cas9 to rescue spinal muscular atrophy in human iPSCs and mice

引用

National Science Review 2020年第1期7卷 92-101页

作者： Jin-Jing Li Xiang Lin Cheng Tang Ying-Qian Lu Xinde Hu Erwei Zuo He Li Wenqin Ying Yidi Sun Lu-Lu Lai Hai-Zhu Chen Xin-Xin Guo Qi-Jie Zhang Shuang Wu Changyang Zhou Xiaowen Shen Qifang Wang Min-Ting Lin Li-Xiang Ma Ning Wang Adrian R.Krainer Linyu Shi Hui Yang Wan-Jin Chen Department of Neurology and Institute of Neurology The First Affiliated Hospital of Fujian Medical University Fujian Key Laboratory of Molecular Neurology Fujian Medical University Institute of Neuroscience State Key Laboratory of Neuroscience Key Laboratory of Primate Neurobiology CAS Center for Excellence in Brain Science and Intelligence Technology Shanghai Institutes for Biological Sciences Chinese Academy of Sciences Key Lab of Computational Biology CAS-MPG Partner Institute for Computational Biology Shanghai Institutes for Biological Sciences Chinese Academy of Sciences Department of Anatomy Histology & Embryology Shanghai Medical College Fudan University Cold Spring Harbor Laboratory Cold Spring Harbor

We here report a genome-editing strategy to correct spinal muscular atrophy(SMA). Rather than directly targeting the pathogenic exonic mutations, our strategy employed Cas9 and guide-sg RNA for the targeted disruption of intronic splicing-regulatory elements. We disrupted intronic splicing silencers(ISSs, including ISS-N1 and ISS + 100) of survival motor neuron(smn) 2, a key modifier gene of SMA, to enhance exon 7 inclusion and full-length smn expression in SMA iPSCs. Survival of splicing-corrected iPSC-derived motor neurons was rescued with smn restoration. Furthermore, co-injection of Cas9 mRNA from Streptococcus pyogenes(SpCas9) or Cas9 from Staphylococcus aureus(SaCas9) alongside their corresponding sgRNAs targeting ISS-N1 into zygotes rescued 56% and 100% of severe SMA transgenic mice(smn-/-, smn2tg/-).The median survival of the resulting mice was extended to >400 days. Collectively, our study provides proof-of-principle for a new strategy to therapeutically intervene in SMA and other RNA-splicing-related diseases.

关键词： spinal muscular atrophy smn2 splicing-regulatory elements CRISPR/Cas9 germline correction

来源：

同方期刊数据库评论

在线全文

同方期刊数据库

学校读者我要写书评

暂无评论

Rapid genetic diagnosis and prenatal diagnosis of spinal muscular atrophy by denaturing high-performance liquid chromatography

引用

Chinese Medical Journal 2006年第14期119卷 1222-1225页

作者： ZHU Hai-yan WU Ling-qian PAN Qian TANG Bei-sha LIANG De-sheng LONG Zhi-gao DAI He-ping XIA Kun XIA Jia-hui National Laboratory of Medical Genetics Xiangya Hospital Central South University Changsha 410078 China Department of Neurology Xiangya Hospital Central South University Changsha 410078 China

Spinal muscular atrophy （SMA） is a common Pautosomal recessive neuromuscular disorder （1in 6000 to 10 000 births） caused by mutations in the smn1 gene at 5q13. More than 90%-98% of SMA patients show homozygous deletion of smn1, which has proved to be useful in the diagnosis of SMA. But it is hampered because of the existence of a highly homologous gene, smn2. Based on nucleotide mismatches between smn1 and smn2, the following two DNA tests are usually performed： single-strand conformational polymorphism （SSCP） and polymerase chain reaction （PCR） followed by a restriction enzyme *** this study we developed a new method for rapid genetic diagnosis of SMA by denaturing high-performance liquid chromatography （DHPLC）, which is based on different retention of homoduplexes and heteroduplexes in detecting the homozygous deletion of smn1. Both genetic and prenatal diagnoses were performed successfully for a SMA family by DHPLC, which was confirmed as a rapid and effective technique for detecting the deletion of smn1.

关键词： spinal muscular atrophy SMA smn1 smn2 DHPLC, gene diagnosis prenatal diagnosis

来源：

维普期刊数据库

同方期刊数据库评论

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

1000 sample comparison of MLPA and RT-PCR for carrier detection and diagnostic testing for Spinal Muscular Atrophy Type 1

引用

Open Journal of Genetics 2013年第2期3卷 111-114页

作者： Charles M. Strom Ben Anderson Mei Peng Urjit Patel Corey D. Braastad Weimin Sun 1Quest Diagnostics Nichols Institute San Juan Capistrano USA 2Athena Diagnostics Worcester USA

Purpose: To compare the accuracy of a commercially available MLPA kit with a laboratory developed RT-PCR assay for the detection of smn1 and smn2 copy numbers in clinical samples. Methods: We developed and validated a laboratory developed real time PCR based test capable of detecting smn1 and smn2 copy numbers in individuals. We also validated an MLPA kit purchased from MRC Holland for the same purpose. We then analyzed a series of 1027 anonymized samples using both technologies. When discrepant results were obtained, each sample was re-analyzed at least twice using both platforms. Results: Five samples did not yield results in either assay. For smn1 copy number analysis, 2 RT-PCR assays revealed indeterminant results and all 1020 other samples were concordant for smn1 copy number. There were 9 discrepancies in smn2 copy number determination mostly due to a variability in MLPA analysis. Conclusion: Both MLPA and RTPCR assays give a reliable estimate of smn1 copy number and are therefore appropriate for population based carrier screening for Spinal Muscular Atrophy Type 1. The MLPA kit has a low incidence (smn2 copy number by 1 copy, but this inconsistency is of little clinical significance and can be overcome by replicate testing.

关键词： Spinal Muscular Atrophy Carrier Screening smn1 smn2 MLPA

来源：

维普期刊数据库评论

在线全文

维普期刊数据库

学校读者我要写书评

暂无评论

短内含子剪接调控元件的系统性特征分析

短内含子剪接调控元件的系统性特征分析

引用

作者：杨阳苏州大学

学位级别：硕士

背景与目的:前体信使RNA(pre-mRNA)剪接是去除内含子,将外显子连接的过程,是真核基因表达转录后水平调控的重要环节。人类基因组中,大多数内含子的平均长度是外显子的10倍以上。剪接依赖于剪接体从成千上万的内含子核苷酸中正确识别外... 详细信息

背景与目的:前体信使RNA(pre-mRNA)剪接是去除内含子,将外显子连接的过程,是真核基因表达转录后水平调控的重要环节。人类基因组中,大多数内含子的平均长度是外显子的10倍以上。剪接依赖于剪接体从成千上万的内含子核苷酸中正确识别外显子。外显子主要由4种核心剪接信号定义,包括5’剪接位点(5’splice site,5’ss)、3’剪接位点(3’splice site,3’ss)、分支点序列和多嘧啶区(PPT)。除此之外,还需要剪接调控元件(splicing regulatory elements,SRE)作为辅助性元件。剪接调控元件为位于外显子的剪接增强子或沉默子(exonic splicing enhancer/silencer,ESE/ESS),位于内含子的剪接增强子或沉默子(intronic splicing enhancer/silencer,ISE/ISS)。RNA结合蛋白(RBP)作为剪接调控因子与SRE结合促进或抑制剪接位点的识别。SRE通常是短序列,发生突变或与之结合的RBP失调,会产生剪接异常并导致疾病。然而,迄今为止,关于SRE序列及其如何调节剪接的知识仍然有限。方法:以运动神经元生存2(survival of motor neuron 2,smn2)小基因(minigene)为研究模型,在内含子7的5’SS下游的第11-15位进行突变,构建一个完整的五聚体序列库,该库包含该突变位置的5个核苷酸的所有组合。将获得的1023个五碱基突变体和野生型小基因(WT smn2)转染到HEK293细胞中,用荧光标记的半定量RT-RCR方法和非变性PAGE胶检测各五聚体序列对外显子7剪接的影响。利用了基序集富集分析(MSEA)方法,对数据库分析,从中识别出了对smn2外显子7列入具有促进性和抑制性的SRE基序。最后在smn1/2和MAPT小基因中验证得到的SRE对剪接的影响。结果:根据ΔPSI值(PSI:外显子7的列入率,ΔPSI:突变体的PSI与WT的PSI之差),从五聚体序列库中得到584个对smn2外显子7列入具有促进性的五聚体和230个对smn2外显子7列入具有抑制性的五聚体。从位置依赖分析和非位置依赖分析这两个层面,采用MSEA方法,富集到四类促进性基序包括U-rich,C-rich,CG-core和RBFOX相关序列,以及四类抑制性基序包括AG-core,UG-type,GCWCC-type和GAC-core。将 U-rich,C-rich,CG-core,UG-type,GCWCC-type分别在smn1/2或MAPT小基因中验证。U-rich,C-rich都明显促进外显子7列入,且随着U-rich和C-rich序列的延长,促进外显子7列入的作用越强。CG的三重复序列(CGCGCG)在smn2小基因中明显促进外显子7列入,在MAPT小基因中明显抑制外显子10列入。GCWCC在smn2小基因和MAPT小基因中都强烈抑制盒式外显子列入。UG-type基序抑制外显子7列入的剪接效应存在两种机制,即二级结构干扰和自身序列携带的抑制信号。结论:五聚体库所有序列由ΔPSI值分析可分为smn2外显子7促进性和抑制性两种类别序列,再结合MSEA分析,从五聚体序列库富集到具有smn2外显子7促进性和抑制性的3聚体(3-mer)或4聚体(4-mer),我们发现了短序列中存在以下关键 SRE:U-rich,C-rich,CG-core 和 RBFOX 相关序列为强 ISE,而 AG-core,UG-type,GCWCC-type,和GAC-core为强ISS。从五聚体序列库中获得大量的剪接调控元件数据,对理解短RNA序列如何调控剪接具有重要的理论价值,同时可以作为一种宝贵的资源为其他复杂的剪接调控机制提供解释。在此基础上,可以进一步探索新发现的SRE在特定基因表达中的作用,以阐明其作用机理和生物学意义。

关键词：五聚体库 smn2 MSEA 剪接调控元件促进性基序抑制性基序

来源：

同方学位论文库评论

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

欢迎您,

建议与咨询留下您的常用邮箱和电话号码，以便我们向您反馈解决方案和替代方法

时间限定

文献类型

馆藏选择

核心期刊

语言

文献类型

帮助

文字说明：

检索规则说明：

检索范例：

分类表

所选分类

限定检索结果

文献类型

馆藏范围

日期分布

学科分类号

主题

机构

作者

语言

在线全文

在线全文

在线全文

在线全文

在线全文

在线全文

在线全文

在线全文

在线全文

请选择保存的检索档案：

请选择收藏分类：

通借通还

欢迎您,

建议与咨询 留下您的常用邮箱和电话号码，以便我们向您反馈解决方案和替代方法

时间限定

文献类型

馆藏选择

核心期刊

语言

文献类型

帮助

文字说明：

检索规则说明：

检索范例：

分类表

所选分类

限定检索结果

文献类型

馆藏范围

日期分布

学科分类号

主题

机构

作者

语言

在线全文

在线全文

在线全文

在线全文

在线全文

在线全文

在线全文

在线全文

在线全文

请选择保存的检索档案： 新增检索档案 确定 取消

请选择收藏分类： 新增自定义分类 确定 取消

通借通还

建议与咨询留下您的常用邮箱和电话号码，以便我们向您反馈解决方案和替代方法

请选择保存的检索档案：

请选择收藏分类：